基因工程目基因分離和獲得及重組基因?qū)胫袊幙拼髮W生物工程所有第1頁/共148頁目標基因克隆的三大戰(zhàn)略：1.利用PCR技術或化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆、表達；2.構建感興趣的生物個體的基因組文庫或cDNA文庫；3.利用基因差異表達獲得目的基因。第2頁/共148頁基因的分離和獲得的常用方法一、基因分離的物理方法二、鳥槍法(Shotgun)又稱霰彈法三、cDNA文庫的建立與基因的分離四、基因組文庫法五、基因的化學合成六、聚合酶鏈反應技術（PCR）第3頁/共148頁一、基因分離的物理方法

根據(jù)DNA分子的兩條鏈存在著G≡C，A=T堿基配對。如DNA分子中某段的G≡C堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，其溶解溫度（Tm）就高。這樣，人們通過控制溶解溫度使富A=T區(qū)解鏈變性，而富G≡C區(qū)仍維持雙鏈。當利用單鏈核酸酶S，酶去除解開的單鏈部分，得到富G≡C區(qū)的DNA片段。第4頁/共148頁二、鳥槍法(Shotgun)又稱霰彈法

用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進行切割，得到很多在長度上與一般基因大小相當?shù)腄NA片段（1000bp），然后，將這些片段混合物隨機地重組入適當?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后在受體菌（如：E.Coli）中進行擴增，再用適當?shù)暮Y選方法篩選出你所要的基因。優(yōu)點：操作簡單，命中率較高。缺點：盲目性大，陽性片段不一定正好是基因，樣本多，可能會漏。第5頁/共148頁鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略1、隨機酶切成基因相當大小的片段（約1000bp)；2、重組入適當載體（質(zhì)粒）；3、轉(zhuǎn)化進宿主菌（E.coli)，擴增；4、篩選出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離

+第6頁/共148頁三、基因文庫法cDNA文庫（cDNAlibrary)則是將某生物特定的組織器官或發(fā)育時期的全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并全部克隆成重組子，在該重組子群集中包含了其全部表達基因的產(chǎn)物?；蚪M文庫(Genomiclibrary)是將某一生物基因組DNA全部克隆后獲得的重組子群體的總稱?；蛭膸?Genelibrary)是通過克隆的方法保存在適當宿主中的某種生物、組織、器官或細胞類型的所有DNA片段而構成的克隆集合體。第7頁/共148頁構建基因文庫的意義

1.通過基因文庫的構建貯存和擴增特定生物基因組的全部或部分片段，保存物種遺傳種質(zhì)。2.從基因文庫中調(diào)出其中的任何DNA片段或目的基因。3.構建基因文庫是研究基因本身的需要,如基因結(jié)構的分析、基因表達和調(diào)控的研究等?；蚪M文庫的類型:

質(zhì)粒文庫、噬菌體載體文庫、粘粒文庫、細菌人工染色體文庫和酵母人工染色體文庫。第8頁/共148頁幾個物種基因組大小及基因數(shù)目物種基因組大小（106bp）基因數(shù)目衣原體（M.genitalium）0.58470大腸桿菌（E.coli）4.64288酵母（S.cerevisiae）13.56034果蠅（D.melanogaster）16513600線蟲（C.elegans）9719099擬南芥（A.thaliana）13525500人（H.sapines）330035000第9頁/共148頁構建基因組文庫應滿足的條件

基因組文庫的完備性：是從基因組文庫中篩選出含有某一目的基因的重組克隆的概率。基因組文庫的大小:1）基因組的大?。?/p>

2）克隆片斷的長度；

3）從中分離特定基因的置信度。

N=1n(1一P)／ln[1-L/G]

式中P為期望概率，L為單個重組體的DNA片段的長度，G為基因組DNA的總長度。N是所需要的重組體數(shù)目

第10頁/共148頁例如，某一哺乳動物基因組G=3x109bp，以17kb的隨機片段克隆構建的文庫中，使任一給定DNA序列達99％的概率出現(xiàn)，則：

N＝ln(1-0.99)／ln[1一(17x103／3x109)=8.1x105

如果克隆片斷長為20kb，則N=6.5X105果蠅的基因組約1.5X108bp，以20kb克隆時，N=4X105

第11頁/共148頁基因組文庫的構建

(一）基因組DNA的分離制備原核細胞的基因組包括其擬核的DNA和附加的遺傳體系如質(zhì)粒DNA，真核細胞的基因組包括其核基因組及細胞器如線粒體和葉綠體的DNA。質(zhì)量必須滿足：1.結(jié)構具有相對完整性；2.盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；3.保證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機溶劑及離子等。

第12頁/共148頁（二）基因組DNA的片段化1.限制性內(nèi)切酶對DNA分子的酶解兩種方式：DNA完全酶解和DNA不完全酶解。DNA完全酶解人基因組DNA酶解瓊脂糖凝膠M：DNA分子marker；1：未酶解的人基因組DNA；2：RsaI完全酶解后的DNAM12第13頁/共148頁DNA不完全酶解人基因組DNA以Sau3A酶進行的不完全酶解M：DNA分子marker；1：未酶解的基因組DNA；2-10：顯示酶解的程度逐步提高M12345678910第14頁/共148頁用DNA的隨機片斷克隆法來：機械剪切和部分酶切1)

隨機片斷的重疊性，能夠沿某一克隆“步查”直至將整個染色體銜接起來（利用片段間重疊區(qū)的信息，可以將獨立的重組子加以銜接，最后整個染色體的順序連續(xù)出來：染色體步查）。

2)無須預知靶序列內(nèi)部及其周圍的限制酶切位點而仍能夠分離DNA片段。

3)文庫的規(guī)模減小。由于經(jīng)過挑選而用于克隆的DNA片段大，形成一個哺乳動物基因組DNA文庫所需的重組體數(shù)目顯著減少。第15頁/共148頁第16頁/共148頁第17頁/共148頁DNA分子的物理剪切

