酶（蛋白質(zhì)）工程云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林潔主講

第八章

酶的非水相催化第一節(jié)酶非水相催化的研究概況第二節(jié)水對(duì)非水相介質(zhì)中酶催化的影響第三節(jié)有機(jī)溶劑對(duì)非水相介質(zhì)中酶催化的影響第四節(jié)非水相中酶催化的特性第一節(jié)

酶非水相催化的研究概況一、酶非水相催化的研究簡史傳統(tǒng)觀念：酶只能在水相中表現(xiàn)出其生物功能？天然酶在生物體內(nèi)的酶促反應(yīng)主要是發(fā)生在以水為介質(zhì)的系統(tǒng)中有機(jī)溶劑是酶的變性劑、失活劑20世紀(jì)初，Bourquelot等曾經(jīng)將乙醇、丙酮類的有機(jī)溶劑加到酶的水溶液中，進(jìn)行非水介質(zhì)中酶催化的嘗試，在這種情況下，需要保持很高的含水量，酶才具有一定的催化活性（遠(yuǎn)低于水溶液催化）1984年，Klibanov（美國MIT）在《Science》上發(fā)表了一篇關(guān)于酶在有機(jī)介質(zhì)中催化條件和特點(diǎn)的文章，發(fā)現(xiàn)酶在微量或幾乎無水的不同有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出不同的立體選擇性和穩(wěn)定性，成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等許多有機(jī)化合物，開辟了酶工程領(lǐng)域的研究新方向——非水酶學(xué)二、非水相介質(zhì)中酶的催化反應(yīng)與酶水溶液催化的比較總體而言，非水相中酶的活性會(huì)有所降低，但是1.可改變反應(yīng)平衡移動(dòng)方向2.酶的熱穩(wěn)定性比水中要高3.有利于疏水性底物（多數(shù)有機(jī)化合物）的反應(yīng)4.在非水系統(tǒng)內(nèi)酶不溶于有機(jī)相，很容易回收和反復(fù)使用5.改變酶對(duì)底物的專一性，同一種酶在不同的有機(jī)溶劑中可以表現(xiàn)出不同的立體選擇性6.從低沸點(diǎn)的溶劑中可以容易地分離純化產(chǎn)物7.能抑制依賴于水的某些不利反應(yīng)和副產(chǎn)物的產(chǎn)生8.可擴(kuò)大反應(yīng)pH值的適應(yīng)性9.沒有微生物的污染10.酶易于實(shí)現(xiàn)固定化，在非水系統(tǒng)中酶不易脫落吸附的表面三、酶的非水相催化的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢近20年來，發(fā)現(xiàn)有十多種水解酶和氧化還原酶在有機(jī)溶劑中具有催化活性酶反應(yīng)從有機(jī)溶劑中轉(zhuǎn)入超臨界流體、氣體、低共熔混合的固體和多相混合等其他非水相環(huán)境利用酶在非水相中的特性大大拓展了生物催化劑——酶在工業(yè)生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用空間，特別是化合物的不對(duì)稱合成方面促進(jìn)生物催化方面的溶劑工程的研究四、什么是酶的非水相催化酶的非水相催化（enzymecatalysisinnon-aquaousphase）就是指酶在非水介質(zhì)中進(jìn)行的催化作用常用的非水相體系包括：有機(jī)溶劑系統(tǒng)（organicsolvents）超臨界流體體系（supercriticalfluids）氣相體系（gases）低共熔混合體系（eutecticmixtures）有機(jī)溶劑系統(tǒng)是目前非水相酶學(xué)研究和酶促催化應(yīng)用最為廣泛的體系五、非水相介質(zhì)中酶的結(jié)構(gòu)在有機(jī)溶劑中，酶分子不能直接溶于其中，而是在含微量水的有機(jī)溶劑中以懸浮狀態(tài)起催化作用許多研究證實(shí)：在有機(jī)相中酶能夠保持其整體結(jié)構(gòu)的完整性，至少是酶活性部位的結(jié)構(gòu)與水溶液中的結(jié)構(gòu)是相同的六、酶非水相催化應(yīng)具備的條件1．保證必需水含量2．選擇合適的溶劑及反應(yīng)體系3．選擇合適的酶及酶形式4．選擇最佳pH值。第二節(jié)

