文件編號(hào)無菌檢查法頒發(fā)部門XXXXXXX/X總頁數(shù)執(zhí)行日期編制者審核者批準(zhǔn)者編制日期審核日期批準(zhǔn)日期目的：建立對(duì)成品無菌檢查的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。范圍：對(duì)成品的無菌檢查。責(zé)任：質(zhì)量監(jiān)督部。4.內(nèi)容：4.1概述：無菌檢查是檢查藥品與敷料是否染有活菌的一種方法。無菌檢查的操作環(huán)境和全部過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，同時(shí)也應(yīng)避免在有抑菌條件下操作。4.2儀器、設(shè)備和用具：4.2.1無菌室分無菌操作室和緩沖間。在緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆、干手器、無菌衣褲放置架及掛鉤、拖鞋等。無菌操作室應(yīng)具有空氣除菌過濾的層流裝置，局部潔凈度100級(jí)或放置同等級(jí)別的超凈工作臺(tái)。室內(nèi)溫控（25＋2）℃及除濕裝置。緩沖間及操作室內(nèi)均設(shè)置能達(dá)到空氣消毒的紫外光燈和照明燈，操作室或工作臺(tái)應(yīng)保持空氣正壓。4.2.1.1無菌室應(yīng)每周和每次操作前用0.1％新潔爾滅或2％甲酚液擦拭操作臺(tái)及可能污染的死角，開動(dòng)無菌空氣過濾器及紫外光燈殺菌1小時(shí)。在每次操作完畢，同樣用2％甲酚或0.1％新潔爾滅溶液擦拭工作臺(tái)面，除去室內(nèi)濕氣，用紫外光燈殺菌半小時(shí)。4.2.1.2無菌室的無菌程度檢查：無菌室在消毒處理后，無菌試驗(yàn)前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù)。取直徑90mm雙碟，在接種室內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將雙碟半開注入溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml，制成平板：在35-37℃預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，證明無菌后將3個(gè)平板以無菌方式帶入無菌操作間的潔凈區(qū)域左、中、右各放1個(gè)；打開碟蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將蓋蓋好，置35-37℃培養(yǎng)48小時(shí)，取出檢查，3個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)相加總數(shù)不得超過10個(gè)。無菌操作臺(tái)面或超凈工作臺(tái)應(yīng)定期請(qǐng)有關(guān)部門檢測(cè)其潔凈度，應(yīng)達(dá)到100級(jí)（一般用塵埃粒子計(jì)數(shù)儀），檢測(cè)塵埃粒徑≤5μm的粒數(shù)不得超過3.5個(gè)／升；空氣流量應(yīng)控制在0.75-1.0m34.2.1.3無菌室內(nèi)應(yīng)準(zhǔn)備好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精燈、火柴、鑷子、75％酒精棉、碘酒棉及拖鞋等。4.2.2恒溫培養(yǎng)箱及可調(diào)20-25℃的生化培養(yǎng)箱。4.2.3離心機(jī)、顯微鏡、高壓消毒爐、標(biāo)準(zhǔn)pH比色器（0.02酚紅指示劑和溴鉀酚藍(lán)指示劑）、恒溫烤箱。4.2.4玻璃器皿：試管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管（1.5.10ml）、注射器（2.5.10ml）、雙碟等，用玻璃洗滌劑或清潔液浸泡，水洗3次。使用過后如與細(xì)菌接觸，應(yīng)先消毒倒出內(nèi)容物后再清洗，晾干。