運用識別4對堿基的限制性內(nèi)切酶制備隨機性DNA片斷，具有了較高的隨機性，但相對隨機性更高的方式還是運用不依賴堿基序列的物理剪切方法。DNA分子的物理剪切可以采用DNA溶液的小孔噴射、超聲波處理和高速攪拌等幾種方式。

第18頁/共148頁選擇合適的構建基因組文庫的載體：

1）要求有較大的克隆容量；

2）要求在置于宿主中擴增時有較高而均等的轉(zhuǎn)化效率；

3）在重組子進行擴增時，擴增的機會相近；

4）可以較方便地進行文庫的篩選?；蚪M文庫構建的常用載體：Lambda噬菌體載體、cosmid、BAC及YAC。第19頁/共148頁（三）載體制備

替換型載體進行基因文庫的構建示意圖第20頁/共148頁第21頁/共148頁（四）重組連接制備出的適當大小隨機性基因組DNA與載體左臂右臂進行連接，實現(xiàn)左臂—插入分子—右臂的分子重組。構建文庫時重組連接常采用相同粘性末端的連接，以替換型載體構建基因組文庫多采用BamHI酶切末端與插入外源DNASau3AI末端的互補連接。第22頁/共148頁（五）噬菌體離體包裝：

宿主菌蛋白支架狀前頭部前頭部A蛋白結(jié)合在基因組共聚體的cos位點尾部成熟噬菌體頭部功能

噬菌體自組裝及DNA包裝過程第23頁/共148頁（六）重組噬菌體轉(zhuǎn)染大腸桿菌

噬菌體包裝物在宿主大腸桿菌菌苔上檢驗效價及形成噬菌斑第24頁/共148頁其他載體文庫的構建1.粘粒載體文庫第25頁/共148頁2.酵母人工染色體文庫（yeastartificialchromosome,YAC）:第26頁/共148頁YAC含有酵母染色體自主復制序列、著絲點(centromere)、四膜蟲的端粒（telesome以及酵母選擇標記基因組成的能自我復制的克隆載體。并帶有大腸桿菌質(zhì)粒載體的復制元件和選擇標記。酵母選擇標記基因：色氨酸合成酶基因（TRP1），組氨酸合成酶基因（HIS4），尿嘧啶合成酶基因（URA3），赭石突變校正基因（SUP4）。YAC載體以環(huán)狀的方式存在，可插入長度達100-2000kb的外源DNA。第27頁/共148頁

與YAC載體配套工作的宿主酵母菌帶有一個赭石突變ade2。帶有這個突變的酵母菌在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當帶有赭石突變抑制基因sup4的載體存在于細胞中時，可抑制ade2-1基因的突變效應，形成正常的白色菌落。無義突變：由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變成一個終止密碼子的基因突變叫無義突變。其中密碼子改變?yōu)閁AG的無義突變又叫琥珀突變，密碼子改變成UAA的無義突變又叫赭石突變。

第28頁/共148頁細菌人工染色體（BacterialArtificialChromosomesBAC）

細菌人工染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎上構建的，命名為pBACs，其裝載量范圍在50-300kb之間。攜帶一個Cmr，嚴謹型復制子oriS,解旋酶基因repE,

確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細胞的基因座parA,parB,parC及多克隆位點第29頁/共148頁重組分子導入受體細胞

以Lambda噬菌體載體和cosmid載體構建的重組分子在體外包裝成噬菌體顆粒，通過感染細菌的方式將重組分子導入受體細胞。以酵母人工染色體和細菌人工染色體載體構建的重組分子采用電激轉(zhuǎn)化法將重組分子導入受體細胞。第30頁/共148頁基因組文庫的擴增篩選

1.文庫的擴增

lambda載體的基因組文庫是以噬菌斑的形式獲得重組噬菌體的集合；

cosmid載體的基因文庫是存在于細菌中的大分子重組質(zhì)粒，以獨立的轉(zhuǎn)化菌落形成集合；BAC文庫也是以細菌菌落形式存在；

YAC文庫則以酵母菌形式出現(xiàn)。噬菌體文庫的擴增可以通過感染宿主，每一噬菌斑便是一個重組噬菌體擴增后的產(chǎn)物。用緩沖液將這些噬菌斑中的病毒洗脫下來，便獲得了擴增后的文庫。離心除出細菌碎片等雜質(zhì)后，上清液加1-2滴氯仿，置于40C可以保存數(shù)年。

粘粒載體、BAC和YAC文庫，則對轉(zhuǎn)化的菌落單獨編號、擴增和保存。第31頁/共148頁2.文庫的篩選硝酸纖維素膜或尼龍膜放射性標記探針進行文庫雜交篩選第32頁/共148頁染色體步移(chromosomewalking)

當基因的位置已知，但沒有可用的探針，只知道同一染色體上的另外一個已經(jīng)克隆的基因，就可以通過染色體步移方法克隆所需的基因。

其基本原理是用探針篩選文庫，得到陽性克隆后，將這個重組載體中的插入片段分離出來，然后用這個片段的末端部分(注意不能包含重復序列)作為新一輪篩查文庫的探針；得到新的重組載體中的插入片段，同上一個插入片段的末端部分(即探針序列)是重疊的，共有的。也就是這兩個片段是在同一條染色體上相互鄰接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作為探針，再去篩選文庫。通過一系列的操作，得到的插入片段逐漸連接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。第33頁/共148頁

