第五章酶與細(xì)胞的固定化技巧教授修養(yǎng)目標(biāo)：使學(xué)生懂得并控制固定化酶（細(xì)胞.原生質(zhì)體）的觀點(diǎn)及意義,控制酶的常常運(yùn)用固定化技巧,懂得固定化酶的性質(zhì).教授修養(yǎng)重點(diǎn).難點(diǎn)：固定化酶（細(xì)胞.原生質(zhì)體）的領(lǐng)域,各種固定化技巧.固定化酶（細(xì)胞.原生質(zhì)體）的領(lǐng)域,半透膜包埋法.教授修養(yǎng)方法：解說教授修養(yǎng)手段：多媒體第一節(jié)概括.游離酶運(yùn)用中的限制性:提取純化繁瑣,價格昂貴難以頻頻運(yùn)用牢固性差二.固定化酶商討戰(zhàn)勝游離酶缺點(diǎn)的方法之一50年代初步60年代后期,固定化技巧矯捷成長1969年,千田一郎首次在工業(yè)分娩范圍運(yùn)用固定化氨基?；笍腄L-AA連續(xù)分娩L-AA實(shí)現(xiàn)酶運(yùn)用史上的一大改動三.根本觀點(diǎn)固定化酶（1971第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會議）（ImmobilizedEnzyme)指在必然空間范圍內(nèi)呈閉鎖情況消逝的酶,能連續(xù)地進(jìn)行反響,反響后的酶能夠收受接收頻頻運(yùn)用.包括酶與不溶性載體結(jié)合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝膠或超濾裝置中的酶.固定化細(xì)胞（原生質(zhì)體）指被限制自由挪動的細(xì)胞,即細(xì)胞遇到物理化學(xué)等身分約束或限制在必然空間范圍內(nèi),但細(xì)胞仍保留催化活性并擁有能被頻頻或連續(xù)運(yùn)用的活氣.四.固定化酶優(yōu)點(diǎn)增加了酶的牢固性能降低酶的整體花費(fèi)酶的分別和收受接收變得輕易,并可頻頻運(yùn)用使反響進(jìn)度的連續(xù)操控成為可能反響產(chǎn)品也易于提取純化有益于進(jìn)度設(shè)計(jì)和優(yōu)化拓廣了酶的運(yùn)用范圍（多酶系統(tǒng)的酶反響,非水相酶反響,生物傳感器探優(yōu)等）第二節(jié).酶的固定化方法一.酶的固定化方法酶的固定化方法（四大類方法）1）吸附法2）包埋法3）交聯(lián)法）化學(xué)共價法其余（酶的逆膠束包囊法）.酶的固定化方法選擇方法依據(jù)：⑴酶的性質(zhì)⑵載體的發(fā)源.價格.機(jī)械機(jī)能.載體的功能基團(tuán)和交聯(lián)度等⑶制備方法輕巧易行⒊衡量依據(jù)：⑴測定固定化酶的活氣,以一定固定化進(jìn)度的活氣收受接收率;⑵商討它的最適反響前提（底物濃度.pH值.溫度.離子強(qiáng)度等）;⑶牢固性和不牢固原由的商討;⑷對酶進(jìn)行人工修飾,使其與載體的結(jié)合達(dá)到較為想象的構(gòu)型和相容性.（一）吸附法道理：主假如運(yùn)用細(xì)胞與載體之間的吸引力（范德華力.離子鍵和氫鍵）,使細(xì)胞固定在載體上,常常運(yùn)用的吸附劑有玻璃.陶瓷.硅藻土.多孔塑料.中空纖維等.其余還可運(yùn)用專一的親和力來固定細(xì)胞,比如伴刀豆球蛋白Ａ與ａ一甘露聚糖擁有親和力,而釀酒酵母細(xì)胞壁上含有ａ一甘露聚糖,故可將伴刀豆球蛋白Ａ先連接到載體上,而后把酵母連接到活化了的伴刀豆球蛋白上.酶資料：酶或結(jié)合在菌體（去世細(xì)胞）及細(xì)胞碎片上的酶或酶系.優(yōu)缺點(diǎn)：操控輕巧,前提平易,不會惹起酶的變性掉活,載體廉價易得,且可頻頻運(yùn)用;缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)與載體之間的結(jié)合相當(dāng)弱,而且好多情況下,酶的非特異性吸附常常會惹起部分或全體掉活,高濃度的鹽溶液或底物溶液又將加速蛋白質(zhì)的脫附.是以當(dāng)懇求酶的固定絕對牢固時,采納吸附法是很不可靠的.常常運(yùn)用吸附劑各種礦物質(zhì)以及無機(jī)載體(氧化鋁,氧化鐵,氧化鈦,硅藻土,多空陶瓷,多空玻璃,羥基磷灰石等),及自然高分子載體淀粉.白蛋白等,最常常運(yùn)用的吸附劑是離子溝通劑羧甲基纖維素,DEAE----纖維素.DEAE----葡萄糖,合成的陰離子和陽離子溝通劑離子溝通劑重要靠靜電吸引,缺點(diǎn)是當(dāng)離子強(qiáng)度增加或介質(zhì)的pH.溫度更改時,這種結(jié)合產(chǎn)生疏化.舉例：將伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖4B50ml（在10mMPBSpH7.4含0.5MNaCl,1mMCaCl2和1mMMnCl2）與酶液

