/Agilent1100高效液相色譜儀操作規(guī)程操作說明：1.開機(jī)前準(zhǔn)備：1.1儀器設(shè)備：Agilent1200LC●G1322A<在線脫氣機(jī)>?！馟1311A<四元泵>?！馟1329A〔標(biāo)準(zhǔn)型自動進(jìn)樣器?！馟1316A〔柱溫箱?！馟1315A〔DAD檢測器?！裆V柱1.2溶劑準(zhǔn)備：●有機(jī)相必須是色譜級純?！袼啾仨毷嵌握麴s水或用二級蒸餾水配置的緩沖鹽溶液、酸堿溶液?！窳鲃酉嗍褂们氨仨氝^0.45μm的微孔濾膜。有機(jī)相和水相微孔濾膜的選擇參考下表。產(chǎn)品類別代表產(chǎn)品品系產(chǎn)品特點纖維素酯類混合纖維素膜〔CN-CA水相成孔性能好,親水性好,材料成本低?？赡拖∷帷２贿m合于酮類、酯類、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿類液體過濾。聚酰胺類尼龍6〔PA-6通用具有親水性,較耐堿不耐酸。在酮、酚、醚及高分子醇類不被腐蝕。聚砜類聚砜〔PS通用良好的化學(xué)和熱穩(wěn)定性,耐輻射,機(jī)械強(qiáng)度高。聚偏氟乙烯/聚四氟乙烯膜PDEF/PTFE有機(jī)PDEF耐化學(xué)腐蝕,耐氧化,耐高溫,疏水性〔酒精處理后變清水性,PTFE耐酸堿性強(qiáng)。聚烯烴類聚丙烯膜〔PP有機(jī)具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性,耐酸堿和各種有機(jī)溶劑。價格便宜,但孔徑分布寬。無機(jī)材料陶瓷、玻璃BP、金屬膜通用耐高溫,耐有機(jī)溶劑、耐生物降解等。2.基本操作步驟:<一>、開機(jī)：1、打開計算機(jī),進(jìn)入中文WindowsXP畫面,并運行CAGBootpServer程序〔部分安裝程序不需要運行Bootp。2、打開1200LC各模塊電源。3、待各模塊自檢完成后,雙擊"儀器1聯(lián)機(jī)"圖標(biāo),化學(xué)工作站自動與1200LC通訊,進(jìn)入的工作站畫面如下所示。4、從"視圖"菜單中選擇"方法和運行控制"畫面,點擊"視圖"菜單中的"儀器實際值包括了"進(jìn)樣器狀態(tài)","四元泵狀態(tài)","柱溫箱狀態(tài)","DAD狀態(tài)"。","在線光譜顯示當(dāng)前光譜,可以調(diào)整"吸光度范圍"?！?至4000mAU,步長為1,缺省值為2000mAU。","化學(xué)工作站狀態(tài)顯示化學(xué)工作站就緒情況。","系統(tǒng)視圖","樣品視圖",使其命令前有"√"標(biāo)志,來調(diào)用所需的界面。包括了"進(jìn)樣器狀態(tài)","四元泵狀態(tài)","柱溫箱狀態(tài)","DAD狀態(tài)"。顯示當(dāng)前光譜,可以調(diào)整"吸光度范圍"?！?至4000mAU,步長為1,缺省值為2000mAU。顯示化學(xué)工作站就緒情況。5、把流動相放入溶劑瓶中。6、打開沖洗閥。7、點擊"泵"圖標(biāo),點擊"設(shè)置泵…"選項,進(jìn)入泵編輯畫面。8、設(shè)流速：5ml/min,點擊"確定"。9、點擊"泵"圖標(biāo),點擊"控制…"選項,選中"啟動""待機(jī)"就是泵馬達(dá)仍處于激活狀態(tài),再次打開泵時,無需對其進(jìn)行重新初始化。,點擊"確定"方法出錯時,可以選擇"使用當(dāng)前方法",用于確保檢測到儀器錯誤時,泵能夠以受控制的方式關(guān)閉。具體操作為："待機(jī)"就是泵馬達(dá)仍處于激活狀態(tài),再次打開泵時,無需對其進(jìn)行重新初始化。方法出錯時,可以選擇"使用當(dāng)前方法",用于確保檢測到儀器錯誤時,泵能夠以受控制的方式關(guān)閉。具體操作為：當(dāng)前方法將立即復(fù)制到泵,并保存為"錯誤方法"。檢測到儀器錯誤時,泵將自動執(zhí)行此方法。10、點擊"泵"圖標(biāo),點擊"控制…"選項,選中"關(guān)閉",點擊"確定"關(guān)泵,關(guān)閉沖洗閥。11、點擊"泵"圖標(biāo),點擊"設(shè)置泵…選項",設(shè)流速：例如1.0ml/min。12、點擊泵下面的瓶圖標(biāo),如下圖所示〔以單元泵為例,輸入溶劑的實際體積和瓶體積。也可輸入停泵的體積,點擊"確定"。13、點擊"泵"圖標(biāo),點擊"泵輔助設(shè)定…",設(shè)定"最流速梯度您可以為溶劑流量的變化速率設(shè)定一個限制,以保護(hù)您的分析柱。