其基本策略是根據(jù)已知基因片段的末端序列合成探針，反復進行基因文庫的篩選，知道滿足需要為止。

染色體步移是一項復雜、繁瑣的技術，到目前為止，步移最大的距離時200-250kb。然而成功的報道很多，如人類的囊腫性纖維化疾病基因。第34頁/共148頁cDNA文庫的優(yōu)越性：1

cDNA克隆以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒，例如流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和呼腸孤病毒等的基因組結(jié)構研究及有關基因的克隆分離。2

cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行。 3．每一個cDNA克隆對應于一種mRNA序列，假陽性的概率就會比較低，因此陽性的雜交信號一般都是有意義的，由此選擇出來的陽性克隆將會含有目的基因的序列。4．cDNA克隆可用于在細菌中表達基因的產(chǎn)物。

cDNA文庫的構建與篩選第35頁/共148頁

cDNA文庫的大?。篶DNA基因文庫大小的估算公式

N=ln(l-P)/ln(l-f)N為cDNA基因文庫必需的克隆的數(shù)目；P為文庫中含目的基因cDNA片段的出現(xiàn)概率，一般情況下，期望值為99%；f是某種mRNA的豐度。第36頁/共148頁

cDNA文庫

用細胞總mRNA制備全套雙鏈cDNA后，建立的基因文庫。簡稱c－文庫。第37頁/共148頁

cDNA文庫的構建：1.cDNA文庫構建的載體cDNA是由mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得的互補DNA，分子大小通常分布在0.5kb—10kb間。第38頁/共148頁

2.cDNA的獲得

a.分離mRNA

分離總體RNA：利用guanidinethiocyanate（異硫氰酸胍）?-mercaptoethanol（?-巰基乙醇）使核糖體解體，而染色體不發(fā)生解體，再采用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，獲得RNA。利用mRNA分子的3‘端都含有一段由20-250個多聚腺核苷酸組成的poly(A)尾巴將mRNA從細胞總RNA的混合物中分離出來。第39頁/共148頁GIT與β－巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT與十二烷基肌氨酸鈉（Sarcosyl）作用使蛋白質(zhì)變性，從而釋放RNA；酸性條件下DNA極少發(fā)生解離，同蛋白質(zhì)一起變性被離心下來，RNA則溶于上清中。該法所提RNA純度高完整性好較適合純化mRNA，逆轉(zhuǎn)錄及構建cDNA文庫，因此為大多數(shù)人采用。與氯化銫方法比較，雖然純度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但產(chǎn)量高完整性好，鹽易去除。第40頁/共148頁

第41頁/共148頁b.對mRNA進行富集已知要分離的目的基因mRNA的分子大小，通過凝膠電泳或蔗糖密度梯度離心，回收與目的基因mRNA分子大小相近的mRNA。分離未知分子大小的目的基因cDNA,則可把最初制備的總mRNA先通過蔗糖密度梯度離心或凝膠電泳，按mRNA分子大小分部回收mRNA。隨后將每個分部回收的mRNA進行體外轉(zhuǎn)譯，并結(jié)合使用免疫沉淀和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技木，鑒定出目的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。再以此分部mRNA構建cDNA基因文庫。通過離心和電泳的分部分離，可以使低豐度的mRNA得以富集。細胞中的mRNA根據(jù)其在細胞中的拷貝數(shù)，可分為兩大類：一類為高豐度mRNA，通常有100種左右的不同的mRNA，每種mRNA的拷貝數(shù)在1,000至10,000間；另一類為低豐度mRNA，包括約10,000種mRNA每種的拷貝數(shù)在1至10間。第42頁/共148頁c.cDNA的合成

cDNA第一鏈的合成是以mRNA分子為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用適當?shù)囊镆龑Ш铣傻摹３Ｓ梅椒ㄓ?，即oligo-(dT)引導的cDNA合成法和隨機引物引導的cDNA合成法。oligo-(dT)引導的cDNA合成法是利用12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo-(dT)短片段作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板合成第一鏈cDNA，形成RNA-DNA雜交分子。

第43頁/共148頁cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mDNAcDNA第一鏈的合成

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5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs第44頁/共148頁cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

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3’KlenowdNTPsS1第45頁/共148頁cDNA第二鏈的合成

DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

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5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA5’5’TTTTTTTTTTTTTT3’3’T4-DNAligase第46頁/共148頁cDNA第二鏈的合成

dCTP引導合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

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3’NaOH退火KlenowdNTPs第47頁/共148頁雙鏈平頭的cDNA通?？寺∪胼d體中的三種方法：平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段的回收d.粘性末端片斷與載體的連接第48頁/共148頁人工接頭法克隆cDNA入插入型載體第49頁/共148頁e.離體包裝獲得重組噬菌體

第50頁/共148頁文庫的篩選：篩選文庫即指從文庫克隆的群體中將特定的克隆選擇出來的過程。分離基因的依據(jù)：根據(jù)目的基因的某些或某個特性來進行克隆篩選及基因分離。對于編碼產(chǎn)物已知的目的基因：

1.可以根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列推導出核苷酸序列，并以該核苷酸序列作為探針進行直接的分離。2.可以應用特定的蛋白質(zhì)抗體及蛋白質(zhì)的功能測定來篩選相應的目的基因。編碼產(chǎn)物未知的目的基因：需要用特殊的分離手段(諸如差別顯示技術、差別雜交方法等)獲得探針，然后再進一步從基因文庫中分離得到目的基因。第51頁/共148頁運用簡并探針篩選cDNA文庫1.運用氨基酸序列信息進行cDNA文庫篩選第52頁/共148頁運用簡并探針篩選cDNA文庫第53頁/共148頁運用標記抗體對cDNA文庫進行篩選2.運用標記抗體對cDNA文庫進行篩選第54頁/共148頁

3.分子探針雜交的方法，通過分子雜交后的信號，將與探針特異結(jié)合的克隆釣取出來。噬菌斑的吸印與雜交第55頁/共148頁利用差別雜交方法對文庫進行篩選

第56頁/共148頁4.運用PCR方法進行cDNA文庫篩選第57頁/共148頁基因組文庫與鳥槍法的不同點1、克隆的DNA片段較大（10~30Kb，平均20Kb)，而鳥槍法為1000bp;2、可以覆蓋宿主DNA的所有序列；3、DNA片段要進行分離：分離方法如：蔗糖密度梯度離心凝膠電泳4、載體不同?；蚪M文庫法為噬菌體，而鳥槍法為質(zhì)粒。值得注意的是，從基因組文庫所分離獲得的基因序列包含有內(nèi)含子，因此不能直接在原核細胞中表達，但更適合作為如轉(zhuǎn)基因動物等的真核表達系統(tǒng)。第58頁/共148頁四、基因的化學合成隨著寡核苷酸化學合成的自動化，基因的化學合成變得更經(jīng)濟、容易和準確。前提條件：對基因的結(jié)構序列清楚。分為：基因片段的全化學合成基因的化學—酶促合成第59頁/共148頁化學合成的單元操作HHDMT：二甲氧基三苯甲基OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH激活縮合氧化脫取代基玻璃珠連接臂第60頁/共148頁基因片段全化學合成混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成正負鏈單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