(10mg/ml)5ml,

在4℃,

攪勻過夜,便成瓊脂糖復(fù)合物,用（1mMCaCl2和1mMnCl2）充分清洗,直至測不出活性為度,最后再懸浮于10mlNaAcPBS中備用.（二）包埋法觀點(diǎn)：指將酶或含酶菌體包埋在各種多空載體中,使酶固定的方法.可分為凝膠包埋法（網(wǎng)格型）和半透膜包埋法（微囊型）兩種.優(yōu)缺點(diǎn)：一般不需酶的AA殘基進(jìn)行結(jié)合反響,極少轉(zhuǎn)變酶的高等結(jié)構(gòu),酶活收受接收率高;缺點(diǎn)是包埋時產(chǎn)生化學(xué)聚合反響,酶易掉活,須巧妙設(shè)計(jì)反響前提.其余網(wǎng)格結(jié)構(gòu)影響底物和產(chǎn)品的集中,有時,這種集中會以致酶動力學(xué)行動的轉(zhuǎn)變,因此此法只適合于小分子底物和產(chǎn)品的酶.海藻酸鹽包埋法海藻酸鈉與Ca2+,Mg2+,Al3+等多價離子間的轉(zhuǎn)移凝膠感動,形成固定化細(xì)胞顆粒缺點(diǎn):在高濃度電介質(zhì)（K+,Na+）溶液中,固定化顆粒變得不穩(wěn)固.Ca2+等多價離子在磷酸緩沖溶液中易形成積淀,固定化顆粒融化優(yōu)點(diǎn):海藻酸鹽價格廉價包埋前提平易角叉菜糖包埋法K-角叉菜是一種含有好多硫酸基礎(chǔ)團(tuán)的多糖化合物.在K+離子存鄙人,它能馬上生成凝膠.缺點(diǎn):對高濃度的Na+離子愚鈍固定化溫度高,須要在37℃~55℃聚丙烯酰胺凝膠在含酶(或細(xì)胞)的水溶液中,參加必然比率的單體丙烯酰胺和膠聯(lián)劑N,N’-甲撐雙丙烯酰胺.而后在催化劑(二甲氨基丙腈)和激發(fā)劑(過硫酸鉀)的感動下低溫(冰浴)聚合,形成凝膠缺點(diǎn):丙烯酰胺對酶擁有變性感動聚乙烯醇（PVA）包埋法磷酸鹽硬化法,輪回冷凍法,硼酸硬化法硼酸硬化法:將聚乙烯醇在70℃~80℃進(jìn)行水浴加熱至完整融化,而后冷卻至35℃,與酶溶液(細(xì)胞懸浮液)混勻,滴加到飽和硼酸溶液中優(yōu)點(diǎn):原資料價格廉價前提平易無傷害感動輪回冷凍法硼酸硬化法半透膜包埋法7.1界面積淀法運(yùn)用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上融化度極低而形成被膜將酶包埋.操控：酶液在油溶性概略活性劑存鄙人在水不互溶的有機(jī)相中乳化形成油包水的微滴,再將溶于有機(jī)溶劑的高聚物參加乳化液中,而后參加一種不用融高聚物的有機(jī)溶劑,使高聚物在油-水界面上積淀析出,形成膜將酶包埋,最后在乳化劑幫忙下由有機(jī)相移入水相.半透膜包埋法界面聚正當(dāng)運(yùn)用親水性單體和疏水性單體在界面產(chǎn)生聚合的道理包埋酶.例:將含10%血紅蛋白的酶液與1,6己二胺的水溶液混淆,馬上在含1%司盤-85的氯仿-環(huán)己烷中分散乳化,再參加溶于有機(jī)相的葵二酰氯后,便在油-水界面上產(chǎn)生聚合反響,形成尼龍膜,將酶包埋.（三）交聯(lián)法基發(fā)源基礎(chǔ)理：酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵獲得三向的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu),以戊二醛運(yùn)用最廣泛OHC（CH2）3CHO,使載體的氨基和酶蛋白中的氨基交聯(lián)形成席夫堿（基）Shiff堿將酶固定化.含氨基的載體,可用氯乙基纖維素（纖維素-OCH2CH2NH2）,二乙氨乙基纖維素（DEAE-纖維素）.