第四章細(xì)菌耐藥性檢測(cè)

病原生物學(xué)與檢驗(yàn)教研室1本章學(xué)習(xí)目標(biāo)1.概念：AST、MIC、敏感、耐藥、中介2.抗菌藥物的主要種類及其代表藥物和作用對(duì)象3.抗菌藥敏試驗(yàn)的方法有？分別的優(yōu)缺點(diǎn)是？4.K─B法和稀釋法（原理、操作方法、注意事項(xiàng)及影響因素）5.2第一節(jié)

抗菌藥物的種類及作用機(jī)制3

臨床常用抗菌藥物種類一、青霉素類二、頭孢菌素類三、其他β-內(nèi)酰胺類四、氨基糖苷類五、喹諾酮類六、大環(huán)內(nèi)脂類七、糖肽類和環(huán)脂肽類八、磺胺類九、四環(huán)素、氯霉素、林可霉素類十、其他抗菌藥物

4一、青霉素類作用機(jī)制：與PBP結(jié)合，抑制細(xì)胞壁合成。5二、頭孢菌素類抗菌效果：G+球菌：一代強(qiáng)；G-桿菌：三代強(qiáng)作用機(jī)制：與PBP結(jié)合，抑制細(xì)胞壁合成6三、其他β-內(nèi)酰胺類作用機(jī)制：①與PBP結(jié)合，抑制細(xì)胞壁合成或溶解細(xì)菌；②抑制由質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶。7四、氨基糖苷類作用機(jī)制：①依靠離子吸附作用，損傷細(xì)胞膜；②與細(xì)菌核糖體30S小亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成或產(chǎn)生無(wú)意義的蛋白質(zhì)；8五、喹諾酮類作用機(jī)制：①通過(guò)外膜孔蛋白和磷脂滲透菌細(xì)胞；②作用于DNA旋轉(zhuǎn)酶干擾DNA復(fù)制修復(fù)和重組；9六、大環(huán)內(nèi)脂類七、糖肽類和環(huán)脂肽類10八、磺胺類九、四環(huán)素、氯霉素、林可霉素類11十、其他抗菌藥物12第二節(jié)抗菌藥物敏感試驗(yàn)13抗菌藥物敏感試驗(yàn)(AST)是指在體外測(cè)定［藥物抑制或殺死細(xì)菌能力］或［細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性和耐藥性］的試驗(yàn)。AST的意義：①預(yù)測(cè)抗菌治療的效果；②指導(dǎo)抗菌藥物的臨床應(yīng)用；③發(fā)現(xiàn)或提示細(xì)菌的耐藥機(jī)制，選擇合適的藥物，避免產(chǎn)生或加重細(xì)菌的耐藥；④監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性變遷，控制和預(yù)防耐藥菌的流行；⑤鑒定細(xì)菌：如桿菌肽試驗(yàn)、新生霉素試驗(yàn)等14一、AST抗菌藥物的選擇選擇原則：遵循臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。藥物分組：A組：對(duì)特定菌群常規(guī)試驗(yàn)并常規(guī)報(bào)告的藥物；B組：臨床上重要的、針對(duì)院內(nèi)感染的、在A組耐藥/

過(guò)敏/無(wú)效/多部位感染時(shí)的選擇性報(bào)告藥物。C組：A、B組耐藥時(shí)選用的替代性或補(bǔ)充性的藥物；U組：僅用于治療泌尿道感染的藥物。O組：對(duì)該組細(xì)菌有臨床適應(yīng)證但一般不允許常規(guī)試驗(yàn)并報(bào)告的藥物15

