經(jīng)典word整理文檔，僅參考，雙擊此處可刪除頁眉頁腳。本資料屬于網(wǎng)絡(luò)整理，如有侵權(quán)，請聯(lián)系刪除，謝謝！分子生物學(xué)作業(yè)開題報告::::::::::::精選文庫32P同位素敷貼對皮膚早期損傷一、（一）研究意義：32P同位素敷貼治療是一種短距離放射治療，由于其作用部位局限，放射劑量較小，制作簡易使用方便，目前在臨床被廣泛地應(yīng)用各種皮膚疾病，如血管瘤、跖疣、瘢痕疙瘩等，并取得了很好的療效。目前關(guān)于PP敷貼對小兒血管瘤的治療）3232的報道文獻(xiàn)一致認(rèn)為，P同位素敷貼作用于局部，放射劑量小，治32療副作用很小，近期的副反應(yīng)很輕。但是這些報道都是基于近期[1]的臨床觀察，而對于小劑量以及皮膚局部使用P同位素是否會引起32機體的損傷，尚缺乏實驗依據(jù)。放射線是一種明確的致癌因素。盡管P同位素敷貼治療劑量小，32P同位素敷貼治療，仍可能具有潛在的不安全32性。此外，根據(jù)目前在全世界范圍內(nèi)作為輻射防護指導(dǎo)LNT（Linearno-threshold）假說不管有多低都有致癌潛能，換[2]句話說,輻射對機體沒有安全閾值。越來越多的證據(jù)還表明，嬰幼兒及兒童對放射引發(fā)癌癥的易感性比成人高，早年的（嬰幼兒、兒童及青少年時期）放射治療或影像學(xué)診斷也會增加日后癌癥發(fā)生的風(fēng)險[3,。4]--2精選文庫因此，P同位素敷貼治療，尤其是在特定人群（嬰幼兒或兒童32等）及一些能夠找到替代治療的疾病（如嬰幼兒血管瘤）中，是否會因放射產(chǎn)生早期損傷以及遠(yuǎn)期效應(yīng)遺傳毒性，甚至致癌性)，急需要去闡明。（二）同類研究工作國內(nèi)外研究現(xiàn)狀與存在問題及立論依據(jù)32P同位素發(fā)射純0.695MeV平均射程為體內(nèi)外實驗及臨床用藥表明，P同位素可以引起[5]32機體的損傷，也可以引起機體癌癥發(fā)生，其中，P同位素所引起[6]32皮膚的癌癥也有報道。此外，更加值得觀注的是，流行病學(xué)表明，[7]幼年時使用放射性同位素治療皮膚血管瘤會大大增加日后發(fā)生腫瘤[4,8]HaddyN所報道的幼年時使用放射性同位素治療皮膚血管瘤會大大增加日后乳腺癌、甲狀腺癌，KarlssonP也報道了顱內(nèi)腫[9]瘤與幼年時使用放射性同位素治療皮膚血管瘤明顯相關(guān)[10]，以及BennettRG所報道的血管肉瘤等等但是P同位素敷貼治療，是[11]32。否會引起皮膚組織損傷，尤其是對于特定的人群（如嬰幼兒）是否引起遠(yuǎn)期損傷，甚至是否引起癌變或遺傳毒性，尚缺乏實驗依據(jù)。眾所周知，機體暴露于電離輻射時，能引起廣泛的DNA多部位DNA核苷酸堿基的損傷，DNADNAdouble-strandbreaks，DSBs)，以及DNA和DNA或DNA和蛋白的橋連等。DNADNA損傷或無法修復(fù)的DNADNA的損傷是屬于組織早期損傷的范疇，DNA損傷也可以作為機--3精選文庫體早期損傷的一個依據(jù)。機體在應(yīng)對輻射所致的DNA損傷時，會啟動一系列的保護機制，如細(xì)胞周期檢查、DNA修復(fù)機制等。ATM在DNADSBs時，被招募至DNA損傷部位）并被激活，啟動細(xì)胞周期檢查及DNA修復(fù)ATMCHK2、[12]H2AX以及重要的p53.H2AX被磷酸化后稱為γH2AX，能夠招募與CHK2/P53DNA修復(fù)相關(guān)的BRAC1等至DNA損傷灶。體外實驗也表明，P同位素能夠引起ATM[13]32信號路的激活，引起ATM/γH2AX的高表達(dá)。因此，可以通過檢測ATM、γH2AX，來直接反映DNA的損傷（尤其是雙鏈DNA損傷或DNADSBs誘導(dǎo)DNA-PK高表達(dá)，DNA-PK是參與DNA修復(fù)的重要的酶。[14]因此，通過檢測，可以間接反映DNA雙鏈損傷。與致癌風(fēng)險關(guān)系，還沒有明確的定論，但是細(xì)胞DNA是放射生物學(xué)效應(yīng)重要的作用位點，卻是為大家所公認(rèn)的。