熒光分析法測定維生素C維生素C及維生素C測定原理熒光分析法測定維生素C試驗(yàn)熒光分析法測定維生素C應(yīng)用講解人：賀政軒熒光分析測定維生素c專家講座第1頁一、維生素C及維生素測定原理1.1維生素C

維生素C又名抗壞血酸,是維持機(jī)體正常生理功效主要維生素之一,而人體不能本身合成，只能從食物和藥品中攝取，所以，食品、藥品中維生素C分析含有主要意義。1.2維生素C測定方法

維生素C測定慣用方法有光度法

、電化學(xué)法、滴定法、酶法、色譜法等。

本試驗(yàn)提出了一個(gè)新測定維生素C熒光分析方法：維生素C被Cu2

+氧化為脫氫

抗壞血酸，再與苯甲酸及十六烷基三甲基溴化銨產(chǎn)生熒光協(xié)同增敏作用，經(jīng)過對(duì)體系熒光強(qiáng)度測定進(jìn)行維生素C定量分析。熒光分析測定維生素c專家講座第2頁二、熒光分析法測定維生素C試驗(yàn)

1試驗(yàn)1.1主要儀器與試劑

分子發(fā)光儀:LS-55型

酸度計(jì):pH-211型

榨汁機(jī):CW-JE04型

電熱恒溫水浴鍋:HH.SY11-Ni1型

CuSO4溶液:2.0×10-3gm/L

十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)溶液:6.0×10-4g/mL苯甲酸溶液：1.0×10-4gm/L

維生素C標(biāo)準(zhǔn)貯備液:5.0×10-4g/mL,2～8℃（避光保留）；

維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.0×10-5g/mL,2～8℃（避光保留）；

NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液:pH=6.0；

熒光分析測定維生素c專家講座第3頁1.2試驗(yàn)步驟

（1）配置待測樣品及空白對(duì)照

在25mL比色管中依次加入0.6mLCuSO4

溶液，2.0mL十六烷基三甲基溴化銨溶液，2.0mL苯甲酸溶液，一定體積維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，5.0mLNaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液,用蒸餾水定容，搖勻；以不含維生素C溶液為

空白對(duì)照。（2）水浴加熱

在35℃恒溫水浴中加熱30min，

將溶液流水冷卻至室溫。（3）熒光分析

將待測樣品放置于樣品架上，設(shè)定激發(fā)波長為308nm，發(fā)射波長為408nm，測量熒光強(qiáng)度F，以不含維生素C試劑空白為F0

，計(jì)算F測=F-F0

。熒光分析測定維生素c專家講座第4頁2結(jié)果與討論

2.1激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

取3.0mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗(yàn)方法進(jìn)行操作,分別在290～330nm、360～460nm內(nèi)掃描得到激發(fā)光譜和發(fā)射光譜如圖1、圖2所表示。從圖1、圖2中可看出,當(dāng)激發(fā)波長為308nm,發(fā)射波長為408nm時(shí)體系熒光強(qiáng)度最大,試劑空白熒光值比較低且穩(wěn)定,故本試驗(yàn)選擇激發(fā)波長為308nm,發(fā)射波長為408nm。

1—Cu2

++BA+緩沖溶液+CTMAB;2—Cu2

++BA+維生素C+緩沖溶液+CTMAB1—Cu2

++BA+緩沖溶液+CTMAB;2—Cu2

++BA+維生素C+緩沖溶液+CTMAB激發(fā)光譜發(fā)射光譜熒光分析測定維生素c專家講座第5頁2.2試劑加入次序

按照試驗(yàn)方法操作,在各試劑加入量相同情況下,試驗(yàn)了試劑不一樣加入次序?qū)晒鈴?qiáng)度影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)所加試劑次序依次為CuSO4溶液、苯甲酸溶液、維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液、NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液時(shí),體系熒光強(qiáng)度最大，所以選取此加入次序?yàn)樽钫_試劑加入次序。熒光分析測定維生素c專家講座第6頁2.3

緩沖溶液

溶液pH值對(duì)體系熒光強(qiáng)度有較大影響，試驗(yàn)了不一樣pH值對(duì)熒光強(qiáng)度影響。由pH值—熒光強(qiáng)度曲線可知,

