乙肝疫苗生產發(fā)展簡介詳解演示文稿當前1頁，總共48頁。（優(yōu)選）乙肝疫苗生產發(fā)展簡介當前2頁，總共48頁。2，減毒活疫苗患者---分離出致病微生物（細菌或者病毒）-----通過改變培養(yǎng)條件，獲得不再致病微生物---培養(yǎng)不再致病微生物，獲得大量的不再致病微生物---鋁吸附-----減毒活疫苗。當前3頁，總共48頁。乙肝病毒的體外培養(yǎng)至今沒有成功前面，我們已經講過，細菌要在培養(yǎng)基中繁殖，病毒要在細胞中繁殖，比如，流感病毒在雞胚細胞中生長，狂犬病毒要在地鼠腎細胞中生生長，乙腦病毒要在vero細胞中生長?？墒且腋尾《驹谒袑嶒炦^的細胞中都不能生長。乙肝疫苗的研究受到了嚴重的困難。人們不得不尋求其他的途徑去生產乙肝疫苗。當前4頁，總共48頁。乙肝抗原的來源1，乙肝患者的血液：血源性乙肝疫苗。2，利用DNA重組技術構建重組微生物（酵母）表達（合成）乙肝抗原：基因工程乙肝疫苗當前5頁，總共48頁。乙肝疫苗發(fā)展歷史1,1963年Blumberg發(fā)現在血友病患者的血清中存在一種抗體，這種抗體能與澳大利亞土著人血液中的一種抗原起交叉反應，這種抗原被命名為“澳大利亞”抗原。2,1968年Prince在血清型肝炎（乙型肝炎）患者血清中發(fā)現抗原性與澳大利亞抗原相同的病毒樣顆粒，進而初步認定澳大利亞抗原就是乙肝表面抗原。3,1970年Dane用電子顯微鏡在乙肝患者血清中發(fā)現直徑為42nm完整乙肝病毒顆粒及直徑為22nm的球形和桿形的乙肝表面抗原。當前6頁，總共48頁。4,1971年Krugman發(fā)現加熱處理的急性期乙肝患者的血清能部分預防乙肝感染。5,1981年Merck公司在世界上首次研制成功第一代乙肝疫苗——血源性乙肝疫苗。6,1985年北京生物制品研究所在國內首次研制成功血源性乙肝疫苗.7,1986年Merck公司在世界上首次研制成功第二代乙肝疫苗-----重組酵母乙肝。當前7頁，總共48頁。8,1989年北京生物制品研究所與Merck公司簽訂合同，引進重組酵母乙肝疫苗工業(yè)化生產技術。1993年5月開始試生產。9,90年代德國萊茵生物技術公司發(fā)展了一種甲基營養(yǎng)型酵母---漢遜酵母表達系統(tǒng),其乙肝表面抗原表達水平可達到500-1000mg/L.南韓綠十字疫苗公司應用該表達系統(tǒng)實現了重組漢遜酵母乙肝疫苗的大規(guī)模工業(yè)化生產。當前8頁，總共48頁。10,大連高新（漢信）生物制藥有限公司從1998年開始重組漢遜酵母乙肝疫苗的研制工作，在2002年6月獲得了國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的“新藥證書”，在2003年開始商業(yè)化生產。

11,華蘭生物在2009年也將開始重組漢遜酵母乙肝疫苗的生產。當前9頁，總共48頁。乙肝疫苗的發(fā)展歷史第一代乙肝疫苗；血源性乙肝疫苗。第二代乙肝疫苗；基因工程乙肝疫苗。當前10頁，總共48頁。基因工程乙肝疫苗1，CHO細胞乙肝疫苗。2，重組釀酒酵母乙肝疫苗。(第一代重組酵母乙肝疫苗）3，重組漢遜酵母乙肝疫苗。(第二代重組酵母乙肝疫苗）當前11頁，總共48頁。