目前的理論認(rèn)為,堿基尤其是胸腺嘧啶的損傷容易導(dǎo)致突變。未被修復(fù)或錯誤修復(fù)的DNA損傷，將會引起復(fù)制錯誤，甚至突變。DSBs的錯誤修復(fù)是引發(fā)的染色體畸變及基因突變最重要的因素。盡管DSBs能夠通過同源重[15]組的方法被完好修復(fù)但是電離輻射所引DSBs絕大多數(shù)都是通過異non-homologousendjoining）修復(fù)的，而這種修復(fù)過程易于出錯。因此，輻射導(dǎo)致的DNA損傷具有較高的突變潛能。[16]--4精選文庫此外，非致命性的DNA損傷未被修復(fù)，會被傳至子代細(xì)胞累積。電離輻射會增加DNA的損傷，對于未修D(zhuǎn)NA損傷的尤其是對快速分DNADSBs也會增加染色體重排的產(chǎn)生，引起雜合性缺失可能，從而引起某些抑癌基因的失活,誘導(dǎo)癌癥發(fā)生。由此可見，機體DNA的損傷所引起基因突變是導(dǎo)致機體發(fā)[17]DNADNADSBs因素。基于以上論述，探索放射性引起機體DNADSBs損傷及染色質(zhì)畸變甚至是基因突變，顯然對探索P同位素敷貼治療的早期損傷以32及遠(yuǎn)期副作用（致癌性）具有重要的意義。參考文獻(xiàn)1.2.魏敬軍,王育敏,王嘉軍等.32P治療體表血管瘤的療效觀察.中華皮膚科雜志.2003;36(12):685-686.EvaluationoftheLinear-NonthresholdDose-ResponseModelforIonizingRadiation(NCRPReportNo136).JournalofRadiologicalProtection.2002;22(3):331-335.3.KuhnsLR,OliverWJ,ChristodoulouE,GoodsittMM.Thepredictedincreasedcancerriskassociatedwithasinglecomputedtomographyexaminationforcalculusdetectioninpediatricpatientscomparedwiththenaturalcancerincidence.PediatrEmergCare.2011Apr;27(4):345-50.LindbergS,KarlssonP,ArvidssonB,HolmbergE,LunbergLM,WallgrenA.Cancerincidenceafterradiotherapyforskinhaemangiomaduringinfancy.ActaOncol.1995;34(6):735-40.4.5.WhiteJS,YueN,HuJ,BakkenistCJ.TheATMkinasesignalinginducedbythelow-energy-particlesemittedby(33)Pisessentialforthesuppressionof--5精選文庫chromosomeaberrationsandisgreaterthanthatinducedbytheenergeticβ-particlesemittedby(32)P.MutatRes.2011Mar15;708(1-2):28-36.Acaro?luRE,G?güsT,ErcanMT,SungurA.Experimentalinductionofosteosarcomabysubperiostealradioactivephosphorusinjectionsinrats.NuclMedBiol.1995Feb;22(2):231-.UbiosAM,SilbermanFS,CabriniRL.Radioactive-inducedtumorsbyphosphorus-32ascolloidalcompound.Cancer.1983May1;51(9):1605-9.DondondeVathaireF,ShamsaldinA,DoyonF,DialloI,LigotL,PaolettiC,LabbéM,AbbasM,ChavaudraJ,AvrilMF,FraguP,EschwègeF.Cancermortalityafterradiotherapyforaskinhemangiomaduringchildhood.RadiotherOncol.2004Jul;72(1):87-93.9.HaddyN,DondonPaolettiC,RubinoC,MousannifA,ShamsaldinA,DoyonF,LabbéM,RobertC,AvrilMF,DemarsR,MolinieF,LefkopoulosD,DialloI,deVathaireF.Breastcancerfollowingradiotherapyforahemangiomaduringchildhood.CancerCausesControl.2010Nov;21(11):1807-16.Epub2010Jul5.KarlssonP,HolmbergE,LundbergLM,NordborgC,WallgrenA.Intracranialtumorsafterradiumtreatmentforskinhemangiomaduringinfancy--acohortandcase-controlstudy.RadiatRes.1997Aug;148(2):161-7.BennettKellerJW,DittyJFJr.Hemangiosarcomasubsequenttoradiotherapyforahemangiomaininfancy.JDermatolSurgOncol.1978Nov;4(11):881-3.TichyA,VávrováJ,PejchalJ,RezácováM.Ataxia-telangiectasiamutatedkinase(ATM)asacentralregulatorofradiation-inducedDNAdamageresponse.ActaMedica(HradecKralove).2010;53(1):13-7.PaullTT,RogakouEP,YamazakiKirchgessnerCU,GellertM,BonnerWM.AcriticalroleforhistoneH2AXinrecruitmentofrepairfactorstonuclearfociafterDNAdamage.CurrBiol.2000Jul27-Aug10;10(15):886-95.AndersonJA,HarperJV,CucinottaFA,O'NeillP.ParticipationofDNA-PKcsinDSBrepairafterexposuretohigh-andlow-LETradiation.RadiatRes.2010Aug;174(2):195-205.GoodheadDT.Initialeventsinthecellulareffectsofionizingradiations:clustereddamageinDNA.IntJRadiatBiol.1994Jan;65(1):7-17.LittleJB.Radiationcarcinogenesis.Carcinogenesis.2000Mar;21(3):397-404.BordeianuZugun-EloaeF,RusuroleofDNArepairbyhomologousrecombinationinoncogenesis.RevMedChirSocMedNatIasi.2011Oct-Dec;115(4):1189-94.16.17.--6精選文庫二，研究內(nèi)容、研究目標(biāo)和擬解決的關(guān)鍵問題：（一）研究內(nèi)容：本課題從P同位素敷貼治療對SD幼鼠皮膚遺傳物質(zhì)的影響進(jìn)行32DNADSBs損傷及染色質(zhì)畸變甚至是基因突變）的實驗依據(jù)。分如下幾方面的內(nèi)容：1.32P同位素敷貼治療模型的建立：建立同位素敷貼的SD幼鼠治療模型。2.P同位素敷貼對SD幼鼠皮膚DNA的作用：32（1）從總體水平用慧星實驗初步檢測SD幼鼠皮膚組織細(xì)胞有無DNA損傷。