鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中檢測方法與檢測試劑的相關(guān)問題,職稱論文內(nèi)容摘要：2022年11月，北京市經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)確診2例鼠疫病例，根據(jù)患者的流行病學(xué)史與臨床表現(xiàn)確以為輸入性肺鼠疫，這是建國后肺鼠疫初次輸入北京市。該起疫情中實(shí)驗(yàn)室檢測發(fā)揮了重要作用，本文簡單介紹此次疫情中的實(shí)驗(yàn)室檢測經(jīng)過并重點(diǎn)討論鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中檢測方式方法與檢測試劑的相關(guān)問題。本文關(guān)鍵詞語：鼠疫;實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn);北京;DiscussiononplaguelaboratoryexaminationLUYan-ningLIFuSUNYu-lanZHANGDai-taoLIRen-qingDOUXiang-fengPANGXing-huoWANGQuan-yiCHENLi-juanBeijingCenterforDiseaseControlandPrevention/BeijingCenterforPreventiveMedicineResearchAbstract：InNovember,2022,twoimportedpneumonicplaguecaseswereconfirmedbylaboratorytestingtogetherwiththeepidemiologyhistoryandclinicalmanifestationofthepatients,whichisthefirsttimethatpneumonicplaguehasbeenimportedintoBeijingsincethefoundingofthePeoplesRepublicofChina.Laboratoryverificationplayedanimportantroleinfightingtheoutbreakingofimportedpneumonicplague.Inthispaper,thelaboratorytestingprocesswasintroducedbriefly,andtheproblemsrelatingtolaboratoryexaminationofplaguewasthendiscussed,focusingspeciallyontheproblemsinthedetectionmethodandreagents.2022年11月12日，北京市經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)確診2例鼠疫病例，根據(jù)患者流行病學(xué)史與臨床表現(xiàn)確以為輸入性肺鼠疫病例。這是新中國成立70年來，鼠疫病例初次進(jìn)入北京市。鼠疫是由鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)引起的自然疫源性疾病，因其傳染性強(qiáng)、傳播速度快、病死率高，而被列為法定甲類傳染病之首。早期發(fā)現(xiàn)人間鼠疫的感染，需要快速、敏感、特異、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測方式方法，這對鼠疫疫情的防控極為重要。在北京市本起輸入性疫情處置中，北京市疾病預(yù)防控制中心(CDC)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)現(xiàn)行鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)中的方式方法對相關(guān)樣本進(jìn)行了檢驗(yàn)，在四個(gè)小時(shí)內(nèi)完成了病例樣本的實(shí)驗(yàn)室檢測工作，為疫情處置提供了確實(shí)有效的根據(jù)。但檢測中暴露出的一些問題仍值得進(jìn)一步討論。1病例及樣本信息2例病例為夫妻關(guān)系，男性病例43歲，女性病例46歲，均為牧民。男性病例10月25日在內(nèi)蒙古發(fā)病，女性病例在護(hù)理男性病例后于10月31日發(fā)病。首發(fā)異常感覺和狀態(tài)均為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、痰中帶血絲，胸悶、憋氣、全身乏力、肌肉酸痛，體溫最高39.5℃，伴寒戰(zhàn)，病情均急劇惡化，治療中均使用了抗生素。2例病例在11月3日乘坐同一輛救護(hù)車由內(nèi)蒙古到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院就診。11月11日采集兩位病例的非抗凝全血、EDTA抗凝全血及痰樣本，送至北京市CDC實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。