第三章

表面等離子體共振技術(shù)目錄3-1表面等離子體共振（SPR）的產(chǎn)生

3-1-1SPR簡史 3-1-2金屬內(nèi)部的等離子體振動 3-1-3金屬表面的等離子體振動 3-1-4產(chǎn)生表面等離子體共振的方法3-2SPR傳感器的基本概念

3-2-1傳感器的基本原理 3-2-2傳感器的基本結(jié)構(gòu)3-3典型的SPR傳感器及其應(yīng)用3-1-1SPR簡史1902年，Wood在光學(xué)試驗中發(fā)覺SPR現(xiàn)象1941年，F(xiàn)ano說明白SPR現(xiàn)象1971年，Kretschmann結(jié)構(gòu)為SPR傳感器奠定了基礎(chǔ)1982年，Lundstr?m將SPR用于氣體的傳感（第一次）1983年，liedberg將SPR用于IgG與其抗原的反應(yīng)測定1987年，Knoll等人起先SPR成像探討1990年，BiacoreAB公司開發(fā)出首臺商品化SPR儀器表面等離子體共振（Surfaceplasmonresonance，SPR），又稱表面等離子體子共振，表面等離激元共振，是一種物理光學(xué)現(xiàn)象，有關(guān)儀器和應(yīng)用技術(shù)已經(jīng)成為物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)探討的重要工具，。在金屬中，價電子為整個晶體所共有，形成所謂費(fèi)米電子氣。價電子可在晶體中移動，而金屬離子則被束縛于晶格位置上，但總的電子密度和離子密度是相同的，從整體來說金屬是電中性的。人們把這種狀況形象地稱為“金屬離子浸沒于電子的海洋中”。這種狀況和氣體放電中的等離子體相像，因此可以把金屬看作是一種電荷密度很高的低溫（室溫）等離子體，而氣體放電中的等離子體是一種高溫等離子體，電荷密度比金屬中的低。金屬板中電子氣的位移（上）金屬離子（+）位于“電子海洋”中（灰色背景），（下）電子集體向右移動 五十年頭，為了解快速電子穿過金屬箔時的能量損失，人們進(jìn)行了大量的試驗和理論工作。Pine和Bohm認(rèn)為，其中能量損失的部分緣由是激發(fā)了金屬箔中電子的等離子體振動（Plasmaoscillation），又稱為等離子體子（plasmon）。Ritchie從理論上探討了無限大純凈金屬箔中由于等離子體振動而導(dǎo)致的電子能量損失，同時也考慮了有限大金屬箔的狀況，指出：不僅等離子體內(nèi)部存在角頻率為ωp的等離子體振動，而且在等離子體和真空的界面，還存在表面等離子體振動（Surfaceplasmaoscillation），其角頻率為。Powell和Swan用高能電子放射法測定了金屬鋁的特征電子能量損失，其試驗結(jié)果可用Ritchie的理論來說明。Stern和Ferrell將表面等離子體振動的量子稱為表面等離子體子（Surfaceplasmon），探討了金屬表面有覆蓋物時的表面等離子體振動，發(fā)覺金屬表面很薄的氧化物層也會引起這種振動的明顯變更。他們還預(yù)言：由于表面等離子體振動對表面涂層的敏感，那么通過選擇合適的涂層，表面特征能量損失的值會在確定范圍內(nèi)發(fā)生變更。 除電子以外，用電磁波，如光波，也能激發(fā)表面等離子體振動。二十世紀(jì)初，Wood首次描述了衍射光柵的反常衍射現(xiàn)象，這事實上就是由于光波激發(fā)了表面等離子體振動所致。六十年頭晚期，Kretschmann和Otto接受棱鏡耦合的全內(nèi)反射方法，實現(xiàn)了用光波激發(fā)表面等離子體振動，為SPR技術(shù)的應(yīng)用起了巨大的推動作用。