凡無菌操作過程中所用的器皿，都應(yīng)包扎嚴(yán)密，121℃滅菌30分鐘。4.2.4.1移管、刻度吸管在管口上端內(nèi)，松松地塞入少許棉花，然后放于吸管筒內(nèi)或牛皮紙袋內(nèi)，蓋嚴(yán)，消毒備用。4.2.4.2試管、離心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上海棉膠專用塞或紗布棉塞，塞子應(yīng)塞進(jìn)管口內(nèi)2／3處，用牛皮紙將管口（包括塞子）包扎嚴(yán)，消毒備用。4.2.4.3注射器、針頭（9號(hào)、11號(hào)、12號(hào)）：將注射器與針頭配對(duì)，先試驗(yàn)抽氣、排氣是否暢通后，將注射芯、管和針頭分別放在雙層紗布（或布）內(nèi)，包扎嚴(yán)密，置帶蓋容器（瓷盤或鋁制飯盒）內(nèi)，蓋嚴(yán)，用牛皮紙包扎，消毒備用。4.2.5無菌衣、褲、帽、口罩等洗凈晾干，配套，用牛皮紙包嚴(yán)，消毒備用或用一次性的物品代替。4.2.6長(zhǎng)柄取樣匙，放于長(zhǎng)的玻璃筒（或不銹鋼長(zhǎng)筒內(nèi)），蓋嚴(yán)，干熱滅菌備用。4.2.7手術(shù)鑷、手術(shù)剪洗凈，擦干。用雙層紗布將1把剪刀與1個(gè)鑷子間隔包扎在一起，放于帶蓋的容器（瓷盒或鋁制飯盒）內(nèi)，蓋嚴(yán)，用牛皮紙包扎，滅菌備用。4.2.8用具的滅菌：將包扎妥的用具(另有規(guī)定除外），在(121±0.5）℃蒸氣滅菌30分鐘，物品取出時(shí)切勿立即置冷處，以免急速冷卻，使滅菌物品內(nèi)蒸氣冷凝造成負(fù)壓，易致染菌，應(yīng)置恒溫培養(yǎng)箱中烘干。適于高溫滅菌的器皿也可采用160℃干熱滅菌2小時(shí)。4.3試液：4.3.175％乙醇溶液配制酒精棉球用。4.3.2碘酊溶液配制碘酒棉球用。4.3.3滅菌生理鹽水0.9％氯化鈉溶液，分裝于試管或三角瓶中，瓶口用棉塞或海棉膠專用塞塞緊并用牛皮紙包扎，滅菌備用。4.3.4新潔爾爾滅（1:1000）溶液。4.3.53-5％甲酚溶液。4.3.60.02％酚紅指示劑pH6.8-8.4系列比色液管。4.3.7溴鉀酚藍(lán)指示劑pH6.0-7.6系列比色液管。4.3.82mol／L鹽酸溶液。4.3.92mol／L氫氧化鈉溶液。4.4培養(yǎng)基：4.4.1一般采用商品干燥培養(yǎng)基，臨用時(shí)按照使用說明書進(jìn)行配制，需注意培養(yǎng)基的pH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必須校正后，滅菌使用。4.4.2新鮮配制的培養(yǎng)基，應(yīng)按中國(guó)藥典規(guī)定的處方，對(duì)培養(yǎng)基原材料要進(jìn)行挑選，化學(xué)藥品均需用CP試劑規(guī)格。4.4.2.1除葡萄糖和指示劑外，將處方中各成分加水后置有石棉網(wǎng)的電爐或適宜的加熱設(shè)備中，使微溫溶解。用2mol/L鹽酸溶液或2mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，使其比規(guī)定的pH值略高0.4-0.6，煮沸，用棉（紙）漿減壓抽濾或以脫脂棉、濾紙等濾材過濾，使培養(yǎng)基澄清。4.4.2.2加入葡萄糖和指示劑溶液，搖勻，補(bǔ)足水量，調(diào)節(jié)pH值（比規(guī)定的pH值略高0.2-0.4），使滅菌后為7.1±0.2，分裝，裝量不宜超過容器的2／3，以免滅菌時(shí)溢出。4.4.3培養(yǎng)基靈敏度檢查：新購(gòu)的干燥培養(yǎng)基或采用不同牌號(hào)原材料的新鮮培養(yǎng)基，其質(zhì)量均應(yīng)符合靈敏度檢查要求。A需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基，用藤黃微球菌和生孢梭菌兩種菌檢查。取藤黃微球菌[MicrococcuIuteaCMCC（B）28001］的新鮮斜面培養(yǎng)物，加滅菌生理鹽水約3ml，制成均勻的菌懸液，然后以10倍系列稀釋后并計(jì)數(shù)，將該菌稀釋成1:105-1:108的系列濃度管。