千里之行，始于足下。第2頁/共2頁精品文檔推薦五章植物脫毒技術(shù)第8章植物脫毒技術(shù)（4學(xué)時）

目的要求：

(1)掌握植物微莖尖培養(yǎng)的脫毒辦法；

(2)普通掌握無毒苗木的鑒定辦法；

(3)掌握組織培養(yǎng)脫毒苗在生產(chǎn)上的重要意義；

(4)普通掌握脫毒苗木的保存和利用辦法

病毒在植物上的危害

通常危害植物的病毒有幾百種，同時隨著生產(chǎn)栽培時刻的延長，危害程度越來越嚴峻，種類越來越多。尤其是靠無性生殖的作物，如利用莖(塊莖、球莖、鱗莖、根莖、匍匐莖)，根(塊根、宿根)、枝、葉、芽(頂芽、側(cè)芽、球芽、別定芽)等經(jīng)過嫁接、分株、扦插、壓條等途徑來舉行生殖的。像蘋果、葡萄、草莓等?；ɑ艿陌俸稀⑻戚牌?、水仙、郁金香、香石竹、菊花等，蔬菜的馬鈴薯、姜等。而以種子舉行生殖的種類，除豆類外，其他均可隨著世代的交替而去除病毒，即病毒只能危害一具世代。而在無性生殖的種類中，由于病毒經(jīng)過營養(yǎng)體舉行傳遞，在母株內(nèi)逐代積存，危害日趨嚴峻。一些園藝植物以小規(guī)模集約栽培，造成連作危害咨詢題，并加重土壤傳染性病毒的危害。

病毒的危害給植物生產(chǎn)帶來的損失是非常大的，如草莓病毒的危害，使草莓產(chǎn)量嚴峻落低，品質(zhì)大大退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)10％～18％，為害馬鈴薯的病蟲害則更多，大約有幾十種，所以，給馬鈴薯生產(chǎn)帶來嚴峻障礙。花卉病毒的危害普通會妨礙花卉的欣賞價值，其表現(xiàn)是花少而小，產(chǎn)生畸形、變?nèi)旱取?/p>

為了提高植物的產(chǎn)量和質(zhì)量，根除病毒和其他病原菌是很必要的。盡管經(jīng)過防治細菌和真菌的藥物處理，能夠治愈受細菌和真菌侵染的植物，但如今還沒有啥藥物可治愈受病毒侵染的植物。若一具無性系的整個群體都已受到侵染，獲得無病毒植株的唯一辦法算是消除營養(yǎng)體的病原菌，并由這些組織中再生出完整的植株。一旦獲得了一具別帶病原菌的植株，就可在別致受到重新侵染的條件下，對它舉行營養(yǎng)生殖。用組織培養(yǎng)法消除病毒是唯一行之有效的辦法。

由于病毒對植物造成這樣嚴童的危害。因此世界各國都開始重視這方面的研究，如XXX用柑桔莖尖微嫁接生殖無病毒柑桔營養(yǎng)系。美國用組織培養(yǎng)法，使蘋果無病毒苗已工廠化育苗，并在全國普遍開展。

第一節(jié)無病毒苗哺育的意義

采納生物、物理、化學(xué)等途徑防治病毒病收效甚微，甚至毫無成效。自從50年代發(fā)覺經(jīng)過組織培養(yǎng)的辦法能夠脫除嚴峻患病毒植物的病毒種類，提高產(chǎn)量、質(zhì)量。所以，到60至70年代組織培養(yǎng)的技術(shù)在花卉、蔬菜和果樹等得到廣泛的應(yīng)用。生產(chǎn)無毒苗已形成一種

產(chǎn)業(yè)，滿腳生產(chǎn)者對這種苗的大量需要。用組織培養(yǎng)辦法生產(chǎn)無毒苗，是一具積極有效的途徑，由于排除了使用藥劑，因此對減少污染，防止公害，愛護環(huán)境都有積極的意義。

第二節(jié)植物脫毒的辦法

一、莖尖培養(yǎng)脫毒

（一）經(jīng)過莖尖培養(yǎng)脫毒的原理

1.病毒在植物體內(nèi)的分布

感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并別均勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染深度越低，生長點(約0.1～1.0mm區(qū)域)則幾乎別含或含病毒非常少。這是因為分生區(qū)域內(nèi)無維管束，病毒只能經(jīng)過胞間連絲傳遞，趕別上細胞別斷分裂和活躍的生長速度。

2.莖尖大小與脫毒效果

在切取莖尖時越小越好，但太小則別易成活，過大又別能保證徹底除去病毒。莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，因此是目前哺育無病毒苗最廣泛和最重要的一具途徑。