根據(jù)菌株選擇的建議抗菌藥物腸桿菌科：氨芐西林阿米卡星哌拉西林/他唑巴坦頭孢噻肟環(huán)丙沙星亞胺培南氨曲南慶大霉素；銅綠假單胞菌：頭孢他啶慶大霉素哌拉西林阿米卡星環(huán)丙沙星頭孢吡肟亞胺培南；葡萄球菌屬：頭孢西丁青霉素紅霉素萬(wàn)古霉素環(huán)丙沙星慶大霉素利福平；腸球菌屬：青霉素萬(wàn)古霉素甲氧芐啶/磺胺異噁唑慶大霉素環(huán)丙沙星紅霉素氨芐西林不動(dòng)桿菌屬：頭孢他啶亞胺培南阿米卡星頭孢吡肟哌拉西林/他唑巴坦頭孢曲松環(huán)丙沙星米諾環(huán)素16洋蔥伯克霍德菌：頭孢他啶米諾環(huán)素甲氧芐啶/磺胺異噁唑美羅培南；嗜麥芽窄食單胞菌：甲氧芐啶/磺胺異噁唑左氧氟沙星米諾環(huán)素；嗜血桿菌屬：氨芐西林甲氧芐啶/磺胺異噁唑頭孢他啶美羅培南阿奇霉素環(huán)丙沙星頭孢克洛；淋病奈瑟菌：頭孢曲松環(huán)丙沙星青霉素大觀霉素四環(huán)素；肺炎鏈球菌：紅霉素苯唑西林甲氧芐啶/磺胺異噁唑克林霉素左氧氟沙星四環(huán)素萬(wàn)古霉素；其他鏈球菌：紅霉素青霉素克林霉素萬(wàn)古霉素頭孢曲松左氧氟沙星。17AST常用方法：紙片擴(kuò)散法、稀釋法、E-test法、自動(dòng)化儀器法臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇先進(jìn)、方便的方法進(jìn)行常規(guī)的AST：

需氧菌及兼性厭氧菌：K-B法、稀釋法、E-試驗(yàn)法

結(jié)核分枝桿菌：絕對(duì)濃度法、1%溶血液體培養(yǎng)基快速法

厭氧菌的AST：稀釋法

真菌的AST：液體稀釋法、瓊脂斜面法18WHO推薦的定性AST的基本、標(biāo)準(zhǔn)方法；是目前應(yīng)用最廣泛的AST法；優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，選藥?kù)`活，成本低廉缺點(diǎn)：不能用于厭氧菌；只能定性不能定量。二、紙片擴(kuò)散法（K-B法）19相關(guān)概念：敏感(S)：是指所分離菌株能被測(cè)試藥物使用推薦劑量時(shí)在感染部位通常可達(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制。耐藥(R)：是指所分離的菌株不被測(cè)試藥物常規(guī)劑量可達(dá)到的藥物濃度所抑制。中介(I)：是指抗菌藥物在生理濃集的部位具有臨床效果，還表示S與R之間的緩沖區(qū)MIC(MBC)：最低抑(殺)菌濃度(U/ml或ug/ml)，是某種抗菌藥物抑制(殺滅)待測(cè)菌的最低濃度。20(一)實(shí)驗(yàn)原理

P52

抑菌圈：K-B法藥物紙片周圍無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈。

①

抑菌圈大小與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)(即抑菌圈越大，MIC越小，則藥物抗菌力越強(qiáng))②抑菌圈大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度呈正相關(guān)(即抑菌圈越大，細(xì)菌對(duì)該藥越敏感)藥物紙片抑菌圈已接種菌的平板21（二）培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片2.培養(yǎng)基⑴要求：水解酪蛋白(M-H)培養(yǎng)基；PH7.2～7.4；⑵注意事項(xiàng)：瓊脂厚4mm；密封置4oC冰箱可保存7天；使用前置35oC溫箱15分鐘待其表面干燥。藥敏紙片：⑴要求：直徑6.35mm；吸水量20μl；含藥量達(dá)規(guī)定所示；⑵注意事項(xiàng)：含藥紙片密封貯存于-20oC無(wú)霜冰箱或4～8oC冰箱保存(短期)；用前室溫平衡1～2h，有效期內(nèi)使用。22

（三）實(shí)驗(yàn)方法配菌懸液→接種→貼藥物紙片→孵育231.配制菌懸液

⑴濃度：0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)(相當(dāng)于含菌量108CFU/ml)⑵配制方法：直接菌落調(diào)配法、細(xì)菌液體生長(zhǎng)法比濁儀⑶配好的菌液應(yīng)在15min內(nèi)接種平板24用無(wú)菌棉拭子醮取菌液，在管壁擰壓

→在瓊脂表面均勻涂抹3次,每次平板轉(zhuǎn)角60°+內(nèi)緣一周2.接種涂布法平板室溫干燥3~5min→貼藥敏紙片(片間距＞24mm；距平板內(nèi)緣＞15mm；紙?zhí)庂N上后不可再移動(dòng))

→平板放置15min3.貼紙片置35oC培養(yǎng)箱16~18h(苯唑西林和萬(wàn)古霉素敏感等應(yīng)孵育24h)；孵育時(shí)平板盡量不疊放→判讀結(jié)果4.孵育

25（四）結(jié)果判讀和報(bào)告

用直尺或游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑

1.