取生孢梭菌[ClostridiumsporogonesCMCC（B）64941]的需氣、厭氣培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)物，用滅菌毛細(xì)管將其吸至滅菌離心管內(nèi)，離心，棄去上清液，沉淀菌體用滅菌生理鹽水制成均勻菌懸液，照上述方法進(jìn)行稀釋并計(jì)數(shù)，將該菌稀釋成1:106一1:109系列濃度管。B霉菌培養(yǎng)基用白色念珠菌檢查取白色念珠菌[CandidaalbicansCMCC（F）98001］霉菌瓊脂培養(yǎng)基斜面的新鮮培養(yǎng)物，接種至霉菌培養(yǎng)基內(nèi)，20-25℃培養(yǎng)24小時(shí)。照藤黃微球菌項(xiàng)下方法稀釋及計(jì)數(shù)。將該菌稀釋成1:105-1:108系列濃度管。C將上述制備的各菌的系列濃度管各1ml，分別接種于9ml試驗(yàn)培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋濃度至少接種3管，以未接種的培養(yǎng)基管對(duì)照，細(xì)菌試驗(yàn)管置30-35℃培養(yǎng)3天，白色念珠菌試驗(yàn)管置20-25℃培養(yǎng)5天，逐日記錄結(jié)果。D結(jié)果判斷以接種后培養(yǎng)基管數(shù)的2／3以上呈現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度為該培養(yǎng)基的靈敏度（且接種量均應(yīng)小于10個(gè)菌落），3次試驗(yàn)中，以兩次達(dá)到的最高靈敏度為判斷標(biāo)準(zhǔn)。需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基靈敏度藤黃微球菌1:106,生孢梭菌1:107，霉菌培養(yǎng)基靈敏度為白色念珠菌1:106。4.4.4配制的培養(yǎng)基應(yīng)在涼暗處保存，一般不得超過2周，臨用前細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)基分別經(jīng)30-35℃和20-25℃培養(yǎng)不少于48小時(shí)和72小時(shí)，證明無菌生長(zhǎng)后方可使用。4.4.5需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基在試管中裝量高度不得少于7Cm，其指示劑氧化層不得超過培養(yǎng)基深度的1／5，否則須經(jīng)水浴煮沸10分鐘，但只限加熱一次。無菌試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束時(shí)，指示劑氧化層應(yīng)不超過培養(yǎng)基深度的1／2。4.5對(duì)照用菌液的制備：4.5.1試驗(yàn)用菌種、菌種的復(fù)蘇、菌種的接種與保存等均應(yīng)按照“抗生素微生物檢定法”標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程項(xiàng)下操作。4.5.2金黃色葡萄球菌菌液用接種環(huán)取金黃色葡萄球菌[Staphy-lococcusaureusCMCC（B）26003]的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，接種至相同培養(yǎng)基內(nèi)，在30-35℃培養(yǎng)16-18小時(shí)，用滅菌生理鹽水稀釋成1:1064.5.3生孢梭菌菌液用接種環(huán)取生孢梭菌[C1ostrldiusporogonesCMCC（B）64941]的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物少許，接種至相同培養(yǎng)基內(nèi)，在30-35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，用滅菌生理鹽水稀釋成1:106。