關(guān)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白第1頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三按照宿主細(xì)胞的類型，可將基因表達(dá)系統(tǒng)分為:原核表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)植物表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備的蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量高，與天然蛋白質(zhì)具有相似的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能第2頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三發(fā)展歷史和現(xiàn)狀1987年FDA批準(zhǔn)了基因泰克公司生產(chǎn)的組織型纖溶酶原激活劑（tPA），世界上第一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備的重組蛋白質(zhì)藥物標(biāo)志著哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備重組蛋門時(shí)代的到來(lái)。

我國(guó)從2000年開始逐漸發(fā)展了該項(xiàng)技術(shù)，雖然起步較晚，基礎(chǔ)較差，但經(jīng)過(guò)努力實(shí)現(xiàn)了該項(xiàng)技術(shù)的突破。第3頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備重組蛋白技術(shù)發(fā)生了巨大的變化。主要表現(xiàn)在

(1)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，由過(guò)去的7天延長(zhǎng)至21天；(2)細(xì)胞密度增加，過(guò)去：1-2X106細(xì)胞／毫升，現(xiàn)在：1-1.5X107細(xì)胞／毫升；(3)產(chǎn)量增加，過(guò)去：10—20pg重組蛋白／細(xì)胞／天，50一100mg重組蛋白／升，現(xiàn)在：50-90pg重組蛋白／細(xì)胞／天，1-5g重組蛋白／升。第4頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的關(guān)鍵之處

表達(dá)載體改進(jìn)表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量分泌表達(dá)下游純化宿主細(xì)胞新型細(xì)胞株的建立培養(yǎng)工藝

第5頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、真核表達(dá)載體人工構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體為穿梭載體，含：原核DNA序列：大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因，便于載體在原核細(xì)胞中擴(kuò)增和大量制備。轉(zhuǎn)錄相關(guān)元件：哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以及終止子和加polyA信號(hào)序列。。翻譯相關(guān)元件：有效的mRNA翻譯信號(hào)其它：視實(shí)驗(yàn)需要加入標(biāo)志基因、內(nèi)含子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)等。第6頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第7頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三真核表達(dá)載體-啟動(dòng)子外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)與多種因素有關(guān)，主要是啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的強(qiáng)弱以及它們之間的搭配。

人巨細(xì)胞病毒的早期基因啟動(dòng)子和增加子(promoter／enhancer)是最常用的啟動(dòng)子。

高效啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)和改構(gòu)第8頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

內(nèi)含子某些內(nèi)含子有重要的基因功能調(diào)控序列,目的基因以基因組形式克隆入載體能得到高表達(dá)。為增加轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性,表達(dá)載體中一般含有天然的或人工合成的內(nèi)含子序列。轉(zhuǎn)錄終止序列

真核基因的hnRNA的加工過(guò)程需要PolyA信號(hào),在目的基因3’端加上PolyA,表達(dá)水平提高10倍以上。SV40的早期和晚期PolyA.第9頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第10頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第11頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第12頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三分泌表達(dá)載體第13頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

第14頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第15頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第16頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、宿主細(xì)胞

以高效表達(dá)外源基因?yàn)槟繕?biāo)的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞應(yīng)具備以下條件：細(xì)胞系特征：?jiǎn)适Ъ?xì)胞接觸抑制和錨地依賴特征，便于大規(guī)模培養(yǎng)。遺傳穩(wěn)定性：外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長(zhǎng)期保存。合適的標(biāo)記：便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持。生長(zhǎng)快且齊：分裂周期短，生長(zhǎng)均一，便于控制。安全性能好：不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌。第17頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白中，常用的細(xì)胞系有

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）人胚腎細(xì)胞HEK293第18頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO的優(yōu)勢(shì)遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國(guó)FDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞第19頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三人胚腎細(xì)胞（HEK293

）的優(yōu)勢(shì)貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)三種方式均可用于293細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。在無(wú)Ca2+或含Ca2+培養(yǎng)基中可同樣生長(zhǎng)，也可生長(zhǎng)在血清濃度較低的培養(yǎng)基中。具有很高的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率和對(duì)保持外源基因的高穩(wěn)定性第20頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、培養(yǎng)工藝

為了減少成本和節(jié)約時(shí)問(wèn)，近年來(lái)發(fā)展了大規(guī)模懸浮培養(yǎng)細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)常用的商業(yè)化的Ⅲ離了脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染效率很高，但價(jià)格不菲

目前有兩種試劑(磷酸鈣和聚乙烯亞胺)可用以滿足大規(guī)模培養(yǎng)瞬時(shí)表達(dá)第21頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三利用代謝工程，改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本采用無(wú)血清／無(wú)蛋白培養(yǎng)基(SFM／PFM)來(lái)降低細(xì)胞培養(yǎng)和產(chǎn)品純化的成本。雙無(wú)培養(yǎng)基但SFM／PFM缺乏生長(zhǎng)刺激因子、黏附因子、擴(kuò)展因子以及其他細(xì)胞生長(zhǎng)存活所必需的成分，在培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞常表現(xiàn)出活力降低、貼壁性差等現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致分泌目的蛋白的能力下降。通過(guò)將生長(zhǎng)刺激因子、黏附因子基因?qū)隒HO細(xì)胞中，讓CHO細(xì)胞本身提供其自身生長(zhǎng)所需要的成分，使其能在SFM／PFM中生長(zhǎng)良好。第22頁(yè)，共24頁(yè)，2023年，2月20日，星期三抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)培養(yǎng)周期細(xì)胞在大規(guī)模培養(yǎng)初期，目的蛋白的表達(dá)和細(xì)胞的增殖速率呈正相關(guān)。但當(dāng)反應(yīng)器中細(xì)胞的密度達(dá)到飽和后，細(xì)胞繼續(xù)增殖會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)分和氧的大量消耗以及乳酸、氨等有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細(xì)胞逐漸凋亡，重組蛋白表達(dá)量逐漸降低。減少代謝產(chǎn)物的積累、在細(xì)胞密度達(dá)到理想值時(shí)使細(xì)胞處