測(cè)量時(shí)注意：⑴自平板背面量抑菌圈直徑，血平板則開(kāi)蓋正面借光觀察；⑵抑菌圈的邊緣應(yīng)是無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的區(qū)域，圓心為藥物紙片中心；⑶如果出現(xiàn)不規(guī)則圓形，則取最近似圓形的一側(cè)測(cè)量（如只能測(cè)出半徑×2）2.

根據(jù)CLSI所公布的最新判斷標(biāo)準(zhǔn)(查表)作出結(jié)果（“S”“R”“I”）判斷26抑菌圈直徑(mm)敏感度20及以上極敏15～20高敏10～14中敏10以下低敏0不敏紙片擴(kuò)散法結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)但具體對(duì)于不同的菌株，及不同的抗生素紙片需參照更詳細(xì)的CLSI標(biāo)準(zhǔn)(每年更新)

271.影響因素

（總結(jié)前述）⑴培養(yǎng)基（成分、含量、酸堿度、瓊脂含量）⑵紙片（重量、吸水性、直徑、保存）⑶菌量（濃度、接種量）⑷操作方法（接種后放置及時(shí)間、堆放情況、紙片貼放？涂布細(xì)菌方法？…）⑸培養(yǎng)條件、溫度、時(shí)間⑹抑菌環(huán)測(cè)量工具的精度級(jí)測(cè)量方法（五）質(zhì)量控制282.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)株⑴相同條件下，質(zhì)控菌與待測(cè)菌同時(shí)操作，⑵以質(zhì)控菌的抑菌圈為標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈質(zhì)控范圍為“95%的可信限”⑶質(zhì)控菌向可靠機(jī)構(gòu)索購(gòu)（ATCC）29三、稀釋法優(yōu)點(diǎn)：直接測(cè)MIC（定量）；是目前厭氧菌等的最佳測(cè)定方法缺點(diǎn)：操作煩瑣

常用方法：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法301.材料⑴培養(yǎng)基：M-H肉湯需氧菌、兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好；(流感嗜血桿菌、鏈球菌等需補(bǔ)充生長(zhǎng)所需成分)校正培養(yǎng)基pH為7.2～7.4離子校正的M-H肉湯(CAMHB)為目前推薦的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)液⑵藥物原液：遵照CLSI的指南進(jìn)行稀釋⑶菌液：0.5麥?zhǔn)蠞舛染骸罱K菌液濃度(每管或每孔)為5×105CFU/ml(一)

肉湯稀釋法312.操作用M-H液體培養(yǎng)基將抗菌藥物做不同濃度的稀釋(試管法或微量板法)→每管接種待測(cè)菌→孵育→結(jié)果判斷（參考實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)）試管號(hào)123456789……M-H液(ml)11111111藥物稀釋(ml)1111類推……接種菌液(ml)每管0.05混勻→35℃12~18h培養(yǎng)每管含藥物濃度μg/ml12345678910111251225612864321684210.50.25

1棄去32

微量稀釋法在微量聚乙烯微板孔中加入各種不同濃度的抗生素100μl，從低濃度往高濃度加樣，不需要更換吸管

33MIC：無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的管或孔的最低藥物濃度。MBC：無(wú)菌生長(zhǎng)各管中分取0.01ml(定容接種環(huán))移種血平板,35oC過(guò)夜，99.9%原始種入菌被殺死管的藥物濃度即為該菌的MBC。3.結(jié)果判斷4.質(zhì)量控制同K-B法