（二）辦法

1.取樣與消毒

剪取頂芽梢段3～5cm，削去大葉片，用自來水沖潔凈，在75%酒精中浸泡30s，用1%-3%次氯酸鈉溶液消毒10～20min，最終用無菌水材料沖洗4-5次

2.剝?nèi)∏o尖與接種

3.培養(yǎng)

接種后材料置25±2℃，光照度1500～5000lx,每日光照10～16h條件下培養(yǎng).光照對莖尖培養(yǎng)的妨礙更大

4.生根誘導(dǎo)

一些植物莖尖培養(yǎng)形成綠芽后,基部非?？彀l(fā)生別定根.而另一些植物莖尖別產(chǎn)生別定根,需經(jīng)再誘導(dǎo)、生根才干成為完整植株

(三)培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式

1.培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基適于多種植物莖尖培養(yǎng)。

2.培養(yǎng)方式

在舉行脫毒培養(yǎng)時，由于弱小的莖尖組織非常難靠肉眼操作，因而需要一臺帶有適當光源的簡單解剖鏡(8～40倍)。除了在舉行植物組織無菌培養(yǎng)普通工具外，還需要一套解剖刀。剝離莖尖時，應(yīng)盡快接種，莖尖暴露的時刻應(yīng)當越短越好，以防莖尖變干?？稍谝痪咭r有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)舉行操作，有助于防止莖尖變干。和其他器官的培養(yǎng)一樣，在舉行莖尖培養(yǎng)時，首要是獲得表面別帶病原菌的外植體。所以，普通來講，莖尖分生組織由于有彼此重疊的葉原基的嚴密愛護，只要認真解剖，無須表面消毒就能夠得到無菌的外植體。有時消毒處理還會增加培養(yǎng)物的污染率，因此選取莖尖前，可把供試植株種在無菌的盆土中，放在溫室中舉行栽培。澆水時要直截了當澆在土壤中而別要澆在葉片上。另外，最好還要給植株定期噴施內(nèi)吸殺菌劑，可用多菌靈0.1％和抗生素(如0.1％鏈霉素)。關(guān)于某些田間種植的材料，能夠切取插條插入Knop溶液中令其長大，由這些插條的腋芽長成的枝條，要比由田間植株上直截了當取來的枝條污染小得多。

為了保險起見，在切取外植體之前普通仍須對莖芽舉行表面消毒。葉片包被嚴緊的芽，如菊花、蘭花，只須在75％酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，如香石竹，蒜和馬鈴薯等，則要用0.1％次氯酸鈉表面消毒l0min。關(guān)于這些消毒辦法，在工作中應(yīng)靈便運用，如在大蒜莖尖培養(yǎng)時，可將小鱗莖在75％酒精中浸蘸一下，再用燈火燒掉酒精，然后解剖出無菌莖芽。在剖取莖尖時，把莖芽置于解剖鏡下，一只手用細鑷子將其按住，另一只手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針要常常蘸入90％酒精，并用火焰灼燒以舉行消毒。但要注意解剖針的冷卻，可蘸人無菌水舉行冷卻。當一具閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將分生組織切下來，為了提高成活率，可帶1～2枚幼葉，然后將其接到培養(yǎng)基上。接種時確保微莖尖別與其他物體接觸，只用解剖針接種即可。將接種好的莖尖置于22℃左右的溫度下。每天以16h2000～3000Lx的光照條件下培養(yǎng)。由于在低溫柔短日照下，莖尖有也許進入休眠；因此較高的溫度和充腳的日照時刻必須保證。微莖尖需數(shù)月培養(yǎng)才干成功。莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和普通器官的培養(yǎng)相同，這個地方別再敘述。

二、其他組織培養(yǎng)脫毒辦法

（一）愈傷組織培養(yǎng)脫毒

經(jīng)過植物的器官和組織的培養(yǎng)去分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長成小植株，能夠得到無病毒苗。感染煙草花葉病毒的愈傷組織經(jīng)機械分離后，僅有40％的單個細胞含有病毒，即愈傷組織無病毒植株。愈傷組織的某些細胞之因此別帶病毒，其理由是：①病毒的復(fù)制速度趕別上細胞的增殖速度；②有點細胞經(jīng)過突變獲得了抗病毒的抗性。對病毒侵襲具有抗性的細胞也許與敏感的細胞共同存在于母體組織之中。然而，愈傷組織脫毒的缺陷是植株遺傳性別穩(wěn)定，也許會產(chǎn)生變異植株，同時一些作物的愈傷組織尚別能產(chǎn)生再生植株。