他們的試驗方法簡潔而奇妙，仍舊是目前SPR裝置上應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。(A)Kretschman(B)OttoPrismgMetalmSamples0kevkspxzPrismgSamplesMetalm0k'evksp3-1-2金屬內(nèi)部的等離子體振動因為金屬中的價電子可以自由移動，入射光可能激起電子氣的縱向振動。假如由于入射電子的作用，金屬中電子向右移動了一段距離，因此在右邊就有了電子積累。設(shè)ne為電子密度，右邊出現(xiàn)的面電荷密度為-nee，左邊的面電荷密度為+nee，則金屬的極化強(qiáng)度p為：由極化產(chǎn)生的電場Ep為:在這個電場的作用下，電子有向左移的傾向，于是產(chǎn)生了振動。假如不考慮振動能量的衰減，單位體積內(nèi)的電子氣的振動方程式為：式中m為電子的質(zhì)量，e為電子的電荷量，p為無衰減時的等離子體振動的角頻率，則或等離子體子（plasmon，又稱等離激元）的量子能量為：對金屬來說，ne≈1023/cm3，將此值代入式（5-6），可得金屬中等離子體子的量子能量約為：假如考慮了金屬內(nèi)電子的衰減，弛豫時間為τ，在外電場的存在下，電子只沿z方向運(yùn)動，則電子的運(yùn)動方程（Drude方程）為：由此可得：代入，則復(fù)數(shù)介電常數(shù)若忽視衰減，即時，有：依據(jù)等離子體理論，產(chǎn)生固體等離子體波應(yīng)滿足3-1-3金屬表面的等離子體振動上節(jié)所述的是金屬內(nèi)部的等離子體振動，即體積等離子體振動（Volumeplasmaoscillation）。而在金屬表面也存在電荷密度振動，稱為表面等離子體振動，其角頻率ωs與體積等離子體的不同，它們之間存在以下關(guān)系：若金屬表面覆蓋有介電常數(shù)為的薄層，則這種特殊表面的等離子體振動的角頻率ms為：3-1-4產(chǎn)生表面等離子體共振的方法表面等離子體振動產(chǎn)生的電荷密度波，沿著金屬和電介質(zhì)的界面?zhèn)鞑?，形成表面等離子體波（Surfaceplasmawave，SPW），其場矢量在界面處達(dá)到最大，并在兩種介質(zhì)中漸漸衰減。表面等離子體波是TM極化波，即橫波，其磁場矢量與傳播方向垂直，與界面平行，而電場矢量則垂直于界面。在半無窮電介質(zhì)和金屬界面處，角頻率為的表面等離子體波的波矢量為：式中c是真空中的光速，εm和εa分別是金屬和電介質(zhì)的介電常數(shù)。表面等離子體波的波矢量是復(fù)數(shù)，因為金屬的介電常數(shù)是復(fù)數(shù)（εm=εmr+iεmi）。金屬的εmr/εmi比高，波矢量的實部分可近似為：電磁波在真空中的速度c與在不導(dǎo)電的勻整介質(zhì)中的速度v之比稱為電介質(zhì)的折射率n：在光波的頻率下，電介質(zhì)一般為非磁性的，≈1，有：則：頻率為ω的通過電介質(zhì)傳遞的光的波矢量ka為：要使光波和表面等離子體波之間發(fā)生共振，必需有：但是，電介質(zhì)中光的（ka）總是在（kspw）的左邊，從不交叉，即（kspw）<（ka）。因此，電介質(zhì)中的光不能干脆激發(fā)表面等離子體子共振（SPR），必須要設(shè)法移動（kspw）或（ka）的色散曲線的位置，使兩者相交?？衫霉鈱W(xué)耦合器件，如棱鏡、光柵以及光學(xué)波導(dǎo)器件達(dá)到這一目的。棱鏡耦合