2檢測根據(jù)及實(shí)驗(yàn)方式方法2.1檢測根據(jù)以(鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)WS279-2008〕附錄B、C、D、E、F為檢測根據(jù)。2.2實(shí)驗(yàn)方式方法2.2.1鼠疫F1抗原檢測:采用膠體金法[鼠疫菌抗原檢測試劑(膠體金法)，北京金豪制藥股份有限公司]、反相血凝試驗(yàn)[鼠疫菌F1抗原診斷試劑盒(反相血凝法)，蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司]以及ELISA法[鼠疫耶爾森菌F1抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司]進(jìn)行鼠疫菌F1抗原的檢測。詳細(xì)方式方法參照試劑盒講明書進(jìn)行。2.2.2鼠疫F1抗體檢測:采用膠體金法[鼠疫抗體檢測試劑(膠體金法)，北京金豪制藥股份有限公司]、間接血凝試驗(yàn)[鼠疫菌F1抗體診斷試劑盒(間接血凝法)，蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司]以及ELISA法[鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司]進(jìn)行鼠疫F1抗體的檢測。詳細(xì)方式方法參照試劑盒講明書進(jìn)行。2.2.3鼠疫菌特異性核酸檢測:采用三種商品化鼠疫桿菌核酸檢測試劑盒(熒光PCR法，中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，深圳生科原生物股份有限公司，江蘇碩世生物科技股份有限公司)以熒光PCR法檢測鼠疫菌的特異性基因。詳細(xì)方式方法參照試劑盒講明書進(jìn)行。2.2.4鼠疫菌分離培養(yǎng):以哥倫比亞血平板(英國OXOID公司，貨號(hào)PB0123A)對痰及抗凝血進(jìn)行劃線培養(yǎng)。同時(shí)將抗凝血接種需氧雙向血培養(yǎng)瓶(鄭州安圖生物工程股份有限公司)進(jìn)行培養(yǎng)。3實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)3.1樣本采集此次疫情中，病例樣本采集了痰、抗凝血與非抗凝血。華而不實(shí)對痰和抗凝血提取了核酸并進(jìn)行基因檢測;非抗凝血分離了血清，進(jìn)行抗原和抗體檢測。同時(shí)抗凝血分離了少量血漿進(jìn)行了抗原檢測。3.2檢驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)室接到樣本后，首先進(jìn)行樣本的前處理，非抗凝血離心分離血清，抗凝血和痰樣本進(jìn)行核酸提取。血清分離后，首先在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行抗原、抗體的膠體金法檢測，然后取適量樣本56℃、30min滅活，以備后續(xù)用于血凝試驗(yàn)及ELISA試驗(yàn)。將痰與抗凝血?jiǎng)澗€接種于哥倫比亞血平板進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，同時(shí)將抗凝血接種于血培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。核酸提取后，配制反響體系，加樣，上機(jī)反響。然后進(jìn)行反相血凝試驗(yàn)和間接血凝試驗(yàn)進(jìn)行抗原、抗體檢測。在反相血凝試驗(yàn)和間接血凝試驗(yàn)的孵育時(shí)間內(nèi)采用ELISA法進(jìn)行抗原、抗體的檢測。鼠疫疫情的實(shí)驗(yàn)室檢測要求快速與準(zhǔn)確，此檢驗(yàn)流程使時(shí)間利用效益最大化，能夠在最短時(shí)間內(nèi)獲得檢測結(jié)果。由于鼠疫的檢測項(xiàng)目與檢測方式方法較多，時(shí)間與人員布置要合理以保證在最短時(shí)間內(nèi)獲得可靠的檢測結(jié)果。3.3檢測結(jié)果男性病例痰樣本的核酸檢測陽性，血漿鼠疫抗原膠體金檢測陽性，血清鼠疫F1抗原反相血凝法檢測陽性，血清鼠疫F1抗體三種方式方法檢測均陽性。女性病例血清鼠疫F1抗體三種方式方法檢測均陽性。其余檢測項(xiàng)目均為陰性。3.4生物安全防護(hù)在中國衛(wèi)生部2006年制定的(人間傳染的病原微生物名錄〕中，鼠疫菌是危害程度分類為第二類的病原微生物，屬高致病性病原微生物，根據(jù)該文件的規(guī)定，該類樣本的檢測能夠在生物安全二級(BSL-2)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，大量活菌操作和動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)要在生物安全三級(BSL-3)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。此次疫情中，所有的實(shí)驗(yàn)操作均在負(fù)壓生物安全二級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。