液相色譜的分別機(jī)理及色譜柱選HPLC參數(shù)時(shí)的基本考慮溶解度-選擇流淌相的條件分子量-在樣品預(yù)處理或GPC分析時(shí)有用樣品的基質(zhì)-考慮如何前處理在基質(zhì)中樣品的含量檢測(cè)特性-有否紫外吸取?熒光?找出樣品中不同組份之間的差異摸索條件的重要線索極性問題液相色譜的分別機(jī)理正相反相體積解除離子交換其他不同的分別模式是不同的機(jī)理吸附色譜的分別機(jī)理隨著樣品在固定相上的吸附實(shí)力由大到小在色譜柱上的保留由長(zhǎng)到短吸附色譜概述分別基于樣品的極性差異。洗脫次序∶一般為正相，即：極性低的先被洗脫常用的流淌相∶非極性有機(jī)溶劑，如己烷乙酸等為添加劑常用固定相∶硅膠、氧化鋁等。支配色譜的分別機(jī)理支配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分別洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流淌相：有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水應(yīng)用添加劑，成為離子對(duì)、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)反相色譜固定相多為鍵合相?鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn)∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可運(yùn)用多種溶劑消退硅羥基的不良影響缺點(diǎn)∶pH值不能小于3同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同體積解除色譜的分別機(jī)理凝膠色譜概述凝膠滲透（GPC）、凝膠過濾（GFC）分別基于分子在溶液中的體積大小洗脫次序：大分子先被洗脫流淌相不參與分別，只起溶劑作用分別效率低色譜行為簡(jiǎn)潔預(yù)料GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分別液相色譜柱及分別機(jī)理的關(guān)系從色譜方法上分正相/反相離子交換分子體積解除親合從柱子類型上分支配/吸附離子交換凝膠親合液相色譜的方法開發(fā)（二）梯度方法梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)單位時(shí)間的分別實(shí)力增加檢測(cè)靈敏度提高缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測(cè)方式柱需再生定量分析的重復(fù)性較低如不用梯度：分別不志向梯度條件的優(yōu)化檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)器的要求高靈敏度可重現(xiàn)的設(shè)置合適的帶寬快速或可變的時(shí)間常數(shù)寬的線性響應(yīng)簡(jiǎn)潔運(yùn)用及保養(yǎng)自我診斷功能檢測(cè)器的種類衡量檢測(cè)器的指標(biāo)靈敏度∶S=△R/△Q△R是檢測(cè)器響應(yīng)值的增量△Q是樣品量的增量噪音∶沒有樣品時(shí)檢測(cè)器的最大輸出信號(hào)漂移∶檢測(cè)器在一段時(shí)間內(nèi)響應(yīng)值的變更線性動(dòng)態(tài)范圍∶最大線性相應(yīng)與最小檢出限之比最小檢測(cè)限∶樣品產(chǎn)生兩或三倍于噪音信號(hào)時(shí)的濃度信噪比∶S/N留意∶最小檢測(cè)限不是一個(gè)單純的檢測(cè)器指標(biāo)。它事實(shí)上是評(píng)價(jià)整個(gè)色譜系統(tǒng)的指標(biāo)，包括了色譜系統(tǒng)、分別機(jī)理、色譜柱在內(nèi)的綜合性指標(biāo)，信噪比亦如此紫外-可見光檢測(cè)器基于樣品池(S)中的樣品對(duì)光產(chǎn)生吸取，有信號(hào)差如是可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，還有分光系統(tǒng)(光珊)Beer'sLaw-BEER定律光能量∶P0=透過溶劑的光能量P=透過樣品的光能量光通量(透過率%)∶T=P/P0吸光度∶A=-log(T)=log(P0/P)吸光度=單位吸光度×流淌池長(zhǎng)度×溶液濃度即∶A=abc同紫外檢測(cè)器靈敏度有關(guān)的因素信號(hào)強(qiáng)度(S)從BEER定律可看出樣品的種類樣品濃度及進(jìn)樣的體積檢測(cè)池的長(zhǎng)度所運(yùn)用的波長(zhǎng)，檢測(cè)器的