棱鏡是SPR探討中應(yīng)用最為廣泛的光學(xué)耦合器件。棱鏡由高折射率的非吸取性的光學(xué)材料構(gòu)成，其底部鍍有厚度為50nm左右的高反射率的金屬薄膜（一般為金或銀），膜下面是電介質(zhì)。在SPR傳感器中，該電介質(zhì)即為待測樣品。由光源發(fā)出的p-偏振光以確定的角度θ0入射到棱鏡中，在棱鏡與金屬的界面處將發(fā)生反射和折射。當(dāng)θ0大于臨界角θc時，光線將發(fā)生全內(nèi)反射，即全部返回到棱鏡中，然后，從棱鏡的另一個側(cè)面折射出去。這里入射光應(yīng)當(dāng)用p-偏振光，因為其電場重量與界面垂直，這與表面等離子體波的狀況一樣。在全內(nèi)反射的狀況下，電場在金屬與棱鏡的界面處并不馬上消逝，而是向金屬介質(zhì)中傳輸振幅呈指數(shù)衰減的消逝波。該消逝波沿X軸方向傳播的與表面平行的波矢重量kev為：通過調(diào)整θ0或ωa，可使kev=kspw，消逝波與表面等離子體波共振，即表面等離子體子共振，有：由上式可見，若入射光的波長確定，即ωa確定時，ns變更，則必需變更θ0以滿足共振條件；若θ0確定時，ns變更，則必需變更ωa以滿足共振條件，這可通過變更入射光的波長λ來實現(xiàn)。此時θ0和λ分別稱為共振角和共振波長。典型的SPR光譜目錄3-1表面等離子體共振（SPR）的產(chǎn)生 3-1-1SPR簡史 3-1-2金屬內(nèi)部的等離子體振動 3-1-3金屬表面的等離子體振動 3-1-4產(chǎn)生表面等離子體共振的方法3-2SPR傳感器的基本概念

3-2-1傳感器的基本原理 3-2-2傳感器的基本結(jié)構(gòu)3-3典型的SPR傳感器及其應(yīng)用3-2-1傳感器的基本原理表面等離子體子共振的產(chǎn)生與入射光的角度θ、波長、金屬薄膜的介電常數(shù)s及電介質(zhì)的折射率ns有關(guān)，發(fā)生共振時θ和分別稱為共振角度和共振波長。對于同一種金屬薄膜，假如固定θ，則與ns有關(guān)；固定，則θ與ns有關(guān)。假如將電介質(zhì)換成待測樣品，測出共振時的θ或，就可以得到樣品的介電常數(shù)s或折射率ns；假如樣品的化學(xué)或生物性質(zhì)發(fā)生變更，引起ns的變更，則θ或也會發(fā)生變更，這樣，檢測這一變更就可獲得樣品性質(zhì)的變更。固定入射光的波長，變更入射角，可得到角度隨反射率變更的SPR光譜；同樣地，固定入射光的角度，變更波長，可得到波長隨反射率變更的SPR光譜。SPR光譜的變更反映了體系性質(zhì)的變更。3-2-2傳感器的基本結(jié)構(gòu)一般來說，一個SPR傳感器的包括：光學(xué)系統(tǒng)、敏感元件、數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)。SPR傳感器的光學(xué)部分包含光源、光學(xué)耦合器件、角度（或波長）調(diào)整部件以及光檢測器件，用于產(chǎn)生SPR并檢測SPR光譜的變更。敏感元件主要指金屬薄膜及其表面修飾的敏感物質(zhì)，用于將待測對象的化學(xué)或生物信息轉(zhuǎn)換成折射率的變更，是SPR傳感器的關(guān)鍵。從SPR的原理可知，事實上是樣品的折射率的變更引起SPR光譜的變更。假如金屬薄膜未經(jīng)任何修飾，這樣的傳感器是沒有什么選擇性的，只能用于一些簡潔體系的測定，因而一般都要進(jìn)行修飾，以獲得對被測對象的選擇性識別實力。數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)用于采集和處理光檢測器產(chǎn)生的電子信號?，F(xiàn)在光檢測器越來越多地接受陣列檢測器，如光電二極管陣列和電荷耦合器件，以便同時檢測多個角度或波特長的信號變更。數(shù)據(jù)采集和處理均由計算機(jī)完成。4種檢測方式角度調(diào)制：固定λin，變更θin波長調(diào)制：固定θin，變更λin強(qiáng)度調(diào)制：固定θin、λin，變更光強(qiáng)相位調(diào)制：固定θin、λin，測相差一個SPR傳感器的主要性能特點，如靈敏度、穩(wěn)定性、辨別率、選擇性和響應(yīng)時間等，取決于其各個組成部分的性能。SPR傳感器運(yùn)用時，一般是先在金屬薄膜表面修飾一層敏感物質(zhì)，以便與樣品中的待測組分選擇性地作用。這一相互作用會引起敏感層折射率的變更，導(dǎo)致SPR信號的變更，從而獲得待測樣品的化學(xué)或生物信息。假如不對金屬薄膜進(jìn)行修飾，這樣的傳感器也可用于一些簡潔體系的檢測，如一些濃度隨折射率變更的溶液（乙醇、蔗糖、葡萄糖等的水溶液）。金和銀相對來說比較穩(wěn)定，且反射率高，是比較常用的兩種金屬。在生物體系的測量中，常常有氯離子存在，用銀膜不太合適，一般都用金膜。目錄3-1表面等離子體共振（SPR）的產(chǎn)生 3-1-1SPR簡史 3-1-2金屬內(nèi)部的等離子體振動 3-1-3金屬表面的等離子體振動 3-1-4產(chǎn)生表面等離子體共振的方法3-2SPR傳感器的基本概念