當(dāng)pH

值為5.9

～

6.2

時(shí),熒光強(qiáng)度到達(dá)最大值且比較穩(wěn)定,所以確定最正確pH值為

6.0。緩沖溶液種類對(duì)體系熒光強(qiáng)度也有一定影響。試驗(yàn)了以下幾個(gè)pH

值為6.0

緩沖溶液:NaOH-KH2PO4、KH2PO4-硼砂、KH2PO4-Na2HPO4、NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀、Na2HPO4-檸檬

酸、NaOH-檸檬酸鈉、HAc-NaAc等。試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)所加緩沖溶液為NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀時(shí),熒光強(qiáng)度最大且穩(wěn)定。所以本試驗(yàn)選擇NaOH-

鄰苯二甲酸氫鉀為緩沖溶液,其最正確用量為5.0mL。2.4

加熱溫度和加熱時(shí)間

試驗(yàn)了不一樣溫度對(duì)體系熒光強(qiáng)度影響。結(jié)果表明,

當(dāng)加熱溫度為35℃時(shí)，現(xiàn)有利于提升體系反應(yīng)速度，又不使反應(yīng)物與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)受到破壞。改變加熱時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果發(fā)覺，在35℃水浴中加熱30min，體系熒光強(qiáng)度到達(dá)最大值且相對(duì)穩(wěn)定。

熒光分析測定維生素c專家講座第7頁2.5

硫酸銅和苯甲酸用量其它條件不變，試驗(yàn)了硫酸銅和苯甲酸用量對(duì)體系熒光強(qiáng)度影響。結(jié)果表明，當(dāng)硫酸銅用量為0.6mL、苯甲酸用量為2.0mL

時(shí)，體系熒光強(qiáng)度最大。2.6

表面活性劑

分別試驗(yàn)了十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)、十二烷基磺酸鈉及β

-環(huán)糊精對(duì)體系熒光強(qiáng)度影響。結(jié)果表明,表面活性劑對(duì)體系熒光強(qiáng)度有一定增敏效果，其中CTMAB

對(duì)體系增敏效果最好。深入試驗(yàn)了CTMAB

用量對(duì)體系熒光強(qiáng)度影響,

當(dāng)CTMAB

用量為2.0mL

時(shí),

體系熒光強(qiáng)度最大。

熒光分析測定維生素c專家講座第8頁三、熒光分析法測定維生素C應(yīng)用

樣品測定

取一片維生素C藥片，研細(xì)，混勻，準(zhǔn)確稱取0.1520g溶于二次蒸餾水中

，轉(zhuǎn)移至

500mL容量

瓶中定容，配成水溶液。再準(zhǔn)確移取10mL此溶液，將其稀釋成100mL溶液，作為樣品稀釋液。

對(duì)樣品稀釋液進(jìn)行測定并做加標(biāo)回收試驗(yàn)。

同時(shí)利用本法對(duì)西紅柿和果珍進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱取一定量果珍，將其配成100mL溶液。將清洗潔凈西紅柿榨汁，稱取一定量西紅柿汁，

將其配成100

mL溶液。

其它步驟和維生素

C藥片測定方法

相同。

熒光分析測定維生素c專家講座第9頁樣品測定結(jié)果列于表3表3

樣品測定結(jié)果(n

=3)。由表3可知，用熒光分析法測定維生素C藥片、西紅柿和果珍中維生素C含量，回收率為96.

7%～

100.5%準(zhǔn)確度較高。表3樣品測定結(jié)果(n=3)

熒光分析法測定維生素C含有操作簡單,精密度高,檢出限低等優(yōu)點(diǎn),該法能夠應(yīng)用于水果、蔬菜和藥品中維生素C檢測,適于推廣。熒光分析測定維生素c專家講座第10頁謝謝觀賞！

Theend熒光分析測定維生素c專家講座第11頁利用一些物質(zhì)受光照射時(shí)所發(fā)生熒光特征和強(qiáng)度，進(jìn)行物質(zhì)定性分析或定量分析方法，稱為熒光光譜分析。使激發(fā)光波長和強(qiáng)度保持不變，而讓熒光物質(zhì)所發(fā)生熒光經(jīng)過發(fā)射單色器照射于檢測器上，調(diào)整發(fā)射單色器至各種不一樣波長處,由檢測器測出對(duì)應(yīng)熒光