光合細菌Rhodopseudomonasacidophila的胞外聚合物的提取研究摘要：采用了五五種不同的方方法——EDTA、NaOH、H2SO4、熱提取和和高速離心，對對光合細菌RRhodoppseudoomonassaciddophilla的胞外聚聚合物（EPS）進行提取取。結果表明，EDTA法是一種比較較好的提取方方法，提取效效率高，對細細胞破壞小。EPS中的多糖、蛋蛋白和核酸含含量分別為6.5、58.4、5.4mmg/g干重。EDTA的適宜提取時間1～3h，用量約為2.8gg/g干重。采用用不同的提取取方法，提取取的EPS中的組分含量大不不相同。本文文還采用了兩兩種方法檢查查細胞的破壞壞程度，一種種是測定核酸酸含量，一種種是測定光合合細菌提取前前后UV-Viis光譜和EPS的UV-Viis光譜，兩種種方法的結果果一致。EDTA提取方法中中，細菌的UV－Vis峰強度在提提取前后沒有有變化，EPS溶液中也沒沒有新的色素素峰出現(xiàn)，說說明基本沒有有細胞被破壞壞。由于UV－Vis光譜測定方方便快速，可可以用來監(jiān)測測在EPS提取過程中中細胞的溶解解情況。關鍵詞：胞外聚聚合物；光合合細菌；UV-Viis光譜；蛋白白；核酸；多多糖；提取ExtracttionooftheeextrracelllularpolymmericsubsttancessfrommaphhotosyynthetticbaacteriiumRhoodopseeudomoonasaacidopphilaAbstracct:Ammongtthefiivemeethodssforextraactinggextrracelllularpolymmericsubsttancess(EPSS)froomRhoodopseeudomoonasaacidopphilausinggEDTAA,NaOOH,H2SO4,heaatingandhhighsspeedcentrrifugaation,,EDTAAextrractioonwassfounndtobethhemosstefffectivvemetthodbbecausseofhigheerexttractiioneffficieencyaandloowerccellllysis..TheconteentsooftheemajoorcommponenntsoffEPSfromRR.aciidophiila,i..e.,ccarbohhydratte,prroteinnandnucleeicaccid,weere6.55,58..4andd5.4mg/gdryccell,respeectiveely.TThefeeasiblleexttractiiontiimewaas1-33hanndtheeEDTAAdosaagewaasaboout2..8g/ggdrycellssforEDTAextraactionn.Twomethoods,ii.e.tthecoontenttofnnucleiicaciidanddUV-VVissppectruum,weereussedtooevalluatecelllysissduriingexxtracttion.TheaabsorpptionpeakssforphotoosynthheticpigmeentsiinUV--VissspectrrumseeemednochhangepriorrtoaandaffterEEDTAeextracction,,andnopiigmenttpeakksapppeareddintthesppectruumofEPS,indiccatinggthattfewcellsswereedesttroyeddandthatlysissdidnotooccurdurinngEDTTAexttractiion.TTheUVV-VisspecttrumccouldbeussedtoomoniitorttheceelllyysisdduringgEPSextraactionnfrommRaciddophilla.Keywordds:Caarbohyydratee;Exttracelllularrpolyymericcsubsstancees;Exxtracttion;Nucleeicaccid;RRhodoppseudoomonassaciddophilla;UVV-Visspecttrum;Proteein微生物利用有機機廢水產氫已已經引起了人人們廣泛的興興趣，其中光光合細菌（PSB）被認為是是最有應用前前景的一種產產氫微生物，文文獻中報道一一些光合細菌菌，例如Rhhodobaactersp.