3-2-1傳感器的基本原理 3-2-2傳感器的基本結(jié)構(gòu)3-3典型的SPR傳感器及其應(yīng)用ComputerPrismLCPDGCCDAuBSample

inSampleoutGlassslideAufilmPrism0.1mmL：鹵鎢燈；C：平行光管；P：偏振片；D：光闌；G：光柵；B：玻片基于波長調(diào)制的SPR傳感器裝置葡萄糖溶液的測定SPR光譜（葡萄糖，銀膜）響應(yīng)曲線（葡萄糖，銀膜）裸金屬膜對其表面溶液的折射率變更特別敏感，可用于一些簡潔樣品的分析，此處用SPR傳感器測定了醫(yī)用葡萄糖注射液的濃度。該法所得結(jié)果與藥典法相符，可用于葡萄糖注射液生產(chǎn)過程的實時在線監(jiān)測。乙肝表面抗原（HBsAg）的測定病毒性肝炎是人群中最常見的傳染性疾病之一，對人體健康危害很大。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，人群總感染率高達(dá)60%，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）攜帶者至少有1.2億，其中約10%最終轉(zhuǎn)化為各種慢性肝病，包括慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。作為乙型肝炎的早期診斷指標(biāo)之一，HBsAg的測定在臨床上具有重要意義。目前用到的臨床檢驗方法有：血細(xì)胞凝集法（PHA、RPHA）、酶聯(lián)免疫法（EIA、ELISA）、放射免疫法（RIA）、全血凝集法、斑點雜交法、聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）等等，其中放射免疫法較為靈敏，可檢出血清中0.1ng/mL的HBsAg，但存在放射性污染的問題。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）由于簡潔、便利、快速，目前是臨床診斷中最常用的，其檢出限一般為1ng/mLHBsAg。假如能進(jìn)一步提高靈敏度，對及早發(fā)覺、診斷和治療乙型肝炎無疑具有特別重要的意義。利用胱胺將HBsAg單克隆抗體固定于金膜表面以A蛋白為連接層固定HBsAg單克隆抗體M：金膜，G：玻片，Ag：血清中的HBsAg，Ab：HBsAg單克隆抗體，PA：A蛋白胱胺固定法中HBsAg與抗體結(jié)合前后的SPR光譜圖檢測限為0.01ng/mL固定化DNA單層的電致開關(guān)行為探討固定化DNA探針的取向干脆影響到固液兩相之間的DNA雜交。固定化DNA易于被電場驅(qū)動遠(yuǎn)離或靠近固體表面，構(gòu)成一種納米尺度上的“開關(guān)”。SPR傳感技術(shù)是一種對金屬薄膜表面介質(zhì)層的折射率變更極為敏感的光學(xué)傳感技術(shù),特別適合于探討固定化單分子層的性質(zhì)。然而，假如在SPR傳感器中運(yùn)用經(jīng)典的三電極體系施加電場，對金膜本身的SPR光譜有較大影響。Knolletal.Langmuir2005,21:348-353ComputerPrismLCPDGCCDAuBSample