雙功能試劑除了戊二醛外,還有乙撐二異氰酸酯OCN（CH2）6NCO.交聯(lián)劑的特點(diǎn)：①帶有二個以上的功能基團(tuán).②反響比較強(qiáng)烈前提比較嚴(yán)苛.③操控方便,活氣收受接收不高.固定化分兩步進(jìn)行,第一步形成可溶性分子間交聯(lián)系合物,第二步是迅速反響以致固化.交聯(lián)法有5種形勢：①酶直接交聯(lián)法在酶液中參加適當(dāng)多功能試劑,使其形成不溶性衍生物.固定化依賴酶與試劑的濃度.溶液pH和離子強(qiáng)度.溫度和反響光陰之間的均衡.此法操控簡單,一種多功能試劑可制備好多酶衍生物,但缺乏選擇性,難于防備分子內(nèi)交聯(lián),活氣收受接收常常不高.②酶幫助蛋白交聯(lián)：為防備分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)進(jìn)度中因化學(xué)潤飾而惹起掉活,可運(yùn)用第二個“載體”蛋白質(zhì)（即幫助蛋白質(zhì),如白蛋白.明膠.血紅蛋白等）來增加蛋白質(zhì)濃度,使酶與惰性蛋白質(zhì)共交聯(lián).合用中,當(dāng)酶蛋白.無酶活性蛋白與戊二醛混淆（戊二醛最后濃度0.7%）后,混淆液粘度初步進(jìn)步時,馬上鋪膜,或許在酶蛋白戊二醛與幫助蛋白混淆后,經(jīng)-30℃低溫辦理,再預(yù)熱至4℃而得泡沫狀蛋白質(zhì)共聚物.這種固定化酶為多孔性,活氣收受接收比酶直接交聯(lián)高,機(jī)械機(jī)能也有改進(jìn).③吸附交聯(lián)法：先將酶吸附在硅膠.皂土.氧化鋁.球狀酚醛樹脂或其余大孔型離子溝通樹脂上,再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián).用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶.此法用于胞外酶的固定化較好,特別是從發(fā)酵液和粗酶制劑中直接固定化時,載體的選擇性吸附有必然純化感動,而酶分子之間的共價交聯(lián)又擔(dān)保酶分子牢牢地結(jié)合于載體上,而且酶分子僅消逝于載體概略,使固定化酶與底物接觸優(yōu)勝.由于載體自己有較好機(jī)械機(jī)能,因此產(chǎn)生的固定化酶裝柱流淌機(jī)能好,缺點(diǎn)是一定擔(dān)保酶吸附在載體上.④載體交聯(lián)法：用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾高聚物載體,而其中另一部分功能基團(tuán)偶連酶蛋白.也可運(yùn)用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)與一種聚合物的單體反響,反響后再與酶一路共聚.⑤交聯(lián)包埋法：把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝集成顆粒很細(xì)的齊集體,而后用高分子或多糖一類物質(zhì)進(jìn)行包埋成顆粒.這樣防備顆粒太細(xì)的缺點(diǎn),同時制得的固定化酶牢固性好戊二醛交聯(lián)法缺點(diǎn)：雙功能基團(tuán)試劑與酶蛋白的交聯(lián)感動,常惹起蛋白質(zhì)高等結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變,使酶掉活.