乙肝疫苗的發(fā)展歷程：n80年代初期-----血源性乙肝疫苗（第一代乙肝疫苗）。1995年停產。n80年代中期----基因工程乙肝疫苗（第二代乙肝疫苗）。包括：重組釀酒酵母乙肝疫苗，表達水平不理想—50mg/L。5ug/0,5ml的成人劑量偏低，抗體滴度偏低。重組CHO細胞乙肝疫苗，表達水平低，2-5mg/L，母嬰阻斷效果不理想重組牛痘病毒乙肝疫苗。表達水平低，1-3mg/L，無法實現工業(yè)化生產。n90年代初期---重組漢遜酵母乙肝疫苗。更先進的基因工程乙肝疫苗。當前12頁，總共48頁。國外主要的乙肝疫苗生產廠家廠家疫苗美國默克公司Merck重組釀酒酵母乙肝疫苗比利時史克公司Smithkline重組釀酒酵母乙肝疫苗法國巴斯德研究所PasteurMerieux重組CHO細胞乙肝疫苗德國萊茵公司下屬的韓國綠十字疫苗公司GreenCross重組漢遜酵母乙肝疫苗當前13頁，總共48頁。國內主要的乙肝疫苗生產廠家廠家疫苗北京天壇生物制品股份有限公司(北京生物制品研究所）重組釀酒酵母乙肝疫苗深圳康泰生物制品公司重組釀酒酵母乙肝疫苗華北藥廠和長春生物制品研究所等重組CHO細胞乙肝疫苗大連高新(漢信）公司和華蘭生物疫苗公司重組漢遜酵母乙肝疫苗當前14頁，總共48頁。國內乙肝疫苗生產廠家工藝比較廠家種菌發(fā)酵細胞破碎粗純精純吸附北京深圳啤酒酵母四級發(fā)酵高壓破碎硅膠吸附疏水層析原位吸附大連漢信漢遜酵母四級流加球磨破碎PEG硅膠吸附DEAE分子篩區(qū)帶普通吸附華蘭生物漢遜酵母四級流加高壓破碎硫酸銨沉淀疏水DEAE分子篩普通吸附當前15頁，總共48頁。公司菌種的表達水平純化的收率北京深圳50mg/L20%大連漢信150-200mg/L15%華蘭生物200-300mg/L20%當前16頁，總共48頁。新鄉(xiāng)華蘭，大連漢信，北京天壇華蘭：菌種好，表達水平高，純化收率高，所以，總體而言，華蘭公司的技術更為先進。當前17頁，總共48頁。北京生物制品研究所(天壇生物)生產的乙肝疫苗的基本情況：生產技術：從美國MERCK公司引進。年產量：1000萬人份，3000萬支。生產設備：從美國購進。當前18頁，總共48頁。基本技術資料：菌種：重組釀酒酵母表達水平：50mg/L表達效率：1,35%(表面抗原蛋白/酵母總蛋白）純化收率：20%發(fā)酵罐工作體積：500L一次發(fā)酵所得抗原量：50mg/Lх500L=25g純化后所得抗原量25gх20%=5g可生產疫苗量5,000,000/5=1,000,000支當前19頁，總共48頁。北京天壇的弱項和不足：表達水平低，抗原數量少，每劑疫苗只含5微克或10微克的抗原，比華蘭疫苗抗原含量少一倍，所以抗體滴度低和抗體持續(xù)時間較短。當前20頁，總共48頁。

北京天壇和新鄉(xiāng)華蘭表達

水平和抗原產量的比較 表達水平抗原產量北京天壇50微克低新鄉(xiāng)華蘭300微克高當前21頁，總共48頁。北京天壇和新鄉(xiāng)華蘭疫苗

抗原含量和抗體反應的比較

每劑疫苗抗原含量抗體滴度抗體持續(xù)時間北京天壇5微克（兒童）10微克（成人）低短華蘭公司

10微克（兒童）20微克（成人）高長當前22頁，總共48頁。大連漢信和新鄉(xiāng)華蘭

純化步驟和純化收率的比較純化步驟純化收率

大連漢信多低于20%新鄉(xiāng)華蘭少高于20%當前23頁，總共48頁。漢遜酵母和啤酒酵母的比較當前24頁，總共48頁。

重組漢遜酵母的特點

（甲基營養(yǎng)型酵母）甲基營養(yǎng)型酵母：以甲醇為唯一能源和炭源的酵母。1,多個HBsAg基因拷貝被整合到染色體中，遺傳穩(wěn)定性好。2,發(fā)酵過程中不產生乙醇，黏度小，可實現高密度培養(yǎng)。當前25頁，總共48頁。3,高效表達HBsAg400-1000mg/L。

4,發(fā)酵過程中均使用化學合成培養(yǎng)基，不使用酵母粉等營養(yǎng)成分，生產成本低。

5，生物安全性好，漢遜酵母是存在于土壤，水中的一種酵母種群。它不含人和動物的病原體，不產生內毒素。按照國外基因技術法規(guī)，漢遜酵母被列為基因操作生物安全性1組。與釀酒酵母屬同一生物安全等級。國外生物安全委員會還將漢遜酵母選為典型的工業(yè)菌株的研究模型。當前26頁，總共48頁。重組漢遜酵母乙肝疫苗生產工藝菌種小三角瓶

大三角瓶

種子發(fā)酵罐生產發(fā)酵罐

細胞破碎當前27頁，總共48頁。

去除細胞碎片

疏水層析

離子交換層析

凝膠過濾除菌過濾

鋁吸附當前28頁，總共48頁。種子批系統(tǒng)

SEEDLOTSYSTEM在乙肝疫苗的生產過程中采用種子批系統(tǒng)，即由原始種子批制備主代種子批，由主代種子制備工作種子批，每次發(fā)酵都由工作種子批中取一支菌種接種三角瓶.種子批保存在液氮或－80℃的冰箱中。其目的是為了批與批之間菌種的差別降至最低。當前29頁，總共48頁。重組漢遜酵母乙肝疫苗的人體試驗結果A，小學生：選擇348名健康小學生（HBsAg,抗-HBs,抗-HBc陰性）年齡在6-9歲之間，隨機分為3組，每組接種1批疫苗，免疫劑量為10ug/0,5ml,免疫程序為0，1，6，第1劑免疫后3，7，12月采血樣，用Abbott試劑盒檢測抗-HBs，并觀察副反應。結果如下：當前30頁，總共48頁。重組漢遜酵母乙肝疫苗免疫小