inSampleoutITOfilmGlassslideAufilmPrism1.34mm1.48mmEL：鹵鎢燈；C：平行光管；P：偏振片；D：光闌；G：光柵；E：直流電源；B：ITO導(dǎo)電玻璃Auglass++Au++

Au

conductivelayerglassconductivelayer++++glassconductivelayer----（A）金膜不帶電荷；（B）金膜帶負(fù)電荷；（C）金膜帶正電荷.ABC金膜表面固定化DNA探針的取向電場對金膜表面固定化DNA探針的作用

（a）金膜帶正電荷；（b）斷開電路；（c）金膜帶負(fù)電荷；（d）斷開電路.不同強(qiáng)度的電場對DNA探針的作用電場在-1.5V與1.5V間切換（1）金膜帶負(fù)電荷；（2）金膜帶正電荷（1）金膜帶負(fù)電荷；（2）金膜不帶電荷；（3）金膜帶正電荷.不同強(qiáng)度的電場對固定化DNA探針捕獲cDNA的影響電場對不同濃度cDNA雜交的影響E=1.5VCDNA=2.83nM電場對DNA雜交的作用表面覆蓋率的影響

電場（金膜與ITO導(dǎo)電玻璃之間電位差為1.5V）對不同表面覆蓋率的DNA探針的作用5.871012

電場（金膜與ITO導(dǎo)電玻璃之間的電位差為1.5V）對不同表面覆蓋率的DNA雜交的影響，cDNA濃度為5.65nmol/L基于SiO2包被金膜的納米金顆粒催化增長增加SPR傳感器及其DNA檢測應(yīng)用(Biosens.Bioelectron.2007,22,1106-1110)SiO2AuabNADH+HAuCl4dc(a)生物素化的DNA探針；(b)目標(biāo)DNA；(c)巰基DNA修飾的納米金顆粒；(d)納米金顆粒催化增長.SiO2包被金膜的納米金顆粒催化增長增加SPR傳感檢測DNA原理示意圖SiO2層對金沉積的阻擋作用