為了防備或減少酶在交聯(lián)進(jìn)度中掉活,可在被交聯(lián)的酶蛋白溶液中增添必然量的幫助蛋白.（四）化學(xué)共價法觀點(diǎn)所謂共價法就是使酶蛋白的非一定基團(tuán)（-NH2,-OH,-COOH,-SH,酚基,咪唑基,吲哚基）經(jīng)由過程共價鍵和不溶性載體形成不可逆的聯(lián)接.要使載體與酶形成共價鍵,一定首先使載體活化,接上一世動基團(tuán),再與酶反響2.用于共價法固定的酶蛋白上的功能基團(tuán):1）氨基-賴氨酸上的ε-氨基以及多肽鏈N末端氨基酸上的α-氨基;2）羧基-雙羧基氨基酸:門冬氨基酸和谷氨酸上的游離羧基,以及多肽鏈末端的α-羧基;3）酪氨酸上的苯酚環(huán);4）半胱氨酸上的巰基;5）羥基-絲氨酸,蘇氨酸以及酪氨酸上的羥基6）組氨酸上的咪唑基;）色氨酸上的吲哚基其中以氨基和羧基為最常常運(yùn)用一般認(rèn)為共價法的特點(diǎn)以下：①酶和載體的結(jié)合比較牢固,酶不輕易零落.故運(yùn)用的半衰期較長.②制備前提錯亂,反響強(qiáng)烈,易惹起酶蛋白高等結(jié)構(gòu)產(chǎn)生更改.③制備獲得的固定化酶,活氣收受接收一般在50%閣下.④載體不會惹起蛋白質(zhì)的變性,經(jīng)得起必然的pH,濃度的轉(zhuǎn)變.常常運(yùn)用載體⑴自然高分子.如纖維素,葡聚糖凝膠（Sephadex）,瓊脂糖AgaroseSepharose）,卡那膠,淀粉以及它們的衍生物.（運(yùn)用-OH）⑵人工合成的高聚物,如聚丙烯酰胺,聚苯乙烯,聚乙烯醇,氨基酸共聚物等.（運(yùn)用-NH2）⑶無機(jī)載體,如多孔玻璃,硅膠等.（要加上一個基團(tuán)）技巧重點(diǎn)⑴將所采用的載體上的相關(guān)基團(tuán)活化,而后和酶蛋白上相關(guān)基團(tuán)產(chǎn)生偶聯(lián)反響.（直接活化或另接一反響基團(tuán)）⑵在采用的載體上接上一個雙功能試劑,而后將酶蛋白和雙功能試劑偶聯(lián).（接手臂）分類：⑴重氮法;⑵疊氮法;⑶縮正當(dāng);⑷烷化反響法;⑸硅烷化反響法;⑹溴化氰法.⑴重氮法今朝在我們國內(nèi)用的許多的載體是對氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素.瓊脂糖,葡聚糖凝膠和瓊脂等,用這些載系統(tǒng)體例備了好多固定化酶.方法道理以下：①用雙功能試劑β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA）,連接于被活化（-OH）的纖維素等載體上制備成ABSE-纖維素,瓊脂糖等.②在鹽酸和亞硝酸鈉辦理下把ABSE-纖維素變?yōu)橹氐}.③把酶偶聯(lián)于ABSE-纖維素上⑵疊氮法是在酶分子與載體間形成肽鍵的固定化方法.主假如含羧基載體,轉(zhuǎn)變?yōu)轷；B氮氯化物,異氰酸鹽等活化形態(tài)的衍生物,而后與酶的游離氨基反響,從而形成肽鍵.例：用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶,步伐以下：⑴酯化：CM-纖維素挨次用水.乙醇.乙醚清洗潤濕,而后懸于無水甲醇中,在冰浴中通入HCl氣體,進(jìn)行酯化反響;最后用甲醇.乙醚清洗,空氣潤濕.⑵肼解:把酯化后的CM-纖維素懸于甲醇中,再參加80%水合肼回流反響1小時,過濾,甲醇清洗潤濕.⑶疊氮化:肼解后的CM-纖維素（1g）參加150ml2%HCl在冰浴中混淆,攪拌滴加9ml3%NaNO2反響20min,過濾用冷蒸餾水清洗,同時加酶,防備戊二醛的另一醛再與載體上另一個