[11]，能夠利用低低級有機酸作作為電子受體體，光作為能能源，產生氫氫氣。從應用用觀點看，光光合細菌要能夠在光反反應器中生長長和連續(xù)產氫氫，反應器中中微生物必須須保持一定的的濃度，但是是，由于光合合細菌的絮凝凝沉降性能不不好[2]，不能能有效的和溶溶液分離，在在產氫光反應應器中，光合合細菌一般濃濃度都很低。為為了解決這個個問題，必須須研究PSB的絮凝沉降降特性。細菌的絮凝性能能和胞外聚合合物（EPS）有很大的的關系。EPS是吸附在細細菌表面的一一些高分子聚聚合物（Mw>100000），主要來來源是微生物物分泌、細胞胞產物自溶和和廢水中的有有機物的吸附附[3]。EPS的主要成分分是多糖、蛋蛋白和核酸，它它們的含量對對細菌的絮凝凝性能有著顯顯著的影響。EPS的研究最早早應用于好氧氧活性污泥中中，到目前為為止，對水處處理中好氧活活性污泥和厭厭氧污泥、顆顆粒污泥、生生物膜等已經經進行了大量量的研究[4－6]，但是對光光合細菌的EPS特性研究很很少。Watannabe等人[2]分離了了一株海洋光光合細菌，RRhodovvulumsp.，并且研究究了它的絮凝凝特性，他們們認為胞外核核酸的含量是是影響光合細細菌絮凝性能能的最主要因因素，但該株株細菌能不能能產氫沒有報報道。本文選用了一株株產氫光合細細菌Rhoddopseuudomonnsaaciidophiila，比較較了幾種常用用的不同的EPS提取方法的的提取效率?；诒容^結果果，選擇EDTA作為為提取方法，進進一步研究提提取時間和提提取劑用量的的對EPS提取的影響。而而且，對EPS的UV-Viis和紅外光譜譜特性也進行行的簡單的研研究，并且提提出了一個簡簡單方便的方方法，用來判判斷提取過程程中的細胞破破壞程度。1．材料與方法法1.1光合細細菌R.aciddophilla,從中中國水產科學學研究院東海海水產研究所所購得。這株株光合細菌能能夠利用乙酸酸、丙酸、丁丁酸產氫。在在4000Lux，30oC下，當底物物為1.8gg/l乙酸、1.0gg/l丙酸、0.4gg/l丁酸的混和和酸時，在208小時以內，該該PSB能夠產生494mml氫氣，最大大產氫速率為為21.9ml/l//h。生長培養(yǎng)基成成分為(每升)：KH2PO40.5g,K22HPO40.6g,NaaCl0..4g,MgSO44?7H2O0.22g,CCaCl2?2H2O0.005g,(NH4)2SO41.255g,琥珀酸鈉9.8g，1ml微量元素溶溶液。培養(yǎng)基基的pH為7.0，培養(yǎng)溫度32oC，光照強度3000Lux，充氬氣保保持厭氧環(huán)境境。1.2EPSS的提取方法法采用五種方法從從R.accidophhila提取EPS，即EDTA、NaOH、H2SO4、熱處理和和高速離心。分分別取40mllPSB培養(yǎng)液，120000rpm，4oC離心10miin，菌體用0.9%NaCl溶液洗滌兩兩次，然后重重懸于10mll二蒸水中，再再分別加入一一定量的EDTA(2%)、NaOH(1N)、H2SO4(8%))溶液，4oC放置提取3h。為了比較較，另取兩份份，分別采用用熱提取(70oC，1h)和高速離心心方法提取EPS。然后，將將細菌EPS溶液經4oC120000rpmm離心15miin，除去剩余余的細菌，上上清液為EPS溶液。因EDTA干擾蛋白的的測定，將EDTA提取的EPS溶液對二蒸蒸水透析過夜夜。最后，將將所得的EPS溶液經0.45μm醋酸纖維素素膜過濾，再再進行成分分分析。1.3分析方方法多糖用蒽酮法測測定，蛋白用用Lowry法測定，核核酸含量用紫紫外吸收法測測定。Ca2+和Mg2+用原子吸吸收法測定(WFx-1120，Rayleeigh分析儀器公公司)。為了測定EPSS的紅外光譜譜，將兩倍預預冷乙醇加入入EPS溶液中，沉沉淀重懸于雙雙蒸水中，透透析過夜，再再用乙醇沉淀淀，沉淀物用用乙醇洗滌兩兩次，最后真真空干燥。干干燥的沉淀物物用于IR分析(VECTTOR222,Bruuker公司)。UV－Vis光光譜用島津UV-24401PC儀器分析。2.結果與討討論：2.1提取方方法的比較不同提取方法的的比較結果列列于表1。