第61頁/共148頁基因的化學——酶促合成混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合第62頁/共148頁全長基因合成化學合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段。小片段粘接法：

混合退火T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

第63頁/共148頁補釘延長法：

混合退火根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合第64頁/共148頁基因的化學合成的優(yōu)點1、可以合成細菌偏愛的密碼子2、可以定向改變個別氨基酸3、可以在兩端加上需要的限制酶切點4、可以通過自動化儀器合成第65頁/共148頁

上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%第66頁/共148頁五、聚合酶鏈反應技術（PCR）定義：聚合酶鏈反應技術是指在四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸為引物，以單鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化，合成DNA互補鏈達到基因擴增目的的過程。第67頁/共148頁PCR技術反應周期包括三個步驟：1、高溫變性：通過加熱使得復制雙螺旋DNA變性分離為單鏈，作為模板。（>91℃，1分鐘）。2、低溫退火：（約50℃，1分鐘）使專門設計的一對寡核苷酸引物在此低溫條件下分別與單鏈模板DNA兩端的互補區(qū)段互補結(jié)合。3、適溫延伸：將反應混合物的溫度上升到72℃，保溫1分鐘。第68頁/共148頁第69頁/共148頁PCR原理圖

第70頁/共148頁PCR反應的必要條件：須知基因兩端的部分序列PCR反應中的幾個關鍵因素1、TaqDNA聚合酶2、引物的長度3、模板4、Mg濃度5、溫度循環(huán)參數(shù)PCR反應的優(yōu)點：1、操作簡單2、通用性好3、成功率高PCR主要參數(shù)確定：退火溫度Mg2+

反應時間循環(huán)次數(shù)第71頁/共148頁RE1RE2Sequencing已知靶序列擴增側(cè)翼序列的PCR常規(guī)PCR衍生的幾種基因克隆技術（一）反向PCR(inversePCR)第72頁/共148頁（二）熱不對稱交錯PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)簡并引物是指用來編碼一段短肽序列的不同堿基序列的混合物。

原理：根據(jù)目標序列的側(cè)翼已知序列設計３個嵌套的特異引物（sp1,sp2,sp3,約20bp），用它們分別和一個具有低Tm值的短隨機簡并引物（arbitrarydegenerateprimer,AD,約14bp)相結(jié)合，以基因組為模板，根據(jù)引物長度及特異性的差異設計不對稱的溫度循環(huán)，通過分級反應來擴增特異引物。TAIL-PCR分三輪反應第73頁/共148頁第74頁/共148頁（1）提取基因組totalRNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴增（3）根據(jù)目的基因序列設計引物(三）從mRNA中擴增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。適合擴增真核生物基因。第75頁/共148頁目的基因的引物1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNA第一鏈目的基因的引物2目的基因cDNA第二鏈PCRmRNA第76頁/共148頁（四）錨定PCR（五）cDNA末端的快速擴增cDNA末端的快速擴增（rapidamplificationofcDNAends,RACE）是克隆目標基因cDNA的一種常用方法。這種方法根據(jù)基因編碼蛋白的同源性或者多個同源基因cDNA比較的變異情況，將同源性基因cDNA的核心區(qū)段分析出來，針對核心區(qū)段保守性高的位點設計引物，然后運用RT-PCR先擴增和克隆核心序列區(qū)。在測定核心序列后，根據(jù)核心序列設計新的引物并分別進行cDNA3端和5端的擴增。最后拼湊成cDNA全序列的信息并設計新的一對引物將其RT-PCR擴增并克隆。第77頁/共148頁RACE示意圖

第78頁/共148頁利用oligo(dT)引物反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈后，以核心區(qū)段引物擴增出中間核心片段，測序后可以設計出3RACE的上游引物和5的下游引物，3端上游引物結(jié)合oligo(dT)下游引物將cDNA3端克隆出來。第79頁/共148頁1.分析核心區(qū)段利用已克隆的人和果蠅的基因資料，克隆蚊子的胰蛋白酶基因cDNA。先比較人和果蠅胰蛋白酶氨基酸序列的同源性.2.設計簡并引物和擴增核心區(qū)段

氨基酸序列

W(Trp)V(Val)L(Leu)T(Thr)A(Ala)

密碼子

UGGGTTTTAACTGCT

CGCCACTTAAGCGGGA第80頁/共148頁3.設計RACE引物擴增的核心區(qū)段克隆和測序后，即獲得了目標基因中間部分的序列，根據(jù)這一序列分別設計3RACE的上游引物和5RACE的下游引物。4.3

端RACEcDNA3的快速克隆比較簡單，根據(jù)中間核心序列設計出3

端RACE的上游引物后，利用oligo(dT)作為下游引物，利用mRNA反轉(zhuǎn)錄體系作為模板，PCR在兩引物間將cDNA3端擴增出來。第81頁/共148頁5.5

端RACE5

端RACE時，盡管其下游引物根據(jù)克隆的核心序列可以確定下來，但由于5

端上游序列還未知，上游的引物難以確定，因而5RACE要采用一些特殊方法確定其上游引物位點。第82頁/共148頁BD公司SMARTcDNA5端RACE試劑盒原理圖第83頁/共148頁在反轉(zhuǎn)錄酶（RT）作用下，利用Oligo(dT)作引物合成cDNA第一鏈，RT在cDNA第一鏈末端延伸合成了幾個C堿基，體系中加入的3端為G堿基的寡聚序列與cDNA末端互補，作為cDNA繼續(xù)延伸合成的模板，在cDNA的末端合成出一段已知序列，形成5RACE的引物位點。第84頁/共148頁五、根據(jù)基因差異表達獲得目的基因1.差異顯示PCR（DD-PCR）差異顯示技術的原理和實驗程序:

