課題三血紅蛋白的提取和分離專題五DNA和蛋白質(zhì)技術含量組成元素分子質(zhì)量基本單位氨基酸連接方式細胞中含量最多的有機物C、H、O、N等高分子化合物，分子量很大RHCCOOHNH2氨基酸結構通式：種類：20種脫水縮合一個氨基酸的氨基（—NH2）和另一個氨基酸的羧基（—COOH）相結合，形成肽鍵，同時脫去一分子H2O基礎知識（一）蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)－－

蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)差異1.分子的形狀、大小2.電荷性質(zhì)和多少3.溶解度4.吸附性質(zhì)5.對其他分子親和力基礎知識方法原理凝膠色譜法電泳法根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)根據(jù)分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身大小、形狀的不同分離蛋白質(zhì)1.凝膠色譜法

（1）材料：凝膠微小的多孔性球體，如葡聚糖或瓊脂糖。內(nèi)部有許多貫穿的通道。（2）原理：小蛋白質(zhì)大蛋白質(zhì)混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子

當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時相對分子質(zhì)量較小相對分子質(zhì)量較大凝膠內(nèi)部的通道容易進入無法進入凝膠內(nèi)部的通道只能在凝膠外部移動路程較長移動速度較慢路程較短移動速度較快相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離2.緩沖溶液(1)概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的溶液。(2)作用：能夠抵制外界的酸或堿的對溶液的pH的影響，維持pH基本不變。(3)配制：通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。(4)本實驗使用的是磷酸緩沖液(NaH2PO4/Na2HPO4),目的是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的pH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察（紅色）和科學研究（活性）。由弱酸和相應的強堿弱酸鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。3.電泳法（1）概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。（2）原理：分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。（3）類型：瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（純度鑒定）由于瓊脂糖本身不帶電荷，各種分子在電場中遷移速度決定于所帶電荷性質(zhì)的差異及分子的大小、形狀的不同在凝膠中加入SDS，使蛋白質(zhì)解聚成單鏈，與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)－SDS復合物，使其遷移速度完全取決于分子的大小SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的蛋白質(zhì)分子量時，測定的結果只是

單條肽鏈

的分子量。凝膠電泳原理示意圖點樣處點樣處在凝膠的上面還是下面呢？實驗操作樣品處理純化純度鑒定粗分離（分離與透析分離血紅蛋白）（凝膠色譜法純化）（電泳法鑒定純度）（洗滌紅細胞和釋放血紅蛋白）血紅蛋白提取與分離的四步操作實驗操作

血液組成成分

1.洗滌紅細胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白樣品處理和粗分離純化純度鑒定1.洗滌紅細胞血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理鹽水攪拌10min重復洗滌3次，直至上清液沒有黃色（一）樣品處理2.釋放血紅蛋白洗滌好的紅細胞導入燒杯加蒸餾水到原血樣體積加40﹪體積苯充分攪拌10分鐘3.分離血紅蛋白紅細胞混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)有機溶劑血紅蛋白燒杯(4)透析：①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。②目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。（二）凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作2.凝膠色譜柱的裝填3.樣品的加入和洗脫1.凝膠色譜柱的制作打孔→挖穴→安管→覆網(wǎng)→紗包→插管

2.凝膠色譜柱的裝填50cm高固定色譜柱－配凝膠懸液－裝填色譜柱－洗滌平衡沸水浴加熱緊密

不得有氣泡磷酸緩沖液(pH為7.0）3.樣品的加入和洗脫1.調(diào)液面2.加樣3.再調(diào)液面4.洗脫5.收集緩沖液凝膠紅色區(qū)帶均勻一致地移動。操作提示1.紅細胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2.色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。3.凝膠的預處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡。4.

色譜柱成功標志：結果分析與評價1.血液樣品的處理分層明顯→樣品處理完成2.凝膠色譜柱的裝填放一支與凝膠柱垂直的日光燈直接檢查加入大分子有色物質(zhì)如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，若色帶均勻、狹窄、平整→裝填成功。3.血紅蛋白的分離血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨洗脫液緩慢流出，分離成功。1.以下關于豬血紅蛋白提純的描述，不正確的是（

）A．洗滌紅細胞時，使用生理鹽水可防止紅細胞破裂B．豬成熟紅細胞中缺少細胞器和細胞核，提純時雜蛋白較少C．血紅蛋白的顏色可用于凝膠色譜法分離過程的監(jiān)測D．在凝膠色譜法分離過程中，血紅蛋白比分子量較小的雜蛋白移動慢D課堂練習A2.蛋白質(zhì)的分離與提純技術是蛋白質(zhì)研究的重要技術，下列有關敘述不正確的(

)A．根據(jù)蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的特性，可將樣品中各種不同蛋白質(zhì)分離B．根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小，可通過電泳分離蛋白質(zhì)C．根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，可通過凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)D．根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法分離蛋白質(zhì)3.下列關于DNA粗提取實驗和血紅蛋白的提取實驗,敘述正確的是(

)A.前者選擇雞血細胞作為實驗材料較好,后者選擇哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料較好B.樣品預處理時,前者