學生抗體陽轉率和抗體GMT疫苗批號人數3個月7個月12個月抗體陽轉率%抗體GMT抗體陽轉率%抗體GMT抗體陽轉率%抗體GMT50111497,87230,598,25897,1100,0791,650210795,19246,6100,0915,6100,0875,1503127100,0311,699,21932,596,77867,6當前31頁，總共48頁。結論：1，重組漢遜酵母乙肝疫苗免疫小學生后副反應輕微。2，重組漢遜酵母乙肝疫苗免疫小學生后抗體陽轉率和抗體水平較高。當前32頁，總共48頁。重組漢遜酵母乙肝

疫苗的人體試驗結果B，母嬰傳播：

選擇HBsAg,HBeAg雙陽性母親所生新生兒45名，按0，1，6免疫程序接種10ug/0,5ml重組漢遜酵母乙肝疫苗,采集第1劑免疫后3，7月血樣，并檢測。同時，還免疫了41名健康母親所生的新生兒和5名HBsAg陽性,HBeAg陰性母親所生的新生兒做比較。其結果如下：當前33頁，總共48頁。

重組漢遜酵母乙肝疫苗

免疫新生兒后的抗體反應母親新生兒數抗-HBs陽轉率（%）抗-HBsGMTHBsAgHBeAg3個月7個月3個月7個月++4591,1141/4593,3342/45236,6615,5+-5100,04/4100,05/5223,9677,3--4185,3735/41100,041/41344,3634,5當前34頁，總共48頁。重組漢遜酵母乙肝疫苗免疫新

生兒的阻斷母嬰傳播保護效果母親人數HBsAg陽轉率保護率HBsAgHBeAg3個月7個月陽性陽性452,22(1/45)4,44(2/45)95,07%陽性陰性50,00(0/4)0,00(0/4)陰性陰性412,44(1/41)0,00(0/41)當前35頁，總共48頁。結論：阻斷母嬰傳播的效果好，保護率達到較高水平，（95,07%）。當前36頁，總共48頁。

由于重組漢遜酵母表達水平高，使重組漢遜酵母乙肝疫苗含有足夠量的抗原，抗原濃度比其它乙肝疫苗高出一倍，成人：20ug/ml,嬰兒，兒童：10ug/0,5ml。因而，免疫后產生的抗體不僅滴度高，而且抗體持續(xù)時間長。當前37頁，總共48頁。重組漢遜酵母乙肝疫苗

的特點：三高1，抗體陽轉率高。2，抗體滴度高。3，母嬰阻斷率高。

當前38頁，總共48頁。用重組漢遜酵母表達產物—乙肝表面抗原制備的重組漢遜酵母乙肝疫苗是新一代的乙肝疫苗，它在臨床實驗中有優(yōu)秀的"三高”表現，，即抗體陽轉率高，抗體滴度高，母嬰阻斷率高。

當前39頁，總共48頁。乙型肝炎病毒感染的預防：

I，被動免疫：

免疫球蛋白（ImmuneGlobulin)免疫球蛋白是將HBsAg陰性供血者的血液經低溫乙醇分段法而制成，其中anti—HBs的含量不確定，所以預防乙型肝炎病毒感染的作用也是不明確的。使用免疫球蛋白的唯一理由是當時無法獲得特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）當前40頁，總共48頁。乙型肝炎病毒感染的預防：

特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）特異性乙肝免疫球蛋白是將anti-HBs陽性供血者的血液經低溫乙醇分段法而制成，其中anti—HBs的含量是確定的，所以對乙肝病毒暴露后的預防作用也是確定的。經低溫乙醇分段法而制備的特異性乙肝免疫球蛋白是安全的，沒有證據表明它會傳播AIDS。當前41頁，總共48頁。特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）的使用

什么情況下使用特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）1，傷口和黏膜意外暴露于HBsAg—陽性血液。2,HBsAg—陽性母親所生的新生兒。注意：在注射特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）后，還應同時注射乙肝疫苗。當前42頁，總共48頁。特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）的注射劑量和注射途徑；傷口，黏膜意外暴露，0,06ml/kg.最大劑量：5ml.HBsAg—陽性母親所生的新生兒。0,5ml。肌肉內注射。

.當前43頁，總共48頁。乙肝疫苗的接種劑量:分組RecombivaxHB（默克）EngerixB（史克）劑量(ml)劑量(ml)HBsAg(-)母親的嬰兒<11yrs的兒童2,5(ug)0,510,0(ug)0,5HBsAg(+)母親的嬰兒5,0(ug)0,510,0(ug)0,511`--19yrs青少年5,0(ug)0,520,0(ug)1,0>20yrs成年人10,0(ug)1,020,0(ug)1,0透析患者40,0