1992年，Liang和Pardee首次提出差異顯示技術(DD-PCR)，其基本原理是，利用一系列的oligo(dT)引物，逆轉(zhuǎn)錄真核生物細胞中全部表達的mRNA，通過PCR擴增的方法，轉(zhuǎn)換成cDNA雙鏈，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將有差異的片段分開，篩選出目的基因。其技術一般包括下列步驟：(1)從植物組織中提取總RNA，在這個步驟中注意不能有DNA污染，一般用無RNA酶的DNA酶在37℃下處理30min；第85頁/共148頁(2)在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以Oligo(dTMN)為引物(M為G、A、C中的任一種，N為A、C、G、T任一種)，進行逆轉(zhuǎn)錄；(3)PCR反應，擴增cDNA的第一條鏈；(4)擴增后的cDNA進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使差異表達的cDNA片段在6%測序膠上分開；(5)找出不同處理間差異顯示的條帶，從膠上切割下來，并回收，再進行第二次擴增；(6)克隆差異片段，差異片段可作為探針；(7)Northern雜交，驗證目的片段，去掉假陽性片段；(8)對目的片段進行測序；(9)以克隆的目的片段為探針，從基因組文庫中篩選出相應的全長基因。第86頁/共148頁DD-PCR法具有快速、靈敏、簡單和可分析低豐度mRMA的優(yōu)點已為植物的基因表達研究和基因克隆所證實。但也有一些缺點，如擴增片段短、假陽性高、檢測全部mRMA工作量大、基因的克隆受mRMA表達的時效性影響等。第87頁/共148頁DD-PCR的技術流程第88頁/共148頁2.mRNA差異顯示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端的錨定引物Oligo(dT)引物的3’端加兩個核苷酸（倒數(shù)第二個不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’

3’

第89頁/共148頁（2）12種錨定引物AGTTTTTTTT5’

3’

CGTTTTTTTT5’

3’

GGTTTTTTTT5’

3’

TGTTTTTTTT5’

3’

AATTTTTTTT5’

3’

CATTTTTTTT5’

3’

GATTTTTTTT5’

3’

TATTTTTTTT5’

3’

ACTTTTTTTT5’

3’

CCTTTTTTTT5’

3’

GCTTTTTTTT5’

3’

TCTTTTTTTT5’

3’

第90頁/共148頁（3）5’端的隨機引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTT5’

3’

擴增cDNA第一鏈。RTNMTTTTTTTT5’

cDNA3’

NNNNNNNNNN5’

3’

NNNNNNNNNN5’

3’

cDNA第二鏈，并PCR第91頁/共148頁（4）隨機引物與錨定引物成對擴增12種錨定引物，若與20種隨機引物，可組成240組引物。引物組合：240組在能分出20000多條帶！實驗結(jié)果：如果每條帶相當于一種mRNA，20000mRNA基本上反映了一種特定細胞中全部的mRNA。在測序膠上，每組擴出50-100條長度為100-500bp的帶。第92頁/共148頁（5）隨機-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較不同組織的240組引物組合PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。選擇有差異的帶，進一步PCR作探針。篩選文庫，找到差別基因的全長序列。第93頁/共148頁3.代表性差異分析此法是由Hubank和Schatz1994年提出的。將合成的cDNA酶切，通過降低cDNA群體復雜度和多次更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴增目的基因片段，重復性好，假陽性低。其主要步驟是，提取總RMA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用識別4個堿基的限制性內(nèi)切酶消化，連接接頭，擴增出不同的代表子，進行Tester與Driver雜交，消減雜交富集，從而找出差異cDNA片段。

第94頁/共148頁SchematicdiagramofimprovedcDNArepresentationaldifferenceanalysis(RDA)procedure第95頁/共148頁BasicstrategyforcDNA-basedrepresentationaldifferenceanalysis.第96頁/共148頁第五節(jié)重組DNA向宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移技術由于外源基因與載體構成的重組DNA分子性質(zhì)不同、宿主細胞不同，將重組DNA導入宿主細胞的具體方法也不相同。轉(zhuǎn)化：是指微生物細胞直接吸收外源DNA的過程。是使重組體DNA分子在熱休克的短暫時間內(nèi)被導入受體。熱休克后將受體菌在不含抗生素的培養(yǎng)液中生長至少30分鐘以上，使其蛋白得到足夠表達，以便能在含抗生素的瓊脂培養(yǎng)平板上生長。由于E.coliX1776菌株用CaCl2處理后制備的感受態(tài)細胞長期冷藏仍能保持其攝取外源DNA的能力，故常用作受體菌。轉(zhuǎn)染：是指噬菌體、病毒、或以其為載體構建的重組DNA導入細胞的過程。(其中又分磷酸鈣沉淀法與體外包裝法)轉(zhuǎn)導：重組的噬菌體DNA或重組的粘粒DNA必須包裝成完整的噬菌體顆粒，通過溫和噬菌體顆粒的釋放和感染將重組DNA轉(zhuǎn)移至宿主內(nèi)的過程。第97頁/共148頁重組DNA導入受體細胞的途徑轉(zhuǎn)化：transfermation，通過生物學或理化方法使質(zhì)粒DNA或以質(zhì)粒DNA為載體構建的重組DNA導入受體細胞內(nèi)，并在受體內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程，主要用于原核生物。轉(zhuǎn)染：transfection，是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式，指病毒或以病毒為載體構建的重組DNA導入受體細胞，并使宿主遺傳性狀發(fā)生改變的過程，其中包括DNA、RT-DNA及RNAi，主要用于原核生物。轉(zhuǎn)導:(transduction)以噬菌體作載體構建的重組體導入受體細胞的過程。第98頁/共148頁1.直接轉(zhuǎn)化法有的微生物細胞在不加任何處理的情況下就能直接攝取外源DNA，只要外源DNA與這樣的細胞混合，在適宜的條件下懸浮培養(yǎng)，就能完成外源DNA的轉(zhuǎn)化。細菌轉(zhuǎn)化：指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一細菌菌株的DNA，而導致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫給體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株叫受體菌株。第99頁/共148頁大腸桿菌是目前基因工程中最常用的受體細胞。通常采用的是大腸桿菌的感受態(tài)細胞，即在冰浴中用一定濃度的CaCl2處理對數(shù)生長期的大腸桿菌，以獲得高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亞礬、二硫蘇糖醇(DTT)或用氯化己胺鈷處理制備感受態(tài)細胞。感受態(tài)：是指受體細胞能吸收外源DNA分子而有效地作為轉(zhuǎn)化受體的某些生理狀態(tài)。一般受體細胞在對數(shù)生長期轉(zhuǎn)化能力最強。感受態(tài)細胞(competentcell):具有易于接受外源DNA能力的細胞?；蚬こ讨?，宿主細胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組DNA分子的敏感狀態(tài)，才能用于轉(zhuǎn)化，這種敏感細胞稱為人工感受態(tài)細胞。第100頁/共148頁感受態(tài)細胞的制取一般是將細菌（如大腸桿菌等）用一定濃度的冰冷CaCl2處理而得。1970年建立此技術，其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞變?yōu)楦惺軕B(tài)細胞。