限值：0.1至100ml/min/min。缺省值為100ml/min/min。","最小沖程此參數(shù)定義活塞1的一個沖程轉(zhuǎn)移的流動相的體積。泵的沖程體積影響混合性能和梯度線性。當(dāng)沖程被設(shè)置為"自動"〔缺省值時,泵將根據(jù)設(shè)定的流速選擇沖程體積。在流速最大為100μl/min時泵使用20μl沖程,在流速為5ml/min時沖程以線性方式增加到100μl。流速在5ml/min和10ml/min之間時,沖程始終為100μl。您可以將最小沖程設(shè)置為介于20和100μl之間的值。如果您選擇的最小沖程小于以"自動"模式運行的泵將使用的最小沖程,泵將使用較大的沖程體積。","壓縮因子流動相的壓縮因子可以影響泵的性能。要獲得最佳的流量準(zhǔn)確度和混合性能,您可以根據(jù)所使用的流動相來設(shè)置該參數(shù)。壓縮因子的缺省值為100*10-6。如果四元泵混合了壓縮因子差別很大的溶劑〔例如水和甲醇,則建議您使用此缺省值。限值：0到150。","主通道"您可以為溶劑流量的變化速率設(shè)定一個限制,以保護(hù)您的分析柱。限值：0.1至100ml/min/min。缺省值為100ml/min/min。此參數(shù)定義活塞1的一個沖程轉(zhuǎn)移的流動相的體積。泵的沖程體積影響混合性能和梯度線性。當(dāng)沖程被設(shè)置為"自動"〔缺省值時,泵將根據(jù)設(shè)定的流速選擇沖程體積。在流速最大為100μl/min時泵使用20μl沖程,在流速為5ml/min時沖程以線性方式增加到100μl。流速在5ml/min和10ml/min之間時,沖程始終為100μl。您可以將最小沖程設(shè)置為介于20和100μl之間的值。如果您選擇的最小沖程小于以"自動"模式運行的泵將使用的最小沖程,泵將使用較大的沖程體積。流動相的壓縮因子可以影響泵的性能。要獲得最佳的流量準(zhǔn)確度和混合性能,您可以根據(jù)所使用的流動相來設(shè)置該參數(shù)。壓縮因子的缺省值為100*10-6。如果四元泵混合了壓縮因子差別很大的溶劑〔例如水和甲醇,則建議您使用此缺省值。限值：0到150。〔二、數(shù)據(jù)采集方法編輯：1、開始編輯完整方法：●從"方法"菜單中選擇"編輯完整方法…"項,如下圖所示選中除"數(shù)據(jù)分析"外的三項,點擊"確定",進(jìn)入下一畫面。2、方法信息：●在"方法注釋"中加入方法的信息〔如：測試方法?！顸c擊"確定",進(jìn)入下一畫面。3、泵參數(shù)設(shè)定：〔以四元泵為例●在"流速"處輸入流量,如1ml/min,在"溶劑B"處輸入80.0,<A=100-B-C-D>,也可"插入"一行"時間表",編輯梯度。在"壓力限"處輸入柱子的最大耐高壓,以保護(hù)柱子。●點擊"確定",進(jìn)入下一畫面。4、自動進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)定:〔以標(biāo)準(zhǔn)G1329A為例●選擇合適的進(jìn)樣方式,如圖所示,進(jìn)樣體積5.0ul,洗瓶位置為6號。"標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣"只能輸入進(jìn)樣體積,此方式無洗針功能。"洗針進(jìn)樣"可以輸入進(jìn)樣體積和洗瓶位置,此方式針從樣品瓶抽完樣品后,會在洗瓶中洗針。"使用進(jìn)樣器程序"可以點擊"編輯"抽?。菏棺詣舆M(jìn)樣器能夠從指定源抽取樣品。排出：移動到指定位置,并從針中排出指定的量。抽?。菏棺詣舆M(jìn)樣器能夠從指定源抽取樣品。排出：移動到指定位置,并從針中排出指定的量?；旌希和ㄟ^前后移動進(jìn)樣器活塞從而在空氣或針座中混合抽取量?；旌希和ㄟ^將針移至針座、將閥從旁路切換至主路并生成開始脈沖來完成進(jìn)樣。靜置：自動進(jìn)樣器等待的指定時間〔0至99999分鐘……●"最優(yōu)化"有"無將不優(yōu)化。","重疊進(jìn)樣周期將在檢測過程中將下一針樣品抽取到進(jìn)樣器中等待,并可以設(shè)置等待時間,以節(jié)約檢測時間,但具有較大風(fēng)險性,具體見說明"和"預(yù)取進(jìn)樣瓶將在檢測過程中將下一針樣品放置于針旁邊等待,并可以設(shè)置等待時間,以節(jié)約檢測時間,具體見說明",可以根據(jù)實際情況選擇。將不優(yōu)化。