-NH2

反響.(4)

偶聯(lián)：經(jīng)疊氮化后的載體參加

磷酸緩沖液（內(nèi)含

250-500mg酶）,5℃攪拌2-3小時,過濾用0.001NHCl,水清洗,即為固定化胰蛋白酶（凍干保留）⑶縮正當(dāng)（對含-NH2,-COOH載體的另一種方法）重要運(yùn)器擁有羧基或氨基的載體,參加到酶液中,在縮合劑碳化二亞胺（雙環(huán)己基碳酰胺）感動下

,使載體的羧基或氨基和酶蛋白上的

NH2或COOH形成肽鏈而被固定

.含羧基的載體有羧甲基纖維素

,羧甲基交聯(lián)葡聚糖等

.含氨基的載體有氨乙基纖維素,多孔玻璃氨基硅烷衍生物.⑷烷基化反響法.將含有鹵素官能團(tuán)試劑與非水溶性的纖維素載體進(jìn)行烷化反響,而后和酶進(jìn)行偶聯(lián)制得固定化酶.一般常常運(yùn)用三氯三嗪基試劑活化纖維素,而后偶聯(lián)酶（交聯(lián)葡聚糖,瓊脂糖,多孔玻璃等）.⑸硅烷化法：多孔玻璃特點(diǎn)：①機(jī)械強(qiáng)度好,概略積大.②耐有機(jī)溶劑和微生物破壞.載體能夠重生,壽命長等.一般常常運(yùn)用的載體：多孔玻璃,多孔陶瓷.這些多孔玻璃的孔徑在250～1000埃之間,含SiO296%,由于粒度很細(xì),每1克所失掉的概略積達(dá)100平方米（氧化鈉,氧化硼,氧化硅經(jīng)熱辦理原子重組而成,是優(yōu)異載體,但一定加以改革）.本法進(jìn)行酶的固定化可分三個步伐：①將本體接上一個結(jié)合劑（也即硅烷化）;②接上功能基團(tuán);③把酶共價結(jié)合于載體.⑹溴化氰法-異脲鍵正當(dāng)本方法重要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì).如纖維素.葡聚糖.瓊脂糖等,其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）.用溴化氰法活化瓊脂糖制備獲得的固定化酶今朝運(yùn)用很廣,特別用作親和層析,有著優(yōu)勝的機(jī)能.上述這些載體在高pH前提下（pH11閣下）,溴化氰和多糖一類物質(zhì)形成一種環(huán)化的生動的亞氨碳酸鹽,該化合物對蛋白質(zhì)上的NH2反響十分愚鈍,生成N-取代異脲,N-取代亞氨碳酸酯和N-取代氨基甲酸酯.其中重要產(chǎn)品為N-取代異脲,反響式如右：例：胰蛋白酶的固定--均在4℃時進(jìn)行.⑴活化：稱取瓊脂糖凝膠100mg（Sepharose4B）,用0.5MNaCl和H2O清洗,除掉珍愛劑和防腐劑,而后按1ml積淀凝膠參加50～300mgCNBr.馬上用2NNaOH調(diào)pH值10～11,保持pH值11,pH值不再降低,直到反響停止.反響在25℃通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行,反響僅需10分鐘,這樣CNBr將載體全體活化,生成生動的亞氨碳酸鹽.反響完成后,