水對(duì)非水相介質(zhì)中酶催化的影響引言有機(jī)溶劑中酶的催化活性與反應(yīng)系統(tǒng)的含水量有著密切的關(guān)系，酶在完全非水環(huán)境中沒有催化活性，一定量的水對(duì)維持酶催化所需的正確構(gòu)象是必需的一、水與酶的柔性酶的整個(gè)分子具有相對(duì)剛性和相對(duì)柔性是其能否表現(xiàn)出催化活性的關(guān)鍵相對(duì)剛性能維持空間構(gòu)象相對(duì)柔性利于底物與活性中心的誘導(dǎo)契合只有水含量達(dá)到最適水量時(shí)，酶結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)剛性和熱力學(xué)穩(wěn)定性之間才能達(dá)到最好的平衡，酶的活力為最大水分子直接或間接地參與了維持酶構(gòu)象的非共價(jià)作用力的形成或維持，其作用類似于酶的潤滑劑和增塑劑有機(jī)溶劑無法提供形成氫鍵的能力，會(huì)使蛋白質(zhì)的“剛性”增強(qiáng)1984年，Replay和Finney等人，采用UR、IR和NMR等方法在溶菌酶水合過程中研究酶活性與水含量之間的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，一個(gè)酶分子水合經(jīng)過四個(gè)步驟：水與酶分子表面可離子化的帶電基團(tuán)結(jié)合，達(dá)到0-0.07g/g（水/酶）水與表面的極性基團(tuán)結(jié)合，介電常數(shù)升高，顯示酶活，達(dá)到0.07-0.25g/g水與酶分子之間形成氫鍵，作為潤滑劑增大了酶的柔性，酶活性隨著水含量的增加而提高，達(dá)到0.25~0.38g/g酶分子表面完全水化，被一層水分子所覆蓋，水分子的活性位點(diǎn)形成的介電屏蔽作用和水分子聚集造成的傳質(zhì)阻力使酶活力降低；同時(shí)，水含量的過高，還會(huì)酶結(jié)構(gòu)的柔性過大而引起酶結(jié)構(gòu)的變化和酶的失活；水含量大于0.38g/g。

干酶粉的水合過程二、結(jié)合水與酶的非水相催化非水相酶促催化系統(tǒng)的含水量分為結(jié)合水（boundwater）：緊密地結(jié)合在酶分子的表面的少部分水溶劑水（bulkwater）：有機(jī)溶劑中所含的自由水，占絕大多數(shù)在維持酶的結(jié)構(gòu)和催化活性中起決定作用的是酶的結(jié)合水，又稱為必需水，或結(jié)構(gòu)水微水相：所謂的非水相體系是一種水含量小于1%的微水有機(jī)溶劑體系仿水溶劑：鑒于“必需水”對(duì)酶分子間氫鍵的形成和對(duì)酶的活性構(gòu)象的維持具有重要作用，使用能夠與酶分子形成氫鍵的其他溶劑作為輔助溶劑，全部或部分替代溶劑水來調(diào)節(jié)酶分子的柔性，控制酶活性和酶的選擇性，這一類溶劑就稱為仿水溶劑（water-mimickingsolvent）用溶劑中的水的體積分?jǐn)?shù)作為參數(shù)描述水對(duì)非水相酶促反應(yīng)并不理想微水相體系中的含水量對(duì)酶的催化活性的影響酶量有機(jī)溶劑固定化載體底物產(chǎn)物含水量只能間接的反映酶結(jié)合水的多少，即間接描述水與酶活力的關(guān)系底物酶量溶劑產(chǎn)物載體含水量三、水活度水活度（wateractivity，Aw）就是指水的逸度，即在一定的溫度和壓力下，反應(yīng)體系中的水蒸汽分壓與相同條