4.5.4白色念珠菌菌液用接種環(huán)取白色念珠菌[CandidaalbicansCMCC（F）98001]的霉菌瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物少許，接種至霉菌培養(yǎng)基內(nèi)，在20-25℃培養(yǎng)24小時(shí)，用滅菌生理鹽水稀釋成1:105。4.5.5上述制備的菌液，一般當(dāng)日使用。4.6檢查法的操作：4.6.1供試品、培養(yǎng)基在移入緩沖間之前應(yīng)先編號(hào)，并用0.1％新潔爾滅或酒精棉擦拭瓶（管）外壁，然后連同其它用具（包括無菌衣、帽、口罩等）移入緩沖間，打開無菌間紫外光燈和空氣過濾裝置開關(guān)并使其工作在1小時(shí)以上。4.6.2操作人員用肥皂水清洗雙手，關(guān)閉紫外光燈，進(jìn)入緩沖間，換拖鞋，再用碘酒棉、酒精棉擦手，穿戴衣、帽、口罩。將所需全部物品剝?nèi)ヅＦぜ?，移入無菌操作室，每次試驗(yàn)中所用物品必須計(jì)劃好，并有備用物。4.6.3供試品外部消毒：4.6.3.1粉針劑、油劑等橡皮塞鋁蓋壓封小瓶先用75％酒精棉球擦拭外壁及瓶塞，待干，用消毒鑷子剔去鋁蓋上的鋁質(zhì)小圓片。用碘酒棉球拭抹瓶蓋及橡皮塞，再用75％酒精棉球擦去碘酒，并將酒精棉球蓋于橡皮塞上待取樣。4.6.3.2安瓶針劑先用碘酒棉球?qū)财客獠坎潦孟?，待干，用砂輪或滅菌銼輕割安瓶頸部（便于折開安瓶），再用75％酒精棉將碘酒擦凈，待干。4.6.4供試品制備：用滅菌鑷取出注射器，在火焰旁將針芯插入針管并安上針頭，供試品瓶蓋和注射器針頭均應(yīng)迅速通過火焰數(shù)次，當(dāng)供試品為粉針劑，瓶蓋為橡皮塞時(shí)，用注射器吸取規(guī)定的溶劑在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入小瓶加入溶劑，使溶解，混勻后，吸出溶液；如為注射液可直接用注射器吸取藥液。按規(guī)定須稀釋或滅活的供試品，可直接或?qū)⑵績(jī)?nèi)供試液抽出至滅菌玻璃容器內(nèi)進(jìn)行滅活處理并稀釋至規(guī)定的體積和濃度；需加入空氣加壓后便于抽出的供試品應(yīng)用注射器對(duì)著火焰抽取空氣加入，抽取瓶中內(nèi)容液體時(shí)，應(yīng)將供試品倒置并使針頭在液面下。4.6.5直接接種法：除正文中另有規(guī)定外，隨機(jī)抽取2支（瓶）或2份（原料藥）以上，按上述操作進(jìn)行外部消毒和制備后吸取規(guī)定接種量的供試品溶液，在近火焰上以右手半握拳，小指為主拔開培養(yǎng)基管的塞子，再移至火焰下側(cè)沿著培養(yǎng)基管壁分別接種于需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基5管（其中1管于操作結(jié)束后移至接種室接種對(duì)照菌液1ml，供作陽性對(duì)照）；注入供試液時(shí)，切勿向液面直射，以免將空氣中的氧帶入培養(yǎng)基中，并在火焰旁將塞子塞嚴(yán)，另接種于霉菌培養(yǎng)基2管。供試品溶液的每管接種量與培養(yǎng)基的分裝量，應(yīng)根據(jù)供試品的裝量，按下表規(guī)定取用：供試品溶液的每管接種量與培養(yǎng)基分裝量供試品裝量（ml）每管接種量（ml）培養(yǎng)基分裝量（ml）2ml或2ml以下0.510接種后輕輕搖動(dòng)，使勻，需氣菌、厭氧菌培養(yǎng)基在30-35℃培養(yǎng)5日，霉菌培養(yǎng)基在20-25℃培養(yǎng)7日，培養(yǎng)期間應(yīng)逐日檢查是否有菌生長(zhǎng)（陽性對(duì)照在24小時(shí)內(nèi)應(yīng)有細(xì)菌生長(zhǎng)），并填寫無菌檢查記錄表。如在加入供試品溶液后培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁或沉淀，經(jīng)培養(yǎng)后不能從外觀上判斷時(shí)，可取該培養(yǎng)液種