時(shí)間常數(shù)噪音(N)流淌相所運(yùn)用的波長(zhǎng)，燈的能量檢測(cè)器的時(shí)間常數(shù)非檢測(cè)器因素-電噪音，泵脈動(dòng)等紫外檢測(cè)器的溶劑影響不同種類溶劑有其截止波長(zhǎng)溶劑的質(zhì)量好壞對(duì)其截止波長(zhǎng)有影響為何溶劑質(zhì)量不好?含紫外吸取的雜質(zhì)溶解在其中的氧氣緩沖液溶質(zhì)的紫外吸取示差折光檢測(cè)器DifferentialRefractiveIndexDetector示差檢測(cè)器的留意事項(xiàng)不能做梯度試驗(yàn)最大的池耐壓是100psi流速范圍是0.3-10ml/min.液相色譜的定性及定量技術(shù)色譜峰定性鑒別每個(gè)色譜峰通過比較保留值(通常是保留時(shí)間)的方法，找到各色譜峰所對(duì)應(yīng)的組份大多數(shù)狀況下用比較保留時(shí)間來定性 即所謂：保留時(shí)間相同，可能是同樣的組份保留時(shí)間不同，確定不是同樣的組份用保留時(shí)間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測(cè)組份的位置進(jìn)一步的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)加入同時(shí)用其他方法其他色譜方法（變更機(jī)理，如：用不同的色譜柱）其他檢測(cè)器PDA，光譜圖比較、譜庫(kù)檢索MS，質(zhì)譜圖解析、譜庫(kù)檢索其他儀器方法定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分使分析條件的分別度（R）大于：1.5色譜峰的定性，峰一樣性測(cè)定檢測(cè)限及定量限：確定靈敏度及線性范圍用標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢查方法的精確度及精確度用標(biāo)樣定期檢查方法痕量分析如信/噪比不夠，定量的精確度會(huì)受影響，因此要：分析前濃縮樣品選擇高靈敏度檢測(cè)器用衍生法使色譜體系最優(yōu)化運(yùn)用短的微徑柱（削減樣品的稀釋）運(yùn)用高效色譜柱使k'值盡可能小增加進(jìn)樣體積和濃度運(yùn)用低流速（N增加）接受梯度淋洗常用的定量方法峰面積百分比法由于檢測(cè)技術(shù)的影響，在液相色譜中不常用外標(biāo)法在液相色譜中用的最多內(nèi)標(biāo)法精確，但是麻煩在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的最多外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣外標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量（三）計(jì)算公式特點(diǎn)無需各組份都被檢出、洗脫須要標(biāo)樣標(biāo)樣及樣品測(cè)定的條件要一樣進(jìn)樣體積要精確內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣內(nèi)標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量（三）計(jì)算公式：特點(diǎn)：無需各組份都被檢出、洗脫須要標(biāo)樣，須要內(nèi)標(biāo)樣結(jié)果與進(jìn)樣體積無關(guān)內(nèi)標(biāo)法定量（四）對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測(cè)組分相像(同系物、異構(gòu)體)在樣品中不存在不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)保留值與待測(cè)組分接近濃度（響應(yīng)值）與待測(cè)組分相當(dāng)其色譜峰與其他色譜峰分別好峰面積百分比法定量公式：特點(diǎn)：各組分要全部流出、全部被檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)值一樣簡(jiǎn)潔，液相色譜目前很難做到這點(diǎn)與進(jìn)樣量無關(guān)不需標(biāo)樣簡(jiǎn)潔可接收的檢測(cè)范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，高或低于這些點(diǎn)都可能引起計(jì)算錯(cuò)誤定量校正曲線曲線A：因在零濃度時(shí)仍有色譜峰，

可能有雜質(zhì)未分開曲線B：在此濃度內(nèi)，檢測(cè)器的響應(yīng)

值是非線性的曲線C：可接受的志向狀態(tài)，實(shí)際情

況應(yīng)是∶其延長(zhǎng)線到零點(diǎn)曲線D：表明有樣品的損失，可能是色譜柱的非特征吸附，也可能是樣品制備時(shí)的損失高效液相色譜儀的運(yùn)用、保養(yǎng)

及留意事項(xiàng)色譜柱的運(yùn)用及保養(yǎng)流淌相的轉(zhuǎn)換特殊是GPC柱流速(壓力)的變更幅度溫度的變更幅度專用色譜柱∶樣品及溶劑的要求色譜柱的清洗對(duì)所做的樣品要有充分的了解用對(duì)該樣品洗脫實(shí)力最強(qiáng)的流淌相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽合適的存放溶劑避開色譜柱床的干枯避開機(jī)械振動(dòng)防止細(xì)菌生長(zhǎng)留意存放的溫度在線的疼惜裝置給色譜柱供應(yīng)物理的疼惜除去樣品及流淌相中的顆粒給色譜柱供應(yīng)化學(xué)的疼惜防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過濾器自裝填料疼惜柱預(yù)裝疼惜柱在線過濾器防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效疼惜柱可避開化學(xué)污染。色譜泵的保養(yǎng)流淌相要過濾常用緩沖液時(shí)，停泵前要用水沖洗，并用水沖洗柱塞桿清洗孔擰緊排液閥時(shí)，不要太用力，以不滲液為準(zhǔn)更換流淌相時(shí)，要保證兩種溶劑的互溶性如不互溶，要用一種中間溶劑過渡，要防止沉淀進(jìn)液處的砂芯過濾頭要常常清洗；避開泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染；紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時(shí)，打開檢測(cè)器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測(cè)器。流淌相方面

除去微粒純度的要求超純水，梯度試驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流淌相對(duì)樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例對(duì)流淌相的要求:除色譜柱對(duì)流淌相對(duì)的要求外，還有∶與檢測(cè)器匹配脫氣避開鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細(xì)菌的生長(zhǎng)流淌相及樣品的預(yù)處理

流淌相的脫氣流淌相脫氣的目的使色譜泵的輸液精確輸液勻整精確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測(cè)的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸取本底降低疼惜色譜柱削減死體積防止填料的氧化流淌相脫氣的方法加熱簡(jiǎn)潔，猶如抽真空一起運(yùn)用，其效果很好。但簡(jiǎn)潔造成流淌相組成的變更抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波簡(jiǎn)潔，但效果不志向。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機(jī)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度樣品方面除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流淌相中的溶解度如樣品的溶劑不是流淌相，確定要用流淌相試溶解度，防止其在流淌相中析出了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的除去微粒削減干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性改善分別的效果有利于色譜柱及儀器的疼惜樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分別的時(shí)間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品試驗(yàn)的重復(fù)性及精確性最差的環(huán)節(jié)影響試驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素是確定性的步驟樣品預(yù)處理常用的方法高速離心過濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-固萃取/液-液萃取Sep-Pak樣品處理小柱其他去除微粒過濾過濾膜/過濾裝置有機(jī)(0.5m)/無機(jī)(0.45m)膜片可更換一次性運(yùn)用的膜“Cartridge”運(yùn)用便利簡(jiǎn)潔，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000g進(jìn)樣的留意事項(xiàng)手柄處于Load和Inject之間時(shí)，由于短暫堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位，過高的壓力在柱頭上引起損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥，不能停留在中途。在