件下純水的蒸氣壓之比；水活度是描述水對(duì)非水相酶促反應(yīng)的影響的理想?yún)?shù)水活度的大小易測，在反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)測定體系上部氣體的濕度來獲得微水相是由固相（酶和載體）、液相（溶劑）和氣相（溶劑上的空間）組成的多相系統(tǒng)，平衡狀態(tài)時(shí)各相的水活度相同，能夠直接反映出體系中的酶的水合情況，與體系中水含量及所用的有機(jī)溶劑無關(guān)，不受固定化載體的影響Yw是氣相中水的摩爾分?jǐn)?shù)P是總氣壓P0是同溫度下水的飽和蒸汽壓達(dá)到平衡時(shí)，氣相-液相-固相中的水活度相等，因而通過氣相水活度的測定便可直接反映出整個(gè)體系的水活度水活度溶解在溶劑中的水結(jié)合在酶分子上的水結(jié)合在其他組分上的水氣相中的水蒸氣測定對(duì)象采用水活度研究有機(jī)溶劑催化中水對(duì)酶的催化活力的作用水活度對(duì)酶活力的影響程度隨著溶劑的不同而不同，但是在有機(jī)相酶促反應(yīng)中每個(gè)酶的最大催化活力都在相同的最佳水活度下表明：溶劑并不直接影響酶水之間的相互作用，有機(jī)溶劑中酶結(jié)合的水量與暴露在空氣中的酶粉的水活度至少相似采用水活度研究有機(jī)溶劑中載體對(duì)固定化酶的催化活力的作用盡管水對(duì)酶活力的影響幅度不同，但是不同載體中酶活力與水活度關(guān)系曲線的變化趨勢卻相同表明：多數(shù)的載體不能直接影響酶分子與水分子的相互作用方法一：向經(jīng)過脫水的干燥溶劑中添加定量的水在一定溫度和壓力下，水活度為反應(yīng)體系中水的摩爾分?jǐn)?shù)與水活度系數(shù)的乘積對(duì)于給定的有機(jī)溶劑中，水活度隨水含量的增大而增加對(duì)于給定的水活度來說，疏水性的有機(jī)溶劑所需的水量比親水性溶劑的少有機(jī)反應(yīng)體系中水活度的調(diào)控方法χw是反應(yīng)體系中水的摩爾分?jǐn)?shù)γw是反應(yīng)體系中水的活度系數(shù)方法一：向經(jīng)過脫水的干燥溶劑中添加定量的水方法二：將底物溶液和酶分別與一種無機(jī)鹽的飽和溶液預(yù)平衡一定時(shí)間，以獲得恒定的水活度，然后將其混合反應(yīng)有機(jī)反應(yīng)體系中水活度的調(diào)控方法方法一：向經(jīng)過脫水的干燥溶劑中添加定量的水方法二：將底物溶液和酶分別與一種無機(jī)鹽的飽和溶液預(yù)平衡一定時(shí)間，以獲得恒定的水活度，然后將其混合反應(yīng)方法三：向干燥的反應(yīng)物中直接加入水合鹽，釋放出的水進(jìn)入到體系中，鹽水合物在一定溫度和壓力下建立平衡，給出恒定的水活度有機(jī)反應(yīng)體系中水活度的調(diào)控方法四、水對(duì)酶活力選擇性的調(diào)節(jié)由于水對(duì)酶分子柔性的調(diào)節(jié)從而影響酶的立體性質(zhì)；因此，水除了對(duì)非水相中酶活力有影響，而且對(duì)酶的立體選擇性也有一定的調(diào)節(jié)作用第三節(jié)

有機(jī)溶劑對(duì)非水相酶催化的影響引言非水相催化過程中，除了水分對(duì)酶催化條件有影響和調(diào)節(jié)作用外，有機(jī)溶劑作為非水相反應(yīng)的介質(zhì)，對(duì)酶催化也起著重要的作用，主要表現(xiàn)在：對(duì)酶的活性的影響對(duì)酶的穩(wěn)定性的影響對(duì)酶的催化特異性的影響溶劑的極性與lgP值相同的酶在不同的有機(jī)溶劑中酶活力的不同說明有機(jī)溶劑的性質(zhì)與酶活力之間存在著一定的規(guī)律深入了解溶劑的理化性質(zhì)與酶功能的相關(guān)性，其中包括：溶劑的溶解度參數(shù)（δ）、介電常數(shù)（ε）、偶極距（μ）以及分配系數(shù)的對(duì)數(shù)（lgP），發(fā)現(xiàn)lgP與酶活力之間具有最好的相關(guān)性P值為某種溶劑在正辛醇和水中的分配系數(shù)；lgP越大，溶劑的疏水性越大，極性越??