為了得到較好的感受態(tài)細胞，需注意以下幾點：1、細胞要處于對數(shù)生長期2、整個制備過程要在低溫（0~4℃）進行3、為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復合氯化鈣溶液第101頁/共148頁操作程序：1處于對數(shù)生長期的細菌置于0℃的CaCl2低滲溶液中，使細胞膨脹，同時Ca2+使細胞磷脂層形成液晶結(jié)構，使得外膜與內(nèi)膜間隙的部分核酸酶離開所在區(qū)域，構成大腸桿菌人工誘導的感受態(tài)；2加入DNA，Ca2+與DNA形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復合物，并粘附在細菌細胞膜外表面；3經(jīng)短暫42℃熱激處理后，細菌細胞膜的液晶結(jié)構發(fā)生劇烈擾動，出現(xiàn)許多間隙，導致通透性增加，DNA分子進入細胞中。第102頁/共148頁第103頁/共148頁2.化合物誘導轉(zhuǎn)化法原理：外源DNA與多聚物（聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等）、二價陽離子（Mg、Ca、Mn等）混合，再與受體細胞或原生質(zhì)體混合，可使外源DNA進入細胞。尤以PEG應用最廣，可用于原核生物細胞、動物細胞和植物原生質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)化。第104頁/共148頁PEG介導基因轉(zhuǎn)化Davey1980年和Krens1985年首先建立的。步驟轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：將制備的原生質(zhì)體懸浮液與重組DNA一起保溫培養(yǎng)，同時加入PEG在pH8-9下促進原生質(zhì)體攝取DNA，從而使細胞轉(zhuǎn)化。通常使用的PEG分子量3000左右。轉(zhuǎn)化效率很低10-5—10-6第105頁/共148頁3.高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法（1）Electroproration原理：利用高壓電脈沖作用，使細胞膜上產(chǎn)生可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA和高分子物質(zhì)進入細胞質(zhì)內(nèi)而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化，但不傷及細胞，切斷電場后，被擊穿的膜孔可以自行恢復。當電場強度和脈沖時間結(jié)合導致50-70%細菌死亡時，轉(zhuǎn)化水平最高。第106頁/共148頁（2）過程：把宿主細胞置于外加電場中，通過電脈沖作用在細胞膜上打孔，DNA分子進入細胞。（3）條件：電壓300~600V、時間20~100ms、溫度0℃。（4）適用范圍：酵母菌、霉菌等真核生物，適用于農(nóng)桿菌感染不敏感的植物。（5）形式：電穿孔電穿孔+PEG。轉(zhuǎn)化效率10-5—10-6，1.2%第107頁/共148頁例如：高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化細菌對數(shù)生長期的細菌冷卻離心低鹽緩沖液清洗用10%甘油懸浮細胞干冰速凍-70℃貯存有效期6W外加電場（300-600V維持20—100ms）電脈沖轉(zhuǎn)化細胞0-4℃第108頁/共148頁4.微彈轟擊轉(zhuǎn)化法（microprojectilebombardment,particlebombardment）該法亦稱基因槍法(particlegun)，粒子轟擊法，生物彈法（Biolistics）。（1）原理：金屬微粒在外力作用下，達到一定速度后，將包裹在金屬顆粒表面的外源DNA分子隨金屬顆粒一起進入植物細胞，但又不引起細胞致命傷害而維持正常的生命活動。（2）過程：外源DNA與鎢、金等金屬微?；旌?，使DNA吸附在微粒表面；用基因槍轟擊，通過氦氣沖擊波使DNA隨金屬微粒進入植物細胞。第109頁/共148頁（3）適用范圍：植物細胞。（4）特點：操作簡單，轉(zhuǎn)化率高，省去了分離原生質(zhì)體的麻煩，耗資較大。第110頁/共148頁DNA微粒載體的制備原理是CaCl2對DNA沉淀作用，亞精胺、聚乙二醇具有粘附作用、將這些化合物與DNA混合后與鎢粉或金粉混合，吹干后，則DNA沉淀在載體顆粒上第111頁/共148頁基因槍介導的DNA轉(zhuǎn)移基因槍法最早是由美國康奈爾大學的Sanford(1987)最先提出的。它通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導入到受體細胞內(nèi)，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是通過該法獲得的。第112頁/共148頁一類是以火藥爆炸力作為動力加速微彈；第二類是以高壓氣體(highpressuregas)作為動力，如以氦氣、氫氣、氮氣等。其工作原理是把載有DNA的鎢(金)粉噴灑在一張微粒載片上，電極間懸滴著微水滴。在壓縮空氣的沖擊下，微水滴霧狀噴射，驅(qū)動載片。當載片受阻于金屬篩網(wǎng)時,載有DNA的鎢(金)粒繼續(xù)向下沖擊射入細胞。第三類是以高壓放電為驅(qū)動力。其最大優(yōu)點是可以無級調(diào)速，通過變化工作電壓，粒子速度及射入濃度可準確控制，使載有DNA的鎢(金)粉粒子能到達具有再生能力的細胞層。這一點非常重要，因為不同的外植體需要不同的參數(shù)。采用該放電轟擊、已在大豆和水稻上成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株(Christou等，1992)