用冰水和冷

3

清洗（留神：切忌用帶有

-NH2基的緩沖液來清洗,由于亞氨碳酸鹽對NH2-愚鈍,在酶偶聯(lián)時,活性部位被NH2占有,酶偶聯(lián)不上）,去除剩余CNBr和雜蛋白.⑵偶聯(lián)：用偶聯(lián)緩沖液（硼酸緩沖液-0.02M3酶）CaCl2或NaHCO平衡清洗,抽干,參加5ml緩沖液（內(nèi)含16mg溫度降至4℃,攪拌反響4小時,最后分別用硼酸緩沖液-1MNaCl清洗即成醋酸緩沖液去除各種雜質(zhì)第三節(jié)細(xì)胞的固定化方法一.吸附法同酶的方法,（1）酵母細(xì)胞帶負(fù)電荷,在pH3-5的前提下能吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等載體概略,制成固定化細(xì)胞（2）霉菌的菌絲可吸附在多孔塑料.金屬絲網(wǎng)等載體上來固定化（3）植物細(xì)胞可吸附在中空纖維外壁上固定化（4）動物細(xì)胞大多擁有附壁發(fā)展特點(diǎn),須依賴在固體概略才華發(fā)展,可吸附在容器壁,微載體（顆粒微小的載體,直徑100-200um）和中空纖維外壁等載體上來固定（造就液在中空纖維內(nèi)流淌）.二.包埋法同酶包埋法例：海藻酸鈣-聚賴氨酸（ALG-PLL）包埋技巧動物細(xì)胞先用海藻酸鈣凝膠包埋→聚賴氨酸辦理,使膠粒外層包上一層聚賴氨酸薄膜→檸檬酸鈉溶液辦理,使海藻酸鈣凝膠消融→聚賴氨酸膜包被的近乎透明的微囊型固定化動物細(xì)胞.三.原生質(zhì)體固定化可解決胞內(nèi)酶的分娩利于氧的傳達(dá),養(yǎng)分紅分的接收一般采納凝膠包埋法包括原生質(zhì)體的制備和固定兩個步伐原生質(zhì)體的制備懇求：保持膜的完整性,不克不及使細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)遇到破壞制備：對數(shù)期細(xì)胞的采集→高滲溶液中加酶破壁→分別除掉細(xì)胞碎片.完整的細(xì)胞及酶（密度梯度離心）→原生質(zhì)體原生質(zhì)體的固定原生質(zhì)體→等滲緩沖液中配成必然濃度的原生質(zhì)體懸浮液→凝膠包埋角叉菜膠固定化含滲透溢出壓牢固劑的緩沖液與角叉菜加熱融化配成3%-8%的凝膠→滅菌→冷卻到50℃閣下與等體積的原生質(zhì)體懸浮液混淆均勻→滴入到必然濃度的預(yù)冷的氯化鉀溶液中→球狀的固定化原生質(zhì)體原生質(zhì)體的固定光交聯(lián)樹脂固定化法用含有滲透溢出壓牢固劑的緩沖液配制30%-60%濃度的光交聯(lián)樹脂預(yù)聚體,加熱融化后,在50℃閣下,參加1%光敏劑,與等體積的原生質(zhì)體懸浮液混淆均勻,攤成薄層,經(jīng)紫外光照射2-3mm,聚合后切成必然外形的小塊,制成片狀的固定化原生質(zhì)體.第四節(jié)固定化酶的評論一.相對酶活氣擁有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活氣的比值稱為相對酶活氣,它與載體的體結(jié)構(gòu).顆粒大小.底物分子量大小及酶的結(jié)合效勞相關(guān).相對酶活氣低于75%的固定化酶,一般沒有現(xiàn)實(shí)運(yùn)用價值.二.酶的活氣固定化的單位界說為：轉(zhuǎn)變底物的量

