基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)核酸