第113頁/共148頁第114頁/共148頁第115頁/共148頁5.顯微注射法（microinjection）（1）原理：利用顯微注射儀，通過機械方法把外源DNA直接注入細胞質(zhì)或細胞核（需用特制的玻璃微管）。倒置顯微注射儀第116頁/共148頁第117頁/共148頁（2）過程：將外源基因直接注入實驗動物受精卵原核，外源基因整合到動物基因組，通過胚胎移植把含有外源基因的受精卵移植到受體子宮并發(fā)育。（3）適用范圍：真核生物，早期用于動物，現(xiàn)已應用于植物。（4）特點：繁瑣耗時、轉(zhuǎn)化率高，但需專門的顯微注射儀，且要求操作者有精細的操作技術和低密度細胞培養(yǎng)技術。第118頁/共148頁受體細胞的固定動物細胞具有獨特的貼壁生長待性，不存在固定細胞的問題植物細胞必須先建立細胞固定技術目前有三種方法：①瓊脂糖包埋法：把低熔點的瓊脂糖熔化，冷卻到一定溫度后將制備的細胞懸浮液混合于瓊脂糖中。需要注意的問題是，在包埋時細胞約1/3-1/2暴露在瓊脂糖表面，即細胞體的一半埋在瓊脂糖中，起固定作用，暴露的一半細胞可一進行微針注射、否則瓊脂固化后很難進行。②多聚-L-賴氨酸粘連法：先用多聚-L-賴氨酸處理玻片表面，由于聚賴氨酸對細胞有粘連作用，因此當分離的細胞或原生質(zhì)體與玻片接觸時被固定在玻片上。而且一個破片上可固定較多數(shù)量的細胞或原生質(zhì)體。③吸管支持法：用一固定的毛細管將原生質(zhì)體或細胞吸著在管口起到固定作用，然后再用微針進行DNA注射。這種方法的優(yōu)點是吸管可以旋轉(zhuǎn)或移動位置．使操作者能選擇最佳位置進行注射。顯微注射用的微針通常用拉針機制備，尖針直徑以0.5μm左右為宜。一次注入細胞質(zhì)中的DNA量約為10-9／ml。第119頁/共148頁轉(zhuǎn)化率及影響因素

顯微注射雖然操作繁瑣耗時，但其轉(zhuǎn)化效率很高已發(fā)展出一套完善的技術，在煙草、油菜、苜蓿等植物的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率高達60％以上。影響轉(zhuǎn)化率的因素。(1)原生質(zhì)體的成活率是轉(zhuǎn)化率的重要因素，只有注射那些能夠分裂、成活的原生質(zhì)體才能得到轉(zhuǎn)化。因此，注射時要選擇啟動分裂、細胞壁開始形成的原生質(zhì)體進行注射。

(2)線性DNA比環(huán)形DNA具有更高的轉(zhuǎn)化率。

(3)操作要迅速敏捷，選擇最佳的注射強力和濃度，使細胞的損傷減少到最小程度。

(4)固定技術要可靠，不能損傷細胞。第120頁/共148頁顯微注射特點①方法簡單、轉(zhuǎn)化率高；6-8%②它是一種純粹的物理方法，適用于各種植物和各種材料，無局限性；③整個操作過程對受體細胞無藥物等毒害，有利于轉(zhuǎn)化細胞的生長發(fā)育；④轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)過程無需特殊的選擇系統(tǒng)。缺點是需要有精細操作的技術及低密度培養(yǎng)的基礎，注射速度慢、效率低，要求研究者有耐心。第121頁/共148頁6.脂質(zhì)體（liposome）介導法（1）原理：受體細胞的細胞膜表面帶負電荷，脂質(zhì)體顆粒帶正電荷，利用引力的作用把遺傳物質(zhì)導入細胞內(nèi)。即用脂類化學物質(zhì)包裹DNA成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細胞。脂質(zhì)體是根據(jù)生物膜的結(jié)構功能特性合成生物膜，然后把DNA包裹在人工膜內(nèi)。第122頁/共148頁第123頁/共148頁（2）過程：在形成脂質(zhì)體時，把用來轉(zhuǎn)染的目的DNA分子包裹在其中；脂質(zhì)體與細胞接觸；外源DNA分子導入受體細胞。（3）適用范圍：真核細胞。（4）特點：包在脂質(zhì)體內(nèi)的DNA可免受細胞內(nèi)核酸酶的降解，所以可直接轉(zhuǎn)化外源DNA；對植物病毒RNA的轉(zhuǎn)化率高；如用PEG誘導脂質(zhì)體與原生質(zhì)體融合可獲得高的轉(zhuǎn)化率。4ⅹ10-5(5)影響脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化率的因素很多：①脂質(zhì)體的制備類型、方法均有明顯差異；②PEG的濃度、加入時間、PH值及ca”濃度均起到重要作用；③保溫培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化時的條件同樣十分重要。第124頁/共148頁7.花粉管通道法（1）原理：在花粉管通道形成之后封閉之前一段時間，使外源DNA能沿著花粉管通道進入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具正常細胞壁的卵細胞、合子或早期胚胎細胞，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。（2）適用范圍：植物第125頁/共148頁（3）特點：直接得到轉(zhuǎn)化種子，不經(jīng)過組培，減少了基因型的影響；操作簡單經(jīng)濟，無需昂貴儀器和化學藥品，可直接在大田操作；大量快捷，性狀穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率高；可獲得1×10-2~1×10-1的高遺傳轉(zhuǎn)化率。

