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Real-time Realtime-PCR引物最重要、最關(guān)鍵的步驟：引物/探針的設(shè)Realtime-PCR所用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)的區(qū)別普通PCR引目的是獲得目 ，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格Realtime- 結(jié)論：Realtime-PCR對引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán) 重要原擴(kuò)增片段重要原擴(kuò)增片段大＜200bp(80-150bp最佳引物長★18-GC★40%-60%(45%-55%最佳退火溫上下游Tm盡量接近引物★1的保守區(qū)域整體上堿基不能避免多個(gè)重復(fù)的引物3’★末尾5個(gè)堿基＜2個(gè)末位堿基最好為避免出現(xiàn)3個(gè)及以上互補(bǔ)引物內(nèi)部避免3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)引物3’端避免2個(gè)以上的互補(bǔ)序列兩條引物間避免3個(gè)堿基特異Blast檢索，確認(rèn)引物的特異RT-PCR引物位盡量跨過內(nèi)含子，設(shè)計(jì)在兩個(gè)不同的外顯子 重要原探針重要原探針25-退火溫65-72℃，高出引物引物序★1的保守區(qū)域且富含2避免多個(gè)重復(fù)的引物5’不能為互補(bǔ)探針內(nèi)部避免3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)與兩條引物間避免3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序特異Blast檢索，確認(rèn)探針的特異探針位★盡量靠近上游引物，最佳距離為1個(gè)堿基 以ERCC1為第一步：查找序 軟件：NCBI以NCBI為演示打開找到gene選 輸入ERCC1，點(diǎn)擊Search查找找到human點(diǎn)擊，進(jìn)入頁面的基本信息介紹 ERCC1SNP匯總。其他的相互 SNPSNP組編號信mRNAERCC1mRNA有3種剪接剪接體2和點(diǎn)擊進(jìn)入mRNA頁面，點(diǎn)擊 核苷酸序列至txt上txt上不同剪接體的序列用>號隔開★★，保存到指定位置 （1）打開BioEdit軟點(diǎn)擊file，下拉菜單，找到找到保存好的BioEdit單，找到ClustalWMultiplealignment勾選outputClustalformatwithClustal…選項(xiàng);點(diǎn)擊RunClustalW，點(diǎn)擊比對結(jié)果（表示堿基序列相同結(jié)論：181bp-892bp范圍內(nèi)堿基序列完全相第三步：設(shè)計(jì)引PrimerBlast等（1）打開Primer5.0軟 模板堿基序列，Ctrl+V粘貼A：下游引引物F:5'GAGAGACGCCCAACCAGGR:5'CGCACGAACTTCAGTACGGPro:5'FAM-CGGGGCAAAATCCAACAGCAT-TAMRA3‘距離上游引物引物

F:5'TCAGAGCCCCTGGCAGGAGAGR:5'GGGATTGCCCCTCTGCCGAGG引物F:5'AGAGACGCCCAACCAGGCCCTR:5'GGGATTGCCCCTCTGCCGAGG引物F:5'TCCAACAGCATCATTGTGAGCR:5'GGAATTACGTCGCCAAATTCC軟件：NCBI打開NCBI，拉至底部，找將上下游引 過去勾選Human+transcript選勾選Somewhatsimilar點(diǎn)擊（8）分析結(jié)結(jié)果：與ERCC1匹配度100%，其他為 點(diǎn)擊每一個(gè)結(jié)果，可看到具體比對序 miRNA長度過于短小無法直接應(yīng)用常規(guī)的PCR技術(shù)擴(kuò)增必須要延長待測miRNA的長度，構(gòu)建出一個(gè)足長的PCR模方法：莖環(huán)法和加尾法（逆轉(zhuǎn)錄方法有差異加尾對miRNA進(jìn)行加PolyA尾處理，改造成的結(jié)構(gòu)，再采用mRNA常用的oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄引進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而得到較長的模板莖環(huán)引物設(shè)計(jì)原“一對“半”是反轉(zhuǎn)錄引物PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)原則遵守常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)原打開miRBase，輸hsa-miR-21，點(diǎn)擊提交 上游引物可選擇miRNA全長或部分建議公 通用下游引物是5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT上游引物采用Primer5.0設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)過程同一般上游引物與RT引物中miRNA的序 RTPri:5'GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG F:5’GGCTAGCTTATCAGACTGA3’R:5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT 互補(bǔ)配對：不超過4個(gè)堿GC含量：