將在檢測過程中將下一針樣品抽取到進(jìn)樣器中等待,并可以設(shè)置等待時間,以節(jié)約檢測時間,但具有較大風(fēng)險性,具體見說明將在檢測過程中將下一針樣品放置于針旁邊等待,并可以設(shè)置等待時間,以節(jié)約檢測時間,具體見說明●點擊進(jìn)"確定",進(jìn)入下一畫面。5、柱溫箱參數(shù)設(shè)定:●在"溫度"下面的空白方框內(nèi)輸入所需溫度,如：40度。并選中它,點擊"更多>>"鍵,如圖所示,選中"與左側(cè)相同",使柱溫箱的溫度左右一致?！顸c擊"確定",進(jìn)入下一畫面。6、檢測器參數(shù)設(shè)定:6.1、VWD檢測器●在"波長"下方的空白處輸入所需的檢測波長,如254nm,在"峰寬<響應(yīng)時間>"下方點擊下拉式箭頭,選擇合適的響應(yīng)時間,如>0.1min<2s>?！裨?時間表"中可以"插入"一行,輸入隨時間切換的波長,如1min,波長=300nm。點擊"確定",進(jìn)入下一畫面。6.2、DWD檢測器7、在"運行時選項表"中選中"數(shù)據(jù)采集"將方法和數(shù)據(jù)保存在一起"提供了一種可以在以后重構(gòu)分析的方法,即使在這期間方法已更改。您可以看到方法中或選定參數(shù)中的更改對分析產(chǎn)生的影響,有助于對方法進(jìn)行優(yōu)化。如果您希望化學(xué)工作站使用標(biāo)準(zhǔn)宏"將方法和數(shù)據(jù)保存在一起"提供了一種可以在以后重構(gòu)分析的方法,即使在這期間方法已更改。您可以看到方法中或選定參數(shù)中的更改對分析產(chǎn)生的影響,有助于對方法進(jìn)行優(yōu)化。如果您希望化學(xué)工作站使用標(biāo)準(zhǔn)宏RunDAMethod分析從運行中收集的數(shù)據(jù),請選擇"標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)分析"。如果您希望化學(xué)工作站根據(jù)其他宏而不是標(biāo)準(zhǔn)宏<RunDAMethod>分析所收集的數(shù)據(jù),請選擇"自定義數(shù)據(jù)分析宏"。并在相應(yīng)的文本框中輸入您準(zhǔn)備好的宏名稱。8、點擊"方法"菜單,選中"方法另存為…",輸入一方法名,如"測試",點擊"確定"。9、從菜單"視圖"中選中"在線信號",選中"信號窗口1",然后點擊"改變…"鈕,將所要繪圖的信號移到右邊的框中,點擊"確定"。<如同時檢測二個信號,則重復(fù)此操作,選中"信號窗口2"。單擊"改變單擊"改變"鍵,即可彈出右側(cè)的"編輯信號圖譜"窗口,進(jìn)而選擇所需的譜圖信號。10、點擊"確定",從"儀器"菜單選擇"系統(tǒng)開啟"?！踩?、序列的設(shè)置1、從"序列"菜單中,打開"序列表…",光標(biāo)至于"行1",單擊"剪切",去除"行1",再單擊"插入/批量輸入向?qū)?。2、設(shè)置"操作"為"追加","開始位置"為"1","插入行數(shù)"為所需的樣品數(shù),如"3","方法名稱"為"測試","樣品名稱"為"排毒清脂片","進(jìn)樣次數(shù)"為"3","樣品類型"為"樣品"或"標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)""質(zhì)控物質(zhì)",點擊"確定"：3、光標(biāo)至于"行3"、單擊"追加一行",設(shè)置沖洗儀器和色譜柱的樣品和方法,"方法名稱"選擇已經(jīng)設(shè)置好的"水醇洗柱"。4、單擊"確定",完成序列設(shè)置。5、從"序列"菜單中,打開"序列參數(shù)"選項,如下圖所示,輸入操作者名稱,如"安裝工程師"；在"數(shù)據(jù)文件"中選擇"手動"或"前綴/計數(shù)器"區(qū)別:手動--每次做樣之前必須給出新名字,否則儀器會將上次的數(shù)據(jù)覆蓋掉?！趨^(qū)別:手動--每次做樣之前必須給出新名字,否則儀器會將上次的數(shù)據(jù)覆蓋掉?！谇熬Y/計數(shù)器"前綴"框中輸入前綴,在"計數(shù)器"框中輸入計數(shù)器的起始位,儀器會自動命名,如vwd數(shù)據(jù)0001,vwd數(shù)據(jù)0002……。6、從"序列"菜單中,打開"保存序列"選項,輸入"文件名",如"測試",單擊"確定",完成設(shè)置。7、等儀器準(zhǔn)備好,基線平穩(wěn),從"運行控制"菜單中選擇"運行序列",進(jìn)樣〔或者從操作界面上點擊"開始",進(jìn)樣。