結果表明，提取出的EPS量和提取方方法有很大關關系，其中，NaOH法，提取的EPS最多，熱處處理和EDTA法次之，H2SO4法和高速離離心最少。一一個好的提取取方法，不但但提取效率要要高，而且對對細胞的破壞壞要少，一般般核酸的含量量用來評價提提取過程中細細胞破壞程度度[7]。上述五種種提取方法中中，提取的EPS溶液中核酸酸含量大小順順序為：NaOH>熱提取>EDDTA>H2SO4>離心。用NaOH提取EPS，核酸的含含量是用離心心法的9.6倍，說明提提取過程中細細胞破壞嚴重重，大量提取取出來的EPS其實是胞內內物質。同樣樣，熱提取的的EPS中，核酸含含量也很高。EDTA法、硫酸法法和離心法對對細胞破壞少少，但是硫酸酸法和離心法法提取的EPS量很少，提提取效率低，不不是一種有效效的提取方法法。結果表明明，EDTA的提取效率率高，對細胞胞的破壞少，是一種從R.acidophila中提取EPS的有效方法，比其他幾種方法要優(yōu)越。用EDTA提取的EPS中多糖，蛋白、核酸的含量分別為6.5,58.4和5.4mg/g干重。在以后的實驗中，都采用EDTA法來提取EPS。從表中還可以看出，用不同的提取方法，提取的EPS量在12.9~159.2mg/g干重中變動，同樣多糖蛋白比值在0.06~1.71范圍內。由上述討論可知，EPS的提取方法和操作步驟同時影響提取的EPS的成分和含量。表1.不同方方法從R.aacidopphila中中提取的EPS的含量(mg/g干重)與多糖/蛋白比EDTANaOHH2SO4熱提取高速離心多糖6.57.710.610.34.1蛋白58.4126.66.237.76.2核酸5.424.94.623.62.6總EPS70.3159.221.471.612.9多糖/蛋白0.110.061.710.270.66從R.aciidophiila中提取取的EPS中，蛋白的的含量和Watannabe等人[2]從海水中分分離的Rhoodovullumspp.的EPS中蛋白含量量基本相同，但但是多糖和核核酸的含量卻卻小于Rhoodovullumspp.的EPS中的，Rhoodovullumspp.的EPS中多糖/蛋白約為0.6，遠遠大于R.accidophhilaEEPS中的多糖/蛋白0.11。由于Rhoodovullumspp.具有良好的的絮凝性能，而而R.aciidophiila絮凝性性能相對較差差，EPS的含量和物物質成分的差差別可能也是是一部分原因因，Watannabe等認為胞外外核酸在細菌菌的絮凝性能能中起主導作作用。2.2提取時時間和提取劑劑用量的影響響從圖1和2可以以看出，EPS中蛋白含量量受提取時間間和提取劑用用量影響很大大，而多糖和和核酸幾乎不不受影響。當當提取時間超超過1h，EPS的含量基本本保持不變，維維持在48.4，7.5和7.3mmg/g干重左右。EDTA的提取速度度快，可能是是由于EDTA和二價離子子的絡合反應應速度很快。從從圖2(A)中可以得出出，當EDTA的用量從0.8增加到2.8gg/g干重時，EPS的量也從29.9迅速增加到84.3mg/g干重，然而而當EDTA用量繼續(xù)增增加時，提取取的EPS的量基本保持不不變。這和細細菌培養(yǎng)液中中多價離子含含量有限有關關，當多價離子都都被EDTA絡合后，再再增加EDTA的量，將不不會顯著的提提高EPS的提取效率率。從圖2(B)中可以看出出，Ca2+和Mg2+的含量隨著EDTA的用量增加加而增加，到到2.8gg/g干重之后，這這些二價離子子的濃度都基基本上保持不不變或略有降降低。這些二二價離子的濃濃度和蛋白的的濃度有一定定的相關性，EPS中Ca2+和Mg2+的含量增高高，蛋白的含含量也增大，說說明在細菌EPS中，這些二二價離子是主主要和蛋白結結合的，因為為在中性條件件下，蛋白質質的羧基會離離解而帶負電電，然后就靠靠這些二價離離子通過離子子橋接把EPS和細菌結合合在一起。當當EDTA除去去這些離子時時，EPS也就隨之釋釋放到溶液中中去了。圖1.提取時間間對EPS量的影響圖2.提取劑劑用量的影響響：(A)EPS量；(B)Caa2+和Mg2+含量EPS中三種主主要物質的提提取難易程度度也有所不同同，從圖2可以看出，用用EDTA提取，多糖糖和核酸比較較容易提取，在在少量的EDTA存在下，較短的時間就就能提取比較較完全，而蛋蛋白比較難提提取，很大的的EDTA劑量才能提提取比較完全全。這說明，提提取的操作也也同時影響著著提取的EPS的量和成分分。