人員防護(hù)采用連體式防護(hù)服，同時(shí)佩戴帽子、N95口罩、防護(hù)眼鏡及雙層手套。4鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中存在的問題4.1樣本采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示痰樣本核酸檢測效果優(yōu)于血樣本，因而對懷疑肺鼠疫的病例除了采集血液樣本外，一定要采集呼吸道樣本，如痰或下呼吸道樣本。以血漿進(jìn)行膠體金法抗原檢測結(jié)果優(yōu)于血清，因而血漿可作為膠體金法抗原檢測的一個(gè)備選樣本。對于疑似鼠疫的病例，應(yīng)盡早并盡量將所有能采集到的樣本及時(shí)采集并保存。由于鼠疫菌對當(dāng)前常用的抗生素均敏感[1,2]，應(yīng)用抗生素后，較難培養(yǎng)出鼠疫菌，因而一定要在抗生素使用之前采集樣本做細(xì)菌的分離培養(yǎng)。4.2檢測方式方法鼠疫檢驗(yàn)包括細(xì)菌學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)三個(gè)方面。鼠疫固然是傳染病防控中極為重要的一個(gè)疾病，被列為法定甲類傳染病之首，但鼠疫的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)一直沿用一些老方式方法，鼠疫的診斷也一直采用經(jīng)典的四步檢驗(yàn)與血清學(xué)方式方法。4.2.1細(xì)菌學(xué)檢測:作為鼠疫確診的金標(biāo)準(zhǔn)，在鼠疫檢測中發(fā)揮主導(dǎo)作用[3]。四步檢驗(yàn)法包括顯微鏡涂片檢查、分離培養(yǎng)、鼠疫噬菌體裂解試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，耗時(shí)長，敏感性差，而且由于抗生素的早期廣泛使用，鼠疫菌在臨床樣本中的分離率越來越低，僅依靠病原分離來確診鼠疫是不夠的，也不合適人間突發(fā)疫情的應(yīng)急檢測。4.2.2血清學(xué)檢測:抗原、抗體檢測采用了膠體金法、血凝試驗(yàn)和ELISA法進(jìn)行。采用三種方式方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果能夠互相印證與補(bǔ)充，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。假如依靠F1抗體檢測結(jié)果來做確診，需要拿到急性期和恢復(fù)期雙份血清，因而此法僅適用于回首性診斷，而不適用于突發(fā)疫情的應(yīng)急處置。另有研究發(fā)現(xiàn)部分正常人群中可檢測出高滴度的F1抗體[4]，因而其特異性也值得討論。而F1抗原檢測，由于抗生素的使用，患者體內(nèi)鼠疫菌增殖受限，菌量少，樣本中F1抗原的含量也低，無論是使用膠體金法、血凝試驗(yàn)還是ELISA法檢測，都存在一些問題。鼠疫血清學(xué)檢測固然具有簡單、快速、試劑易標(biāo)準(zhǔn)化、可現(xiàn)場操作等優(yōu)點(diǎn)，但由于試劑質(zhì)量、操作者經(jīng)歷體驗(yàn)等原因會(huì)導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。此次疫情處置中，在首發(fā)病例報(bào)告后啟動(dòng)的后續(xù)病例篩查檢測中，膠體金抗原檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果，而ELISA法檢測F1抗原的敏感性不高，反相血凝試驗(yàn)的敏感性固然略高于ELISA法，但操作復(fù)雜，最好由有經(jīng)歷體驗(yàn)的人員進(jìn)行，且耗時(shí)長，結(jié)果判定也受主觀因素影響。4.2.3分子生物學(xué)檢測:具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，對于鼠疫的診斷具有重要作用[5]，進(jìn)而越來越多地應(yīng)用在鼠疫的應(yīng)急檢測中，但對樣本的采集部位及樣本質(zhì)量依靠性高。此次疫情中，由于抗生素的使用抑制了鼠疫菌的增殖，因而女性病例的樣本中未檢測到鼠疫菌F1抗原，也未檢測到鼠疫菌的核酸，最終也未分離到鼠疫菌，由此可見分子生物學(xué)的檢測結(jié)果與其他方式方法的病原學(xué)檢測結(jié)果是一致的。此次疫情中核酸檢測未采用標(biāo)準(zhǔn)中的普通PCR法，而是采用了實(shí)時(shí)熒光PCR法，不僅能夠提高檢測的靈敏性，還可大大縮短檢測時(shí)間。同時(shí)采用三個(gè)不同品牌的商品化試劑盒，以Taqman探針法的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測鼠疫菌的不同基因位點(diǎn)，包括helix-turn-helixdomaincontainingprotein、caf1和pla基因，可提高檢測的特異性和敏感性，檢測結(jié)果互相印證，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，高通量測序技術(shù)越來越多地用于感染性疾病的病原篩查，并且經(jīng)常能獲得重要線索[6,7]。