<若無自動進(jìn)樣器,則基線平穩(wěn)后,進(jìn)樣并搬動手動進(jìn)樣閥,啟動運行。>〔DAD,VWD色譜圖如下所示：〔四、數(shù)據(jù)分析方法編輯:1、從"視圖"菜單中,點擊"數(shù)據(jù)分析在線檢驗的時候是不能打開聯(lián)機(jī)分析的,只能重新打開脫機(jī)分析,軟件會自動提醒打開。"進(jìn)入數(shù)據(jù)分析畫面。在線檢驗的時候是不能打開聯(lián)機(jī)分析的,只能重新打開脫機(jī)分析,軟件會自動提醒打開。2、從"文件"菜單選擇"調(diào)用信號",選中您的數(shù)據(jù)文件名,如下圖所示。點擊"確定",則數(shù)據(jù)被調(diào)出。3、做譜圖優(yōu)化：從"圖形"菜單中選擇"信號選項",如下圖所示。從"范圍"中選擇"滿量程"或"自動量程"及合適的時間范圍或選擇"自定義量程"調(diào)整。反復(fù)進(jìn)行,直到圖的比例合適為止。點擊"確定"。4、積分:●從"積分"菜單中選擇"積分事件"選項,如下圖所示。選擇合適的"斜率靈敏度","峰寬","最小峰面積","最小峰高"?！駨?積分"菜單中選擇"積分"選項,則數(shù)據(jù)被積分?！袢绶e分結(jié)果不理想,則修改相應(yīng)的積分參數(shù)經(jīng)典：接受基線滲透。無滲透經(jīng)典：接受基線滲透。無滲透：通過重新建立基線來消除基線滲透。高級：積分器嘗試優(yōu)化峰的開始位置和結(jié)束位置、重新建立峰束基線并消除基線滲透?！顸c擊左邊"√"圖標(biāo),將積分參數(shù)存入方法該方法必須是獨立的與本檢驗相關(guān)的方法,不能是其他產(chǎn)品的方法,比如"丹參含測"分析方法不能保存為"人參檢驗"。。該方法必須是獨立的與本檢驗相關(guān)的方法,不能是其他產(chǎn)品的方法,比如"丹參含測"分析方法不能保存為"人參檢驗"。5、打印報告:●從"報告"菜單中選擇"設(shè)定報告"選項,進(jìn)入如下圖所示畫面?！顸c擊"定量結(jié)果"框中"計算"右側(cè)的黑三角,選中"面積百分比",其它選項不變?！顸c擊"確定"?！駨?報告"菜單中選擇"打印報告",則報告結(jié)果將打印到屏幕上,如想輸出到打印機(jī)上,則點擊"報告"底部的"打印"鈕。<四>、關(guān)機(jī):●關(guān)機(jī)前,先關(guān)燈,并必須用相應(yīng)的溶劑充分沖洗系統(tǒng)?！裢顺龌瘜W(xué)工作站,依提示關(guān)泵,及其它窗口,關(guān)閉計算機(jī)。●關(guān)閉Agilent1200各模塊電源開關(guān)。<五>、Agilent1200LC維護(hù)保養(yǎng)：1、色譜柱長時間不用,存放時,柱內(nèi)應(yīng)充滿溶劑,兩端封死〔如乙腈/甲醇適于反相色譜柱,正相色譜柱用相應(yīng)的有機(jī)相。2、手動進(jìn)樣器,當(dāng)使用緩沖溶液時,要用水沖洗進(jìn)樣口。3、流動相使用前必須過濾,不要使用多日存放的蒸餾水〔易長菌。4、帶seal-wash的1200,要配制90%水+10%異丙醇,開啟seal-wash清洗泵,溶劑不能干涸。5、注意事項見說明書,或由現(xiàn)場工程師介紹。<六>、維護(hù)知識問答為什么溶劑和樣品要過濾?溶劑和樣品過濾非常重要,它會對色譜柱、儀器起到保護(hù)作用,消除由于污染對分析結(jié)果的影響。色譜柱：由于填料顆粒很細(xì),色譜柱內(nèi)腔很小,溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損,同時也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。為什么HPLC用緩沖鹽時要加在線Seal-wash選項？HPLC用緩沖鹽時,由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象,析出的細(xì)小鹽粒非常堅硬,它附著在藍(lán)寶石活塞桿上,隨著藍(lán)寶石活塞桿的往復(fù)運動,容易產(chǎn)生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現(xiàn)象。在線Seal-wash選項能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。緩沖鹽的濃度在0.1mol或大于0.1mol時,必須使用該在線沖洗選項.清洗液配制:90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類生長和減小水的表面張力,不能干涸。