金膜SiO2包被的金膜（1）與催化增長試劑反應(yīng)前；（2）與催化增長試劑反應(yīng)后SPR傳感器:(a)cDNA,(a’)單堿基錯配DNA,(a’’)隨機(jī)DNA；納米金顆粒增加SPR傳感器:(b)cDNA,(b’)單堿基錯配DNA,(b’’)隨機(jī)DNA；納米金顆粒催化增長增加SPR傳感器:(c)cDNA,(c’)單堿基錯配DNA,(c’’)隨機(jī)DNA.不同方法檢測DNA的比較(a)cDNA；(b)單堿基錯配DNA；(c)隨機(jī)DNA；三種傳感器分別為(I)納米金顆粒催化增長增加SPR傳感器；(II)納米金顆粒增加SPR傳感器；(III)SPR傳感器.CDNA=3.3nMSensors&Actuators2007,123,227-232.(a)金膜；(b)聚電解質(zhì)自組裝多層膜(PAH/PSS)3；(c)親和素；(d)生物素化的DNA探針；(e)目標(biāo)DNA；(f)巰基DNA修飾的納米金顆粒；(g)納米金顆粒催化增長.NADH+HAuCl4gdcbafe基于聚電解質(zhì)自組裝多層膜修飾金膜的納米金顆粒催化增長增加SPR傳感器及其DNA檢測應(yīng)用聚電解質(zhì)自組裝薄膜對金屬沉積的阻擋作用不同層數(shù)的(PAH/PSS)修飾的金膜對金屬沉積的阻擋作用SPR傳感器:(a)cDNA,(a’)單堿基錯配DNA,(a’’)隨機(jī)DNA；納米金顆粒增加SPR傳感器:(b)cDNA,(b’)單堿基錯配DNA,(b’’)隨機(jī)DNA；納米金顆粒催化增長增加SPR傳感器:(c)cDNA,(c’)單堿基錯配DNA,(c’’)隨機(jī)DNA.(a)cDNA；(b)單堿基錯配DNA；(c)隨機(jī)DNA；三種傳感器分別為(I)納米金顆粒催化增長增加SPR傳感器；(II)納米金顆粒增加SPR傳感器；(III)SPR傳感器.CDNA=3.3nM不同方法檢測DNA的比較（1）氨基修飾的DNA探針固定在金膜表面后的SPR光譜；（2）與33nmol/LcDNA雜交之后的SPR光譜；（3）再與納米金顆粒標(biāo)記的巰基DNA反應(yīng)之后的SPR光譜；（4）在Au膜（vsITO導(dǎo)電玻璃）電位為-10V時用6×SSC緩沖溶液反復(fù)沖洗后的SPR光譜；（5）再生處理后的SPR光譜金膜在金膜帶負(fù)電的情況下反復(fù)沖洗DNA探針納米金顆粒標(biāo)記的巰基DNAacDNAa’b’a’b’baa’abbb’aa’再生cDNA:5-GGTTGTGAGGCGCTGCCCAAGCGA-3

Analyst2008,133（9):1274-1279基于納米金顆粒協(xié)助的電洗脫識別單堿基錯配DNA（1）氨基修飾的DNA探針固定在金膜表面后的SPR光譜；（2）與33nMsmDNA1雜交之后的SPR光譜；（3）再與納米金顆粒標(biāo)記的巰基DNA反應(yīng)之后的SPR光譜；（4）在Au膜（vsITO導(dǎo)電玻璃）電位為-8V時用6×SSC緩沖溶液反復(fù)沖洗后的SPR光譜；（5）再生處理后的SPR光譜金膜在金膜帶負(fù)電的情況下反復(fù)沖洗DNA探針納米金顆粒標(biāo)記的巰基DNAab再生smDNAa’b’’a’b’’aa’b’’bab’’a’asmDNA1:5-GGTTGTGAGGCGGTGCCCAAGCGA-3

錯配位點在與納米金顆粒標(biāo)記的巰基DNA相對應(yīng)部分smDNAa’’b’a’’b’baa’’b’aa金膜在金膜帶負(fù)電的情況下反復(fù)沖洗DNA探針納米金顆粒標(biāo)記的巰基DNAab再生smDNA6:5-GGTTGTGAGGCCCTGCCCAAGCGA-3

（1）氨基修飾的DNA探針固定在金膜表面后的SPR光譜；（2）與33nMsmDNA1雜交之后的SPR光譜；（3）再與納米金顆粒標(biāo)記的巰基DNA反應(yīng)之后的SPR光譜；（4）在Au膜（vsITO導(dǎo)電玻璃）電位為-10V時用6×SSC緩沖溶液反復(fù)沖洗后的SPR光譜；（5）再生處理后的SPR光譜錯配堿基在與金膜表面固定化DNA探針相對應(yīng)的部分（1）與33n