人教基因工程基本操作程序修改第1頁/共47頁1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個步驟有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。第2頁/共47頁一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請舉出三個以上的例子（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴增3、人工合成請閱讀P9第一和二兩段第3頁/共47頁一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@取1.基因文庫：概念見P92.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類種類基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫3.基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。4.獲取目的基因的根據(jù)：見課本P9第4頁/共47頁提取某種生物的全部DNA用適當?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫5.基因文庫的構(gòu)建方法之一（1）直接分離法(鳥槍法)第5頁/共47頁某種生物的單鏈mRNA單鏈互補DNA雙鏈cDNA片段導入受體菌中儲存與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄法：cDNA的合成流程圖解5.基因文庫的構(gòu)建方法之第6頁/共47頁基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較第7頁/共47頁

概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術(shù)聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段原理：DNA復制2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因第8頁/共47頁四種脫氧核苷酸(dNTP)

一對引物：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)

Mg2+(激活劑)條件：緩沖溶液一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物前提：第9頁/共47頁

過程高溫變性（解旋為單鏈）低溫退火（引物與單鏈互補結(jié)合）適溫延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補的DNA雙鏈）重復循環(huán)預變性（增加DNA變性的概率）第10頁/共47頁2、具體過程第11頁/共47頁PCR(多聚酶鏈式反應) 第12頁/共47頁①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.等②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA復制四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）第13頁/共47頁⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第14頁/共47頁PCR技術(shù)擴增與DNA復制的比較PCR技術(shù)DNA復制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制細胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子第15頁/共47頁目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：3、人工合成的目的基因第16頁/共47頁二、基因表達載體的構(gòu)建

——基因工程的核心1、目的：所需物質(zhì)：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。它們各自的作用是什么?第17頁/共47頁2、基因表達載體的組成：復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因它們各自的作用是什么?第18頁/共47頁啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來第19頁/共47頁①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意第20頁/共47頁三、將目的基因?qū)胧荏w細胞（一）轉(zhuǎn)化：（二）方法將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達第21頁/共47頁1、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ海?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。第22頁/共47頁③過程：④優(yōu)點第23頁/共47頁（2）基因槍法（3）花粉管通道法第24頁/共47頁2、將目的基因?qū)雱游锛毎俜椒ǎ猴@微注射法②程序：目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物第25頁/共47頁3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎僭松锾攸c：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少②方法：

用Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子第26頁/共47頁四、目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功第27頁/共47頁（一）、檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(關(guān)鍵步驟)①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:第28頁/共47頁歸納步驟第29頁/共47頁DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P15思考與探究第30頁/共47頁（二）、鑒定（個體生物學水平）2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過程:

用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA第31頁/共47頁歸納步驟第32頁/共47頁(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定——①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交第33頁/共47頁歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構(gòu)建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：第34頁/共47頁練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）aa第35頁/共47頁練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和

法。（3）由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用

技術(shù)，該技術(shù)的核心是

和

。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的

作探針進行分子雜交檢測，又要用

方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性?；驑尫ǎɑǚ酃芡ǖ婪ǎ┲参锝M織培養(yǎng)脫分化和再分化耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌第36頁/共47頁1）以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體

C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C練習第37頁/共47頁2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是

A、能復制（）

B、有多個限制酶切點

C、具有標記基因

D、它是環(huán)狀DNAD練習第38頁/共47頁3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）

A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運載體導入受體細胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A練習第39頁/共47頁4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為運載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D練習第40頁/共47頁5）基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與運載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細胞

D、目的基因的檢測和表達C練習第41頁/共47頁知識點一：1.原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合