因而，在當(dāng)下新技術(shù)不斷涌現(xiàn)的情況下，針對鼠疫這個(gè)古老的疾病也需要投入經(jīng)費(fèi)和精神研發(fā)一些更好的檢測方式方法和檢測試劑，以應(yīng)對各種突發(fā)疫情的不同狀況。而鼠疫的診斷標(biāo)準(zhǔn)也需要與時(shí)俱進(jìn)做一些修改，除了關(guān)注細(xì)菌學(xué)、血清學(xué)的指標(biāo)和方式方法外，應(yīng)引入一些分子生物學(xué)方式方法和指標(biāo)，比方將高通量測序的方式方法和結(jié)果納入鼠疫確診根據(jù)。4.3試劑儲(chǔ)備鼠疫是重要傳染病，但也是少發(fā)病，鼠疫各種檢測試劑的效期并不長，日常實(shí)驗(yàn)室中少量的試劑儲(chǔ)備和更新是必需的。一旦有疫情發(fā)生，試劑的需求量將大大增加，因而檢測試劑的儲(chǔ)備方案也是一個(gè)值得討論的問題。儲(chǔ)備哪些試劑，儲(chǔ)備多少量，儲(chǔ)備在哪個(gè)層級，都是值得商榷的問題，并應(yīng)有施行方案和應(yīng)急措施。4.4技術(shù)儲(chǔ)備在新的時(shí)代，各種治療手段的早期干涉，十分是抗生素的使用，使鼠疫在流行病學(xué)方面或在臨床醫(yī)學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)方面都展現(xiàn)出新的特征。有必要利用當(dāng)代前沿的技術(shù)手段愈加迅速地辨別與控制疾病的流行，因而應(yīng)緊跟檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展的步伐，建立愈加前沿的技術(shù)儲(chǔ)備，包括分子生物學(xué)技術(shù)方面，如高通量測序技術(shù)、各種高通量多病原篩查技術(shù)、飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)以及免疫學(xué)方面的檢測技術(shù)，如上轉(zhuǎn)發(fā)光、免疫熒光、酶聯(lián)免疫等抗原抗體檢測技術(shù)，以應(yīng)對各種形式的突發(fā)疫情。4.5人員儲(chǔ)備對于鼠疫這類重點(diǎn)傳染病，固然是少發(fā)病，但是保證必要的技術(shù)人員儲(chǔ)備是必需的。要有熟練把握鼠疫相關(guān)檢測技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室工作人員，并能保證定期參加專業(yè)培訓(xùn)以維持其技術(shù)能力和知識(shí)更新，并能作為師資氣力在突發(fā)疫情發(fā)生時(shí)可應(yīng)急培訓(xùn)相關(guān)人員以加強(qiáng)檢驗(yàn)隊(duì)伍的氣力，為疫情處置提供堅(jiān)實(shí)的后盾。4.6實(shí)驗(yàn)室條件鼠疫菌為高致病性病原微生物，固然基本的臨床樣本的檢測工作能夠在BSL-2實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，但根據(jù)相關(guān)法律法規(guī)的規(guī)定，一些愈加深切進(jìn)入的工作(如一些難培養(yǎng)的樣本要進(jìn)行動(dòng)物接種分離培養(yǎng))則需要在生物安全級別更高層次的實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行。因而高級別的生物安全實(shí)驗(yàn)室對鼠疫檢測工作的順利開展是愈加完備的配置。鼠疫迄今仍嚴(yán)重威脅人類的生命與健康，鼠疫的預(yù)防與控制仍然是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重要任務(wù)。實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)是發(fā)現(xiàn)和證實(shí)鼠疫的重要手段，也是防制和治療鼠疫的主要根據(jù)。檢測的準(zhǔn)確性與及時(shí)性，具體表現(xiàn)出著鼠疫防治工作的總體水平和成效。因而，在鼠疫突發(fā)疫情的應(yīng)急檢測中應(yīng)優(yōu)化檢驗(yàn)流程，綜合判定各種檢測結(jié)果，進(jìn)而快速準(zhǔn)確地做出疫情研判，啟動(dòng)后續(xù)的防控工作，持續(xù)改良鼠疫的實(shí)驗(yàn)室檢測方式方法，提高檢驗(yàn)檢測的水平。以下為參考文獻(xiàn)[1]BUTLERT.Plaguegivessurprisesinthefirstdecadeofthe21stcenturyintheUnitedStatesandworldwide[J].AmJTropMedHyg,2020,89(4):788-793．[2]BUTLER,THOMAS.Plagueintothe21stcentury[J].ClinInfectDis,2018,49(5):736-742．[3]王艷華，海榮，夏連續(xù)，等．4種