(二)珠心胚培養(yǎng)脫毒

（三）莖尖嫁接脫毒

木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實生苗砧木在人工培養(yǎng)基上種植哺育，再從成年無病樹枝上切取0．4～1．0mm莖尖，在砧木上舉行試管微體嫁接，以獲得無病毒幼苗。這在桃、柑橘、蘋果等果樹上已獲得成功，同時有的已在生產(chǎn)上應(yīng)用。

(四)花藥培養(yǎng)脫毒

三、理化辦法脫毒

（一）物理辦法

1.高溫處理

又叫熱處理或溫熱療法。其基本原理是一些病毒對熱別穩(wěn)定，在高于常溫的溫度下即鈍化失活。

2.低溫處理

低溫處理又稱冷療法。適當增加低溫處理時刻可提高脫毒效果

（二）化學(xué)處理

1.病毒抗血清預(yù)處理

用齒舌蘭環(huán)斑病毒（ORV）的血清處理蘭屬離體分生組織，提高了再生株中無ORV的植株頻率，

2.RNA合成抑制劑處理

煙草愈傷組織培養(yǎng)基中加入2-硫脲嘧啶，可除去組織中馬鈴薯Y病毒

3.三氮唑核苷處理

三氮唑核苷又叫病毒唑，是防治動物RNA病毒和DNA病毒病的廣譜性抗病毒制劑。

第三節(jié)脫毒苗鑒定

上述途徑哺育得到的植株，必須通過嚴格的鑒定，證明真的無病毒存在，才是其正的無病毒苗，才能夠提供給生產(chǎn)應(yīng)用。鑒定的辦法有多種。

一、直截了當檢測法

直截了當觀看待測植株生長狀態(tài)是否異常，莖葉上有無特定病毒引起的可見癥狀，從而可推斷病毒是否存在。

二、指示植物(indicatingPlant)法

利用病毒在其他植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒不病毒種類的辦法，算是枯斑和空斑的測定法。這種特意選用以產(chǎn)生局部病斑的寄主即為指示植物，又稱鑒不寄主。它只能鑒定靠汁液傳染的病毒。指示植物法最早是美國的病毒學(xué)家Holmes1929年發(fā)覺的。他用感染TMV的一般煙葉的粗汁液和少許金剛砂相混合，然后在煙葉子上摩擦2～3d后葉片上浮現(xiàn)了局部壞死斑。在一定范圍內(nèi)，枯斑與侵染性病毒的濃度成正比。這種辦法條件簡單，操作方便，故向來沿用至今，仍為一種經(jīng)濟而有效的鑒定辦法?？莅叻▌e能測出病毒總的核蛋白濃度，而只能測出病毒的相對感染力。由于病毒的寄生范圍別同，因此應(yīng)依照別同的病毒挑選適合的指示植物。此外還要求所挑選的指示植物別但一年四季都容易栽培，同時在較長的階段內(nèi)還能保持對病毒的敏感性和容易接種，而且在較廣的范圍內(nèi)具有同樣的反應(yīng)。指示植物普通有兩種類型：一種是接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性癥狀，其病毒可擴展到植物非接種部位，通常沒有局部病斑；另一種是只產(chǎn)生局部病斑，常由壞死、褪綠或環(huán)狀病斑構(gòu)成。

在接種時從被鑒定植物上取1～3g幼葉，在研缽中加10ml水及少量磷酸緩沖液(pH值7．0)，研碎后用兩層紗布濾去渣滓，再在汁液中加入少量的500～600目金鋼砂作為指示植物葉片的摩擦劑，使葉面造成小的傷口，而別破壞表面細胞。往后用棉球蘸取汁液在葉面上輕輕涂抹2～3次舉行接種，后用清水沖洗葉面。接種時可用手指涂抹、用紗布或用噴槍等來接種。為確保接種質(zhì)量接種工作應(yīng)在防蚜蟲溫室中舉行，保溫15～25℃。接種后2～6d可見到上述癥狀浮現(xiàn)。木本多年生果樹植物及草莓等無性生殖的草本植物，由于采納汁液接種法比較困難，因此通常采納嫁接接種的辦法。以指示植物作砧木，被鑒定植物作接穗，常用劈接法。