/固定化酶的單位重量（單位面積）/單位光陰,單位是：μmol/mg(cm2)/min.將酶進(jìn)行固定化時,總有一部分酶沒有與載體結(jié)合在一路定酶的活氣收受接收率能夠一定固定化的結(jié)果.活氣收受接收=固定化酶總活氣/被固定化游離酶總活氣×100%,或稱偶聯(lián)效勞.活氣保留

,測百分?jǐn)?shù)

.一般情況下

,活氣收受接收率應(yīng)小于

1,

若大于

1,

可能由于固定化活細(xì)胞增殖或某些控制身分除去的成就.三.固定化酶的半衰期即固定化酶的活氣降低為初始活氣一半所經(jīng)歷的光陰.它是衡量固定化酶操控牢固性的癥結(jié),其測定方法與化工催化劑半衰期的測定方法近似,也能夠經(jīng)由過程長久現(xiàn)實(shí)操控,也能夠經(jīng)由過程較短光陰的操控來計(jì)算.第五節(jié)固定化酶的性質(zhì)一.酶活氣的更改固定化酶的活氣在多數(shù)情況下比自然酶的活氣低,專一性也可能產(chǎn)生更改,其原由可能是：①酶的構(gòu)象的轉(zhuǎn)變以致了酶與底物結(jié)合才能或催化底物轉(zhuǎn)變才能的轉(zhuǎn)變;②載體的消逝給酶的活性部位或調(diào)理部位造成某種空間阻礙,影響酶與底物或其余效應(yīng)物的感動;③底物和酶的感動受其集中速度的限制.在個體情況下,固定化酶由于抗抑才能的進(jìn)步使得它反而比游離酶活氣高.二.酶牢固性進(jìn)步酶牢固性包括熱牢固性.對各種有機(jī)試劑的牢固性.對pH的穩(wěn)固性.對蛋白水解酶的抗性及儲藏牢固性等.三.最適pH值的更改酶固定化后,催化底物的最適pH值和pH活性曲線常產(chǎn)生更改,惹起更改的身分重要有兩個載體帶電性質(zhì)：載體帶負(fù)電荷時,會吸引反響液中的H+,以致酶周邊反響地區(qū)pH比周圍反響液低,須進(jìn)步反響液pH;反之,降低反響液pH.第五節(jié)固定化酶的性質(zhì)產(chǎn)品性質(zhì)：由于載體的集中阻礙,產(chǎn)品為酸性時,產(chǎn)品齊集在固定化酶所處的催化地區(qū)內(nèi),使此地區(qū)的pH降低,須進(jìn)步須進(jìn)步周圍反響液pH;反之,降低周圍反響液pH.四.最適溫度的更改一般情況下,固定化后的酶的最適感動溫度與游離酶不一樣不大,但有時由于固定化方法和載體的影響,固定化酶的最適感動溫度可能降低,也可能高升,須加以留神,最適溫度進(jìn)步是有益的,能夠降低酶的掉活速度..動力學(xué)常數(shù)的更改(隨載體性質(zhì)更改)：由于分配效應(yīng)：ρ=[Si]微情況/[S]宏不雅情況對簡單的固定化酶系統(tǒng),其動力學(xué)性質(zhì)一般折服米氏方程：⑴載體與底物帶相同電荷,[Si]<[S],則ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力.⑵載體與底物電荷相反,靜電感動,[Si]>[S],ρ>1,Km’<Km.底物特異性：關(guān)于感動于小分子底物的酶,更改不明顯;但關(guān)于可感動于小分子底物又可感動于大分子底物的酶來說,由于載體空間位阻感動,大分子底物難以靠近酶分子而使催化速度大大降低,如固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶,對二肽或多肽感動保持不變,對酪蛋白的感動僅為游離酶的3%閣下.第六節(jié)固定化輔酶一.輔酶固定化的意義輔酶類物質(zhì)是一些“全酶”的組成成分,介入催化反響.同時當(dāng)其與某些高分子物質(zhì)結(jié)應(yīng)時,能夠大大進(jìn)步催化效勞.是