不僅可以導入供體的總DNA，而且可導入含目的基因的質(zhì)粒，甚至可將化學誘變劑導入胚囊。缺點：工作時間受自然花期限制，田間操作受環(huán)境影響大，基因組以隨機方式結(jié)合，要求工作人員經(jīng)濟性要強，工作效率較低。第126頁/共148頁我國科學家周光宇在1983年首次在“MethodsinEn-zymology”報道的研究成果?，F(xiàn)該技術主要在蔬菜育種上應用。（白菜、茄子、黃瓜、番茄、辣椒等操作步驟:1.外源DNA的制備2.分析受體植物的受精過程及時間，確定導入外源DNA的時間方法（3種）柱頭涂抹法柱頭切除法花粉粒吸入法3.后代材料處理第127頁/共148頁8.超聲波介導轉(zhuǎn)化法（1）原理：利用低音強脈沖超聲波的物理作用，可逆性的擊穿細胞膜并形成過膜通道，使外源DNA進入受體細胞。（2）特點：避免脈沖變電壓對細胞的損傷，有利于細胞存活整個操作轉(zhuǎn)化率較高，如在轉(zhuǎn)化反應中加入DMSO或攜帶DNA則轉(zhuǎn)化率更高。60-70%（3）適用范圍：微生物、植物第128頁/共148頁過程:無菌材料的制備質(zhì)粒DNA的提取超聲波緩沖液配置超聲波處理（去無菌材料切成小塊，放入無菌超聲波小室，同時加入5%DMSO緩沖液，質(zhì)粒DNA20ug/ml及鮭魚精DNA40ug/ml，室溫下超聲波處理30min）處理后用緩沖液洗3次接種在MS或其他培養(yǎng)基上培養(yǎng)第129頁/共148頁9.激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法早在1984年Tao等首先利用激光微束對動物細胞進行DNA轉(zhuǎn)化試驗、此庸Web等利用激光微束技術對原生質(zhì)體、花粉以及活細胞內(nèi)的葉綠體進行外源DNA導入獲得成功，并用熒光標記的大腸桿菌pBR322質(zhì)粒DNA在轉(zhuǎn)化細胞中得到檢測。（1）原理：利用直徑很小、能量很高的激光微束能引起細胞膜可逆性穿孔的原理。在熒光顯微鏡下找適合的細胞，然后用激光代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔外于細胞周圍的外源DNA分子隨之進入受體細胞。（2）特點：操作簡便快捷，轉(zhuǎn)化效率高10-3-10-4，無宿主限制，但需要貴重儀器，技術條件要求高，穩(wěn)定性和安全性不如電穿孔法和基因槍法。（3）適用范圍：動植物細胞、組織、器官及線粒體、葉綠體。第130頁/共148頁過程1）DNA的提取2)受體植物樣品制備：將欲照射的植物細胞或組織用高滲緩沖液浸泡數(shù)分鐘，不同作物不同外植體所用高滲液不同，浸泡時間也不同。

3)轉(zhuǎn)導細胞懸浮液準備：激光照射前洗去高滲液，加新鮮培養(yǎng)液。吸取0.5mI細胞懸浮液，加50ul質(zhì)粒DNA或植物外源DNA(濃度5ug／ml)．一起注入激光微束系統(tǒng)的Rose小室。4)激光微束照射：激光微束顯微照射裝置如為Nd—YAG四集倍頻脈沖激光冠微照射系統(tǒng)、即輸出波長技需要選擇，脈寬10-15ns。激光束引入一臺相差顯微鏡，用40ⅹ物鏡聚焦Y于欲照射的細胞。光斑直徑為1.3nm。照射時移動載物臺，使激光脈沖在植物細胞團上進行掃描照射，照射時間每個佯品60分鐘，約打7000個脈沖。

5)培養(yǎng)：激光照射后，將樣品用新鮮的培養(yǎng)液沖洗1-2次，然后接種在裝有液體培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿中，25度條件下懸浮培養(yǎng)2-3天或固體培養(yǎng)。第131頁/共148頁第132頁/共148頁10.病毒顆粒轉(zhuǎn)導法（1）原理：用病毒(噬菌體)DNA(或RT-DNA)構建的克隆載體或攜帶目的基因的克隆體，在體外包裝成病毒(噬菌體)顆粒后，感染受體細胞，使其攜帶的重組DNA進入受體細胞，將此過程稱為病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導法。（2）適用范圍：主要用于構建基因文庫和目的轉(zhuǎn)基因，早期也用于植物的轉(zhuǎn)基因。（3）類型：帶有目的基因的病毒顆粒直接感染受體細胞，目的基因打隨同病毒DNA分子整合到受體細胞染色體DNA上，這樣以后不需要再包裝成病毒顆粒。帶有目的基因的病毒是缺陷型的，需同另一輔助病毒一起感染受體細胞，在受體細胞內(nèi)包裝成新的病毒顆粒。雖然帶有目的基因的SV40早期轉(zhuǎn)錄是缺陷型的，但被感染的cos細胞系的基因組中整合的SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)段DNA，所以無需輔助病毒做混合感染。第133頁/共148頁11.磷酸鈣轉(zhuǎn)染法（1）原理：哺乳動物細胞能捕獲黏附在細胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細胞。（2）基本操作過程：將待轉(zhuǎn)染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不斷攪拌的Hepers-磷酸鈣溶液中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀復合物；用吸管將沉淀復合物黏附在哺乳動物單層培養(yǎng)細胞表面；保溫幾小時后，用新鮮培養(yǎng)液洗凈細胞，再用新鮮培養(yǎng)茹繼續(xù)培養(yǎng)，直至外源基因表達。（3）特點：多使用高濃度的DNA，10~50μg/ml；保溫時間隨受體細胞而異；Hepers-磷酸鈣溶液應不斷攪拌，DNA溶液則應緩慢加入，否則形成大塊狀顆粒，不利于受體細胞吸納。（4）適用范圍：哺乳動物細胞第