瓊脂稀釋法（自學(xué)）34

E-test法是一種定量的抗生素藥敏測(cè)定技術(shù)。該系統(tǒng)包含有一個(gè)預(yù)先制備好的抗生素濃度梯度，可用于在瓊脂培養(yǎng)基上判讀某抗生素對(duì)微生物的最小抑菌濃度（MIC），用μg/ml表示。

是擴(kuò)散法和稀釋法的結(jié)合35是結(jié)合稀釋法和擴(kuò)散法原理的直接定量AST法

優(yōu)點(diǎn)：可以定量；操作簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：不能用于厭氧菌1.原理：P542.培養(yǎng)基：M-H瓊脂MRSA/MRSE：+2%NaCl肺鏈：+5%脫纖維羊血厭氧菌：用布氏菌血瓊脂嗜血桿菌：HTM淋球菌：GC+1%添加劑四、E-test法361.菌液制備及涂布接種同K－B法2.用鑷子將E-test試條的含抗菌藥物的一面貼向瓊脂表面，有刻度的一面向外，直徑140mm的平板可放置6條，90mm平板只能放置1～2試條。3.孵育，置平板于35℃孵育16～24h

3.操作方法橢圓形抑菌圈；抑菌圈和試條的交界點(diǎn)值即為抗菌藥物的MIC

4.結(jié)果判斷和報(bào)告MIC37五、聯(lián)合藥敏試驗(yàn)1.目的：P54

①～④2.結(jié)果無(wú)關(guān)作用——等于活性最大的單藥的藥效拮抗作用——低于單藥活性累（相）加作用——等于單藥之和

協(xié)同作用——大于單藥抗菌活性總和

3.方法：稀釋法：如“棋盤法”（定量）擴(kuò)散法：?jiǎn)嗡幖埰顦蚍ɑ蚣垪l擴(kuò)散法38縱向稀釋一種藥物橫向稀釋另一種藥物稀釋法

結(jié)果判讀以FIC為依據(jù)：

﹤0.5協(xié)同；

0.5~1累加；

1~2無(wú)關(guān)；﹥2拮抗；39擴(kuò)散法無(wú)關(guān)拮抗協(xié)同累加40第三節(jié)細(xì)菌的耐藥機(jī)制及耐藥性檢測(cè)

41細(xì)菌的耐藥機(jī)制產(chǎn)生一種或多種水解酶、鈍化酶和修飾酶等抗菌藥物的靶位改變細(xì)菌膜的通透性下降細(xì)菌主動(dòng)外排系統(tǒng)的過(guò)度表達(dá)第一、二種機(jī)制具有專一性第三、四種機(jī)制不具專一性42主要指β-內(nèi)酰胺酶

(P55表4-2)廣譜酶、ESBL、金屬酶、AmpC酶等臨床以產(chǎn)ESBL的G-桿菌最受重視產(chǎn)ESBL大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等碳青霉烯酶引起國(guó)際的廣泛關(guān)注鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌等一、產(chǎn)生藥物滅活酶(一)水解酶(三)修飾酶(二)鈍化酶質(zhì)粒介導(dǎo)43主要是細(xì)菌菌體膜蛋白—青霉素PBP的改變二、藥物作用靶位的改變?nèi)⒖咕幬餄B透障礙四、藥物的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)亢進(jìn)主要是細(xì)菌膜的選擇透過(guò)性的改變主要易化家族；耐藥小節(jié)分裂家族；鏈霉素耐藥或葡萄球菌多重耐藥家族；ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)器44五、耐藥表型檢測(cè)該酶位于G+球菌菌體外；位于G-桿菌間質(zhì)中頭孢硝噻吩紙片法G+球菌：直接用無(wú)菌牙簽挑取16～20h的菌落或其細(xì)菌懸液涂抹頭孢硝噻吩紙片上。(一)β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)45頭孢硝噻吩紙片法G-桿菌：提取細(xì)菌裂解液涂抹頭孢硝噻吩紙片上(一)β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)10分鐘后觀察結(jié)果，紙片由黃色變?yōu)榧t色為陽(yáng)性46（二）超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)檢測(cè)

臨床ESBL檢測(cè)主要是：

P59

1.ESBL紙片法表型篩選試驗(yàn)

2.ESBL紙片