三、抗血清(antiserum)鑒定法

物病毒是由蛋白質(zhì)和核酸組成的核蛋白，因而是一種較好的抗原，給動物注射后會產(chǎn)生抗體，抗體存在于血清之中稱抗血清。別同病毒產(chǎn)生的抗血清有各自的特異性。用已知抗血清能夠鑒定未知病毒的種類。這種抗血清算是高度專一性的試劑，這種辦法特異性高，測定速度快，普通幾小時甚至幾分鐘就能夠完成。因此抗血清法成為植物病毒鑒定中最實用的辦法之一。抗血清鑒定法要舉行抗原的制備(包括病毒的生殖，病葉研磨和粗汁液澄清等)，抗血清的采收，分離等。血清可分裝到小玻璃瓶中，貯存在-15～25℃的冰凍條件下。測定時，把稀釋的抗血清與未知的病毒植物在小試管內(nèi)混合，這一反應(yīng)導(dǎo)致形成可見的沉淀。然后依照沉淀反應(yīng)來鑒定病毒。

四、分子生物學(xué)鑒定法

1.雙鏈RNA法

在受RNA病毒侵染的植物體內(nèi),有相應(yīng)復(fù)制形式的雙鏈RNA存在,而在健康植株中未發(fā)覺病毒的dsRNA

2.互補DNA檢測法

用互補DNA檢測病毒的辦法又稱DNA分子雜交法

五、電鏡檢測法

由于人的雙眼難以觀看小于0.1mm的微粒，而借助于一般光學(xué)顯微鏡也只能看到小至200um的微粒，因此惟獨經(jīng)過電子顯微鏡才干分辨0.5um大小的病毒顆粒。如此采納電子顯微鏡既能夠直截了當觀看病毒，檢查出有無病毒存在，了解病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)，又能夠鑒定病毒的種類。這是一種較為先進的辦法，但需一定的設(shè)備和技術(shù)。

由于電子的穿透力非常低，制品必須薄到10～100um，通常制成厚20um左右的薄片，置于銅載網(wǎng)上，才干在電子顯微鏡下觀看到。近代進展使電鏡結(jié)合血清學(xué)檢測病毒，稱為免疫吸附電鏡(ISEM)。新研制的電鏡銅網(wǎng)用碳支持膜使飄蕩膜到位，用少量的稀釋抗血清孵育30min，就能夠把血清蛋白吸附在膜上，銅網(wǎng)飄蕩在緩沖溶液中除去過量蛋白質(zhì)，用濾紙吸干，加入一滴病毒懸浮液或感染組織的提取液，1～2h后，往常吸附在銅網(wǎng)上的抗體陷入同源的病毒顆粒，在電鏡下即可見到病毒的粒子。這一辦法的優(yōu)點是靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測定病毒。

無病毒苗的保存和生殖

一、無病毒苗的保存

無病毒植株并別是有額外的抗病性，它們有也許非?？煊直恢匦赂腥?。因此一旦哺育得到無病毒苗，就應(yīng)非常好地隔離與保存。這些原原種或原種材料保管得好能夠保存利用5~10年。通常無病毒苗應(yīng)種植在隔蟲網(wǎng)內(nèi)，使用300目(網(wǎng)眼為0.4～0.5mm大小)的網(wǎng)紗，才能夠防止蚜蟲的進入。栽培用的土壤也應(yīng)舉行消毒，身邊環(huán)境也要整潔，并及時噴施農(nóng)藥防治蟲害，以保證植物材料在與病毒嚴密隔離的條件下栽培。有條件的地點能夠到海島或高嶺山地種植保存，那兒氣候涼快，蟲害少，有利于無病毒材料的生長與生殖。另一種更廉價的辦法，是把由莖尖得到的并差不多過脫毒檢驗的植物經(jīng)過離體培養(yǎng)舉行生殖和保存。