2.3EPSS紅外光譜圖3是從R.aacidopphila中中提取的EPS的紅外光譜譜圖。譜圖中中有五個很明明顯的峰：3422，2923，1635，1395，1055cm-1，其中3422處峰是OH伸展振動產產生的，2923處的較弱的的峰是C－H振動峰，而1635和1395處是羧基中C=O不對稱和對對稱伸展振動動峰。處于1000~~1200處的吸收峰峰一般為糖衍衍生物的典型型吸收峰。從從紅外光譜譜譜圖中，我們們可以知道，EPS中含有的最最主要的活性性基團是羧基基和羥基。2.4UV－－Vis光譜圖3.R.acidoophilaa的EPS的紅外光譜譜圖4.A：EEPS提取前后R.aciddophilla溶液UV-Viis光譜；B：EDTA和NaOH提取的EPSUUV－Vis光譜圖4(A)為PPSB提取前和經EDTA和NaOH提取后的UV-Viis光譜圖，圖圖4(B)為從PSB中提取的EPS的Uv-Viis譜圖。從圖圖4(A)可以看到細細胞色素的幾幾個典型吸收收峰，590，800，860nnm，如果在提提取過程中細細胞被破壞，胞胞內物質泄漏漏出來，則提提取前后細胞胞的吸收峰強強度在譜圖上上就應該可以以看出發(fā)生了了改變，而且且在EPS譜圖上應該該也可以觀察察到類似的吸吸收峰，因而而，可以利用用UV－Vis譜圖來判斷斷提取過程對對細胞的破壞壞程度。從圖圖上可以看出出，EDTA提取前后細細胞色素峰的的強度幾乎沒沒有改變，EDTA提取的EPS的UV-Viis譜圖上也沒沒有色素峰的的出現(xiàn)；而經經過NaOH提取，細胞胞懸浮液的峰峰強度明顯減減弱，甚至消消失，而在NaOH提取的EPS譜圖上，液液可以看到有有色素峰的出出現(xiàn)。這個現(xiàn)現(xiàn)象說明，EDTA提取方法對對細胞破壞少少，而NaOH方法細胞破破壞卻很嚴重重，這個結果也和前前述核酸數據據相符。細胞胞破壞程度是是判斷一種提提取方法是否否恰當的一個個重要指標，很很難估計，缺缺少一個標準準判斷方法。以前一般用蛋白或者核酸的含量來判斷，但是EPS本身中也含有大量的蛋白和核酸，所有這種方法并不是很恰當，后來有用ATP或葡萄糖－6－磷酸脫氫酶這些胞內物質的含量來判斷[7]，可是這些物質的測量方法都很費時費事，使用中受限。UV－Vis作為一種快速方便的方法，可以用來評價EPS提取過程中的細胞破壞程度。3.結論：從R.aciidophiilaEPS的提取方法法比較來看，EDTA法的提取效率高，對細胞的的破壞程度小小，是一種較好好的提取EPS的方法。用EDTA法提取的EPS量為70.3mg/g干重。EDTA的適宜提取時間間約為1～3h，提取劑量量約為2.8ggEDTAA/g干重。提取取方法，提取取時間和提取取劑的用量都都會影響提取取的EPS的量和成分分。同樣，從從EPS和細菌的UV－Vis數據中同樣樣可以看出，EDTA對細胞的破破壞較小，而而NaOH破壞很大。提提取過程中細細胞的破壞程程度是判斷一一種提取方法法優(yōu)劣的一個個重要指標，但目前缺少一個標準判斷方法，UV－Vis法作用一種方便快速的方法，有可能用來判斷EPS提取過程中細胞的破壞程度。參考文獻[1]EroogluII,AsllanK,,GundduzU,,YuceelM,TurkeerL.SubsttrateconsuumptioonrattesfoorhyddrogennprodductioonbyRhodoobacteersphhaeroiidesiinaccolumnnphottobiorreactoor.JBioteechnoll,19999,700:103--113[2]WattanabeeM,SSasakiiK,NNakashhimadaaY,KKakizoonoT,,NopaaratnaaraporrnN,NishiioN.GrowtthanddfloccculattionoofammarineephottosynttheticcbactteriummRhoddovuluumsp..AppllMicrrobiollBiottechnool,19998,550:6822-691[3]MorrganJJW,FoorsterrCF,EvisoonL.Acommparattivesstudyofthhenattureoofbioopolymmerseextracctedffromaanaeroobicaandacctivattedslludgess.WattRes,,