創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日1．冰凍切片是免疫組織化學(xué)染色中最常常使用的一種切片方法。其最突出的長處是能夠較完滿地保存多種抗原的免疫活性，特別是細(xì)胞概略抗原更應(yīng)采納冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。之巴公井創(chuàng)始作創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日冰凍時(shí)，組織中水份易形成冰晶，常常影響抗原定位。一般認(rèn)為冰晶少而大時(shí)，影響較小，冰晶小而多時(shí)，對組織構(gòu)造傷害較大，在含水量許多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長速率成正比，而與成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的數(shù)目愈多則愈小，對組織構(gòu)造影響愈嚴(yán)重。所以，應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)目。Fish以為冰凍開始時(shí)，冰晶成核率較慢，此后漸漸增添，其臨界溫度為-33。C,從-30。C降至-43。C之間，成核率急劇增添達(dá)1018，而后再減慢。鑒于上述理論可采用以下舉措減少冰晶的形成。（1）速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。C43。C的時(shí)間，減少冰晶的形成。其方法有二：①干冰-丙酮（酒精）法：將150-200ml丙酮（酒精）裝入小保溫杯內(nèi)，漸漸加入干冰，直至飽和呈黏稠狀，再加干冰不再昌泡時(shí)，溫度可達(dá)-70℃C，用一小燒杯（50-100ml）內(nèi)裝異戊烷約50ml，再將燒杯遲緩置入干冰丙酮（純酒精）飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達(dá)70℃時(shí)即可使用。將組織（大小為1cm×0.8cm×0.5cm）投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后拿出，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80℃低創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日溫冰箱內(nèi)儲存。②液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm），如組織塊小可適當(dāng)加OCT包埋劑淹沒組織，而后將特制小盒慢慢平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開始?xì)饣序v，此時(shí)小盒堅(jiān)持原位切勿浸入液氮中，大概10-20s組織即快速冰結(jié)成塊。拿出組織冰塊立刻置入-80℃冰箱儲存?zhèn)溆?，或置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。（2）將組織置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高滲汲取組織中水分，減少組織含水量。影響冰凍切片的要素許多，所以，技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機(jī)是擔(dān)保切片質(zhì)量的重點(diǎn)。當(dāng)前冰凍切片機(jī)有兩類：①恒慢冰凍切片機(jī)（Cryastat）：為較理想的冰凍切片機(jī)，型號好多，但其基本構(gòu)造是將切片機(jī)置于-30℃C低溫密閉室內(nèi)，故切片刻不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至2-4μm，完整能知足免疫組織化學(xué)表記表記標(biāo)記要求。切片刻，低溫室內(nèi)溫度以15℃～18℃為宜，溫度過低組織易破裂，抗卷板的地點(diǎn)及角度要適合，載玻片附貼組織切片，切勿上下挪動。②開放式冰凍切片機(jī)：包括半導(dǎo)體致冷切片機(jī)和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機(jī)。切片刻表露空氣中，溫度不簡單控制，切片技術(shù)難度大，在高溫季節(jié)，切片更為困難，且切片厚8～15μm，不簡單連續(xù)切片，但其長處是價(jià)廉，國內(nèi)有生產(chǎn)。創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日冰凍切片后如不染色，一定吹干，儲存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲存冰箱保存。2．白臘切片其長處是組織構(gòu)造保存優(yōu)秀，在病理和回首性研究中有較大的適用價(jià)值，能切連續(xù)薄片，組織構(gòu)造清楚，抗原定位準(zhǔn)確。用于免疫組化技術(shù)的白臘切片制備與老例制片略有分歧：①脫水、透明等過程應(yīng)在4℃。C下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應(yīng)限于2cm×1.5cm×0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸蠟。③浸蠟、包埋過程中，白臘應(yīng)堅(jiān)持在60℃以下，以溶點(diǎn)低的軟蠟最好（即低溫白臘包埋）。組織塊脫水、透明、浸蠟時(shí)間參照表1-3：表1-3組織塊辦理時(shí)間表170%乙醇4℃3～4h280%乙醇4℃3～4h390%乙醇4℃2～3h495%乙醇Ⅰ4℃2～3h595%乙醇Ⅱ4℃1～2h二甲苯Ⅰ4℃0.5～1h二甲苯Ⅱ4℃0.5１～1h白臘Ⅰ60℃1h白臘Ⅱ60℃2h以上全過程為18-24h，也可在室溫內(nèi)使用自動脫水機(jī)取代。創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日如組織塊小，直徑小于0.5cm，可用快速白臘包埋切片，全過程只需4h左右。白臘切片為老例制片技術(shù)，切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式，切片厚度2～7μm，應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色平均一致。因?yàn)榧兹┕潭ā⒂袡C(jī)熔劑和包埋劑對組抗原有必定的傷害及遮蓋，使抗原特點(diǎn)發(fā)生改變。有人陳說經(jīng)蛋白酶消化，能夠改良光鏡免疫組化染色強(qiáng)度，常常使用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。白臘切片應(yīng)入37℃恒溫箱留宿，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長久儲存，可寄存于4℃冰箱內(nèi)備用。白臘切片長處許多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機(jī)溶劑辦理，組織內(nèi)抗原活性失掉許多，有人采納冷凍干燥包埋法（Freezedryingembeddingmethed），能夠保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防備蛋白變性和酶的失活，進(jìn)而減少了抗原的丟掉。該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機(jī)（Freezingdryer）在真空