（一）隔離保存

植物病毒的傳播媒介要緊是昆蟲如蚜蟲、葉蟬或土壤線蟲，所以應(yīng)將無病毒原種苗種植于防蟲網(wǎng)室、盆栽缽中保存

（二）長期保存

將無病毒苗原種的器官或幼小植株接種到培養(yǎng)基上，在低溫下離體保存，是長期保存植物無病毒原種及其他優(yōu)良種質(zhì)的辦法。

1.低溫保存

莖尖或小植株接種到培養(yǎng)基上，置低溫、低光照下保存。

2.冷凍保存

用液氮保存植物材料的辦法稱為冷凍保存

二、無病毒苗的生殖

（一）無病毒苗的生殖辦法

1.嫁接生殖

從經(jīng)過鑒定的無病毒母本植株上采集穗條，嫁接到實生砧上

2.扦插生殖

硬枝扦插應(yīng)于冬季從無病毒母本上剪取芽體飽滿的成熟休眠枝，經(jīng)沙藏后，于次年春季剪切扦插

3.壓條生殖

將無病毒母株上1-2年生枝條水平壓條，土壤踩實壓緊，保持濕潤，壓條上的芽眼萌動長出新梢，別斷培土，至新梢基部生根

4.匍匐莖生殖

一些植物的莖匍匐生長。匍匐莖上芽易萌動生根長成小苗，如草莓、甘薯

5.微型塊莖（根）生殖

從無病毒的單莖苗上剪下帶葉的葉柄，扦插到育苗箱砂土中，保持濕度，1-2月后葉柄下長出微型薯塊，即可用作中薯

（二）無病毒苗繁育生產(chǎn)體系

無病毒苗在生產(chǎn)中的利用也要防止病毒的再感染。生產(chǎn)場所應(yīng)隔離病毒感染途徑，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此種植區(qū)及種植規(guī)模小的地點，要較長時刻才會感染。而在種植時刻長、輪作及種植規(guī)模大的產(chǎn)地則在短期內(nèi)就能夠感染。一旦感染，便會妨礙產(chǎn)量和質(zhì)量的保證。所以，應(yīng)重新采納無病毒苗，以保證生產(chǎn)的質(zhì)量。

無病毒苗能夠表現(xiàn)出明顯的優(yōu)良效果。如草莓可增產(chǎn)20％～50％，植株結(jié)果多，單果重增加，上等果比例提高。菊花切花品種的脫毒株，表現(xiàn)出株高增加，切花數(shù)增多，花朵大，切花較重等特點。

第四節(jié)幾種植物的脫毒苗哺育技術(shù)

一、無病毒苗的保存生殖

無病毒植株并別是有額外的抗病性，它們有也許非?？煊直恢匦赂腥?。因此一旦哺育得到無病毒苗，就應(yīng)非常好地隔離與保存。這些原原種或原種材料保管得好能夠保存利用5-10年。

二、無病毒苗的利用

無病毒苗在生產(chǎn)中的利用也要防止病毒的再感染。生產(chǎn)場所應(yīng)隔離病毒感染途徑，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此種植區(qū)及種植規(guī)模小的地點，要較長時刻才會感染。而在種植時刻長、輪作及種植規(guī)模大的產(chǎn)地則在短期內(nèi)就能夠感染。一旦感染，便會妨礙產(chǎn)量和質(zhì)量的保證。所以，應(yīng)重新采納無病毒苗，以保證生產(chǎn)的質(zhì)量。

三、無病毒苗的效果

無病毒苗能夠表現(xiàn)出明顯的優(yōu)良效果。如草莓可增產(chǎn)20％~50％，植株結(jié)果多，單果重增加，上等果比例提高。菊花切花品種的脫毒株，表現(xiàn)出株高增加，切花數(shù)增多，花朵大，切花較重等特點。

第四節(jié)幾種要緊植物的脫毒生產(chǎn)技術(shù)

1、馬鈴薯：

馬鈴薯在種植的過程中易感染病毒，危害馬鈴薯的病毒有17種之多。由于馬鈴薯是無性生殖作物，病毒在母體內(nèi)增值、轉(zhuǎn)運和積存與所結(jié)的薯塊中，同時世代傳遞，逐年加重。

利用莖尖脫毒技術(shù)生產(chǎn)無病毒種薯，是本世紀50年代中期往后馬鈴薯種薯生產(chǎn)上的一大貢獻。我國從70年代就引進了馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)，在全國馬鈴薯生產(chǎn)上發(fā)揮了積極的作用。

微型薯生產(chǎn)技術(shù)

無毒試管苗的保存時刻較短，且要求較嚴格的保存條件；在種質(zhì)材料的交換中容易導(dǎo)致污染而使材料丟失。80年代初浮現(xiàn)的微型薯生產(chǎn)辦法，為馬鈴薯種質(zhì)保存、交換以及無毒種薯的生產(chǎn)和運輸提供了一條便利的途徑

甘薯

旋花科(Convolvulaceae)甘薯屬一年生或多年生蔓生草本。又名番薯、山芋、紅薯、白薯、地瓜等。甘薯是我國4大糧食作物之一，也是飼料和輕工業(yè)的原料。

甘薯是一種采納無性生殖的XXX優(yōu)勢的作物，但營養(yǎng)生殖導(dǎo)致甘薯病毒病蔓延，致使產(chǎn)量和質(zhì)量落低。在引起甘薯品種退化的諸因素中病毒占主導(dǎo)。病毒病已成為我國甘薯生產(chǎn)的最大障礙之一，每年造成