（2）P同位素敷貼對SD幼鼠皮膚組織細(xì)胞DNA雙鏈損傷指32標(biāo)ATMγH2AX影響：從轉(zhuǎn)錄及蛋白水平檢測32P同位素敷貼是否引起SD幼鼠皮膚組織細(xì)胞ATMγH2AX表達(dá)水平升高。（3）P同位素敷貼對SD幼鼠皮膚組織細(xì)胞DNA雙鏈損傷修32復(fù)指標(biāo)DNA-PKP同位素敷貼是否32引起SD幼鼠皮膚組織細(xì)胞DNA-PK表達(dá)水平的升高。3.P同位素敷貼對SD幼鼠皮膚染色質(zhì)（或染色體）影響32檢測P同位素敷貼對SD32畸變，檢測潛在的致突變性（二）研究究目標(biāo)：通過對P同位素敷貼對皮膚的遺傳物質(zhì)的影響的檢測，研究P3232同位素敷貼是否引起皮膚組織、染色體（質(zhì)）的損傷及潛在的突變，初步評估P同位素敷貼治療的安全性從以及在嬰幼兒血管瘤32--7精選文庫中應(yīng)用的最終效益。（三）擬解決的關(guān)鍵問題：（1）P同位素敷貼是否引起SD幼鼠皮膚遺傳物質(zhì)的損傷？32（western-Blot檢測ATMγH2AXDNA-PK蛋白的表達(dá)水平及染色體制備及鼠的染色體觀察。三擬采取的研究方法、步驟、技術(shù)路線及可行性分析：、（一）研究方法：1.慧星實驗：總體上檢測DNA損傷慧星掃尾的現(xiàn)象。2.RT-PCR：用于從轉(zhuǎn)錄水平檢測ATMγH2AXDNA-PKmRNA的表達(dá)。3.western-Blot：用于蛋白水平檢測ATM、γH2AX、DNA-PK蛋白的表達(dá)。4.形態(tài)學(xué)觀察：觀察染色體是否有形態(tài)學(xué)改變。5.微核實驗（themicronucleus傳毒性（致突變性）6．?dāng)?shù)據(jù)統(tǒng)計：所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS14.0軟件，用單因素方差分析或卡方檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（二）步驟1.P同位素敷貼治療模型的建立：32選SD幼鼠（1-2周）40只，隨機分成四組，參考臨床使用P同32位素敷貼的方法及劑量（緊密貼敷并固定于皮膚表面，采用每敷貼10μCi，貼敷30μCi5μCi10μCi20μCi劑量，均貼敷滿72小時后，處死動物，采外周血（或骨髓）分別取敷貼處組織。每組5只鼠取部分組織，快速凍于液氮，每組的另外5只，取新鮮組織用于慧星實驗及染色體制備。2.檢測P同位素敷貼對SD幼鼠皮膚DNA的作用：32--8精選文庫（1）從總體水平用慧星實驗初步檢測SD幼鼠皮膚組織細(xì)胞有無DNA損傷。方法參考文獻(xiàn)，暫設(shè)計如下：a)取100mg皮膚組織，剔除結(jié)締組織后放置于冰塊上的培養(yǎng)皿內(nèi),PBS沖洗兩次,眼科剪剪碎,加入0.25%胰酶4~5ml后,將培養(yǎng)皿放入37度溫箱內(nèi)消化30分鐘。b)取出培養(yǎng)皿,加入10%的小牛血清4-5ml終止消化,再將已消化的皮膚細(xì)胞懸液傾入墊有4層紗布的玻璃漏斗,濾入15ml的離心管內(nèi)。c)將所得濾液用PBS清洗后，將細(xì)胞制成懸液，并細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整濃度為110個細(xì)胞/ml1mlPBS再清洗，71000rpm,離心10分鐘,棄上清液。迅速注入37度的0.7%LMPAPBS溶液200μL,混勻,制備成細(xì)胞懸液,立即進(jìn)行細(xì)胞核DNA損傷檢測。對照組采取相同處理。d)DNA損傷檢測按慧星實驗試劑說明進(jìn)行實驗操作。（RT-PCR法檢測P同位素敷貼對SD幼鼠皮膚組織細(xì)胞ATM、32γH2AXDNA-PK的mRNARNA及RT-PCR均按檢測試劑說明書進(jìn)行實驗操作。（3）用Western-bolt方法檢測P同位素敷貼對SD幼鼠皮膚組織細(xì)32胞ATM、γH2AXDNA-PK蛋白表達(dá)水平的的影響：提取總蛋白及Western-bolt實驗均按檢測試劑說明書操作。3.檢測32P同位素敷貼對SD幼鼠染色體的影響：（1）皮膚組織染色體制備及形