；lgP越小，溶劑的親水性越大，極性越大；lgP是有機(jī)溶劑的疏水性參數(shù)1985年Lanne等人提出的用lgP來描述有機(jī)溶劑與酶活力之間的關(guān)系是最常用和可靠的方法一、有機(jī)溶劑對(duì)酶結(jié)合水的影響有機(jī)溶劑可以通過與酶分子水合的水分子作用而直接影響酶的結(jié)構(gòu)與功能疏水性強(qiáng)、極性小的溶劑不易溶解吸附酶必需水，破壞酶的結(jié)構(gòu)和活性的可能性小疏水性弱、極性強(qiáng)的溶劑能夠從酶分子表面奪取維持酶催化結(jié)構(gòu)與功能的必需水，破壞酶的結(jié)構(gòu)和活性的可能性大lgP＜2的極性溶劑（如四氫呋喃、吡啶等）不宜作酶促反應(yīng)的介質(zhì)酶在2＜lgP＜4的中等極性的溶劑（如苯、甲苯、環(huán)己烷）中能夠表現(xiàn)出酶活酶在lgP＞4的非極性溶劑（如烷類、醚、芳香族化合物）中具有較高的酶活力Notice：有機(jī)溶劑中酶的失水與溶劑的疏水參數(shù)（lgP）和介電常數(shù)（ε）相關(guān)，與系統(tǒng)中底物的極性、底物濃度和底物的含水量均有關(guān)系二、有機(jī)溶劑對(duì)底物和產(chǎn)物的影響有機(jī)溶劑與底物、產(chǎn)物之間的極性匹配底物或產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的擴(kuò)散能力（有機(jī)溶劑對(duì)底物應(yīng)具有一定的相容性）底物從有機(jī)溶劑中的析出能力（疏水底物和產(chǎn)物出現(xiàn)溶劑化現(xiàn)象，使疏水底物不容易脫離有機(jī)溶劑，而擴(kuò)散到酶周圍，引起酶活力下降；親水性底物在疏水性較強(qiáng)的溶劑中則容易進(jìn)入酶的活性中心使催化反應(yīng)速度加快）三、有機(jī)溶劑對(duì)酶結(jié)構(gòu)和活性中心的影響只用水活度還不能準(zhǔn)確地預(yù)測有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響雖然在有機(jī)溶劑中酶的總體結(jié)構(gòu)和活性中心的結(jié)構(gòu)都保持完整，但是，酶分子的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)、表面結(jié)構(gòu)和活性中心發(fā)生了變化有機(jī)溶劑對(duì)酶活性中心的影響所引起的催化功能的改變更加敏感和重要極性有機(jī)溶劑破壞了酶蛋白中心的氫鍵、離子鍵，或者造成酶蛋白去折疊而導(dǎo)致酶活性中心的減少非極性有機(jī)溶劑與底物競爭酶的活性中心的結(jié)合點(diǎn)，從而降低了活性中心的極性、減弱了底物與活性中心的結(jié)合能力四、有機(jī)溶劑對(duì)酶活性和選擇性的調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)總的來講，酶在有機(jī)溶劑中所表現(xiàn)出來的催化活力要比在水相中低有機(jī)溶劑對(duì)酶選擇性的調(diào)節(jié)當(dāng)酶處于高介電常數(shù)的有機(jī)溶劑中時(shí)，酶分子柔性提高，選擇性降低當(dāng)酶處于低介電常數(shù)的有機(jī)溶劑中時(shí)，酶分子柔性降低，選擇性增大有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響有機(jī)溶劑對(duì)酶結(jié)合水的影響有機(jī)溶劑對(duì)酶活性中心的影響有機(jī)溶劑對(duì)底物和產(chǎn)物的影響有機(jī