酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用１.蛋白質(zhì)組的概述２.酵母雙雜交系統(tǒng)３.酵母雙雜交在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!（1）.產(chǎn)生背景

基因組研究自從開展以來已經(jīng)取得了舉世矚目的成就。在過去幾年中,已經(jīng)陸續(xù)完成了包括大腸桿菌、釀酒酵母等十多種結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單的生物的基因組DNA的全序列分析。規(guī)模更為龐大的人類基因組計(jì)劃在2005年完成全部基因組DNA的序列分析。但是也隨之產(chǎn)生了新問題。大量涌出的新基因數(shù)據(jù)迫使我們不得不考慮這些基因編碼的蛋白質(zhì)有什么功能這個(gè)問題。不僅如此,在細(xì)胞合成蛋白質(zhì)之后,這些蛋白質(zhì)往往還要經(jīng)歷翻譯后的加工修飾。也就是說,一個(gè)基因?qū)?yīng)的不是一種蛋白質(zhì)而可能是幾種甚至是數(shù)十種。包容了數(shù)千甚至數(shù)萬(wàn)種蛋白質(zhì)的細(xì)胞是如何運(yùn)轉(zhuǎn)的？或者說這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)是怎樣工作、如何相互作用、相互協(xié)調(diào)的？這些問題遠(yuǎn)不是基因組研究所能回答得了的。正是在此背景下,蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)應(yīng)運(yùn)而生。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!（2）蛋白組簡(jiǎn)介

蛋白質(zhì)組(proteome)一詞是馬克.威爾金斯(MarcWilkins)最先提出來的,最早見諸于1995年7月“Electrophoresis”雜志上,它是指一個(gè)有機(jī)體的全部蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)方式。當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)的主要內(nèi)容是,在建立和發(fā)展蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)方法的同時(shí),進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。對(duì)蛋白質(zhì)組的分析工作大致有兩個(gè)方面：一方面,通過二維凝膠電泳得到正常生理?xiàng)l件下的機(jī)體、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的圖譜,相關(guān)數(shù)據(jù)將作為待檢測(cè)機(jī)體、組織或細(xì)胞的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫(kù)。一系列這樣的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)建立并且可通過聯(lián)網(wǎng)檢索。二維參考圖譜建立的意義在于為進(jìn)一步的分析工作提供基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組分析的另一方面,是比較分析在變化了的生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)所發(fā)生的變化。如蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化,翻譯后修飾的變化,或者可能的條件下分析蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞水平上的定位的改變等。

酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!(3)蛋白質(zhì)組學(xué)過程酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!2.1雙雜交系統(tǒng)原理酵母雙雜交技術(shù)是1989年由Fields等最先應(yīng)的。與其他技術(shù)相比，它省去了耗時(shí)耗力的蛋白表達(dá)純化以及抗體制備步驟，并且可以用于高通量的篩選，因此以其簡(jiǎn)便、快捷與廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)迅速發(fā)展成為一種常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。根據(jù)對(duì)文獻(xiàn)的統(tǒng)計(jì)，目前已知的蛋白質(zhì)相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!以Fields等人建立的酵母雜交系統(tǒng)為例

Fields等人的工作標(biāo)志雙雜交系統(tǒng)的正式建立。他們以與調(diào)控SUC2基因有關(guān)的2個(gè)蛋白質(zhì)Snf1

和Snf2為模型,將前者與GaL4的DB結(jié)構(gòu)域融合,另外一個(gè)與Ga14的AD結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”(bait)和“獵物”或靶蛋白。如果在Snf1和Snf2之間存在相互作用,那么分別位于這2個(gè)融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子,從而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。這個(gè)被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報(bào)道基因(reportergene)。通過對(duì)報(bào)道基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè),反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的2個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。在此基礎(chǔ)上Fields等人采用編碼β-半乳糖苷酶的LacZ作為報(bào)道基因,并且在該基因的上游調(diào)控區(qū)引入受GaL4蛋白調(diào)控的GAL1序列。這個(gè)改造過的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因(GaL80是GaL4的負(fù)調(diào)控因子)被缺失,從而排除了細(xì)胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響。已經(jīng)知道在Snf1和Snf2之間存在相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有同時(shí)轉(zhuǎn)化了Snf1和Snf2融合表達(dá)載體的酵母細(xì)胞才有β-半乳糖苷酶活性,單獨(dú)轉(zhuǎn)化其中任何一個(gè)載體都不能檢測(cè)出β-半乳糖苷酶活性。

酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!酵母雙雜交系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)基本過程

酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!(1)檢測(cè)在真核活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!(3)檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng),因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!(5)通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號(hào)放大。同時(shí),酵母表型,X—Gal及HIS3蛋白表達(dá)等檢測(cè)方法均很敏感。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!3.酵母雙雜交在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)行及各種模式生物基因組序列的產(chǎn)生，人們的研究重點(diǎn)也轉(zhuǎn)移到對(duì)基因的產(chǎn)物—蛋白質(zhì)的研究和分析上。蛋白質(zhì)功能的研究著重在于蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)的時(shí)空表達(dá)模式和蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用.由于雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)便，敏感，高效的特點(diǎn),使它非常適合基因組水平的大規(guī)模篩選。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!2、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用

利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（GenomeProteinLinkageMap）

眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動(dòng)中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的。基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫(kù)中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。

酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁(yè)!2.酵母雙雜交系統(tǒng)2.1雙雜交系統(tǒng)的原理2.2Sos恢復(fù)系統(tǒng)2.3優(yōu)點(diǎn)及局限酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁(yè)!酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報(bào)道基因的表達(dá)探測(cè)蛋白———蛋白的相互作用。主要結(jié)構(gòu)由含有DNA結(jié)合域和DNA轉(zhuǎn)錄激活域二類載體以及酵母報(bào)告株構(gòu)成。將DNA—BD與已知的誘餌蛋白質(zhì)X融合,構(gòu)建出BD-X質(zhì)粒載體;將AD基因與cDNA文庫(kù),基因片段或基因突變體(以Y表示)融合,構(gòu)建出AD-Y質(zhì)粒載體。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁(yè)!酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁(yè)!Sos恢復(fù)系統(tǒng)

原理：正常情況下，當(dāng)有生長(zhǎng)信號(hào)刺激的時(shí)候，酵母的Ras鳥苷酸交換因子Cdc25會(huì)富集到細(xì)胞膜上；這時(shí)Cdc25能夠促使Ras蛋白的GDP與GTP的交換，啟動(dòng)下游的信號(hào)，促進(jìn)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。在酵母溫度敏感缺陷株CDC25-2中，Cdc25由于突變喪失了上述功能，使得此菌株只能在25攝氏度下生長(zhǎng)，而在限制溫度37攝氏度無法生長(zhǎng)。Sos是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的Ras鳥苷酸交換因子，與酵母的Ras鳥苷酸交換因子Cdc25同源；研究發(fā)現(xiàn)人Sos能夠替代酵母Cdc25，使酵母細(xì)胞存活和增殖。于是在酵母溫度敏感缺陷株Cdc25-2中，當(dāng)人的Sos與膜定位信號(hào)（肉豆蔻酰化或法呢酯化信號(hào)）融合后，就會(huì)富集到細(xì)胞膜上，從而以不依賴配體的方式活化Ras及生長(zhǎng)信號(hào)，彌補(bǔ)Cdc25的突變，使該菌株在37攝氏度可以生長(zhǎng)。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁(yè)!2.3優(yōu)點(diǎn)及局限

雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)構(gòu)成部分是報(bào)道株。報(bào)道株指經(jīng)改造的、含報(bào)道基因(repeetergene)的重組質(zhì)粒的細(xì)胞。目前，大多采用的是酵母細(xì)胞。其具有以下優(yōu)點(diǎn):酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁(yè)!(2)作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后,在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的,省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁(yè)!(4)酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫(kù),能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁(yè)!酵母雙雜交系統(tǒng)在分析蛋白—蛋白間相互作用具高效和快速性,但在實(shí)際應(yīng)用方面仍存在一些局限性。

(1)雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi),而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等,這些反應(yīng)在細(xì)胞核內(nèi)無法進(jìn)行。(2)酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重要的問題是“假陽(yáng)性”。酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組共25頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁(yè)!

1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新基因的主要途徑。當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽(yáng)性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對(duì)該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個(gè)篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要