為什么Agilent1200LC的流動相管路非常細(xì)?在使用HPLC時,應(yīng)特別注意"柱外效應(yīng)"對分析結(jié)果的影響,由于樣品分子在液體流動相中的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體中小4～5個數(shù)量級,液體流動相的流速也比氣相慢1～2個數(shù)量級。因此,樣品進(jìn)入色譜柱后,在柱子以外的任何死體積〔進(jìn)樣器、柱接頭、連接管、檢測器中,樣品分子的擴(kuò)散和滯留,都會引起色譜峰的展寬,而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之最小,獲得理想的分析結(jié)果,Agilent1200LC使用加工工藝難度高的毛細(xì)管線作為流動相管路。毛細(xì)管線分類：0.17mm內(nèi)徑綠色;0.12mm內(nèi)徑紅色。PEEK管線：內(nèi)徑0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。毛細(xì)管線優(yōu)點:柔韌性好.***Agilent公司同時備有1/16in的粗外徑毛細(xì)管線,適用于不同習(xí)慣的用戶,優(yōu)點是剛性好,但柔韌性差一些。流動相使用前為什么要脫氣？流動相使用前必須進(jìn)行脫氣處理,以除去其中溶解的氣體〔如O2,以防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時,因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音,造成靈敏度下降,甚至無法分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化,柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD,可能會造成熒光猝滅。常用的脫氣方法比較：氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低,連續(xù)吹氦脫氣,效果較好,但成本高。加熱回流法：效果較好,但操作復(fù)雜,且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中,用超聲波振蕩10-15min,此法效果最差。在線真空脫氣法：Agilent1200LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù),在線脫氣,智能控制,無需額外操作,成本低,脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法,并適用于多元溶劑體系。5、如何防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞,以及堵塞后的處理？溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類的生長會堵塞溶劑過濾器,從而影響泵的運行,尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液〔PH=4—7。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞。A：請嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過濾。B：請勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液C：如果應(yīng)用許可,可在溶劑中加入0.00010.001M的疊氮化鈉.D:在溶劑瓶內(nèi)溶劑的上方小流量連續(xù)吹氬氣,以隔絕空氣。E：避免使溶劑瓶暴露在直射陽光下,盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液。Agilent1200LC泵如何維護(hù)？Agilent1200LC泵給色譜柱提供穩(wěn)定、無脈動、流量準(zhǔn)確的流動相,及時合理的維護(hù)非常重要。A：流動相使用前請必須脫氣、過濾。B：使用緩沖鹽時,要加在線Seal-wash選項。C：關(guān)機(jī)前,用相應(yīng)的溶劑充分沖洗系統(tǒng)。D：及時更換PurgeValve內(nèi)的過濾芯?！伯?dāng)打開PurgeValve時,壓力高