)溶劑要利于底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散考慮底物的脫溶劑有機(jī)溶劑應(yīng)該屬于“惰性”不參與催化反應(yīng)有機(jī)溶劑在整個(gè)生物催化的下游過程中分離與純化要容易通過有機(jī)溶劑的選擇調(diào)節(jié)酶活性和選擇性五、有機(jī)溶劑對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響大多數(shù)動(dòng)力學(xué)研究認(rèn)為有機(jī)相中酶促反應(yīng)的過程、機(jī)制與常規(guī)情況下是相同的，符合米氏方程k1k-1k2有機(jī)溶劑對(duì)酶的非水相催化的表觀米氏常數(shù)Km的影響在有機(jī)相中，隨著有機(jī)溶劑的變化，米氏常數(shù)Km是不相同的：極性底物分子在極性有機(jī)溶劑中比在非極性的溶劑中有較高的米氏常數(shù)Km水活度或水含量的將影響水解酶催化酯化或轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的平衡，改變表觀Km值第四節(jié)

非水相中酶催化的特性引言雖然在非水介質(zhì)中酶的活性一般都會(huì)降低，但是酶在非水介質(zhì)中具備了許多水相中所沒有的特性，包括：熱穩(wěn)定性底物特異性立體選擇性區(qū)域選擇性化學(xué)鍵選擇型pH記憶性分子記憶性一、熱穩(wěn)定性酶的熱不穩(wěn)定性分為二種情況當(dāng)酶處于高溫中,隨著時(shí)間延長逐步發(fā)生的不可逆的失去活性由熱誘導(dǎo)的酶分子整體伸展失活,為瞬時(shí)的、可逆的失活在這二種情況下，水通過對(duì)Asn/Gln殘基脫氨和肽鍵的水解對(duì)蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化運(yùn)動(dòng)起關(guān)鍵作用而在非水相催化中，利于酶的熱穩(wěn)定性的提高和改善；在有機(jī)溶劑中，隨著水含量的增加酶的半衰期會(huì)迅速下降酶在無水狀態(tài)下構(gòu)象的剛性，而且缺少在水中引起不可逆熱失活得共價(jià)反應(yīng)，因此酶在無水的有機(jī)溶劑中具有非常好的熱穩(wěn)定性二、底物選擇性底物選擇性的定義：是指酶具有區(qū)分二個(gè)結(jié)構(gòu)相似的不同底物的能力，它主要取決于底物疏水性能的差異許多蛋白酶與底物的結(jié)合能力是氨基酸底物側(cè)鏈與酶的活性中心之間的疏水作用，結(jié)合能力越強(qiáng)，底物越容易反應(yīng)在水相催化中，疏水底物要比親水的底物容易反應(yīng)在有機(jī)相催化中，酶對(duì)疏水性底物和親水性底物的反應(yīng)選擇性發(fā)生改變?nèi)軇┑母淖儠?huì)引起底物在水與有機(jī)溶劑兩相中分配系數(shù)的改變，從而導(dǎo)致在有機(jī)溶劑中底物特異性的改變?nèi)⒘Ⅲw選擇性酶的催化反應(yīng)的立體選擇性是生物催化在有機(jī)合成中最重要價(jià)值的體現(xiàn)，因此不得不花大量的時(shí)間和精力去篩選具有立體選擇性的酶，有機(jī)溶劑能夠改變酶的立體選擇性的發(fā)現(xiàn)，提供了一種有潛力的篩選手段立體選擇性包括：對(duì)映體特異性和前（潛）手性特異性2-(3,5二甲氧苯)-1.3-丙二醇S-單酯R-單酯胰凝乳蛋白酶環(huán)己烷/二異丙醚乙腈/醋酸甲酯四、位置選擇性位置特異性（regioselectivity）就是指酶可以選擇性地催化底物中某個(gè)區(qū)域的基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的能力有機(jī)相中酶的位置特異性也能夠通過溶劑來進(jìn)行控制環(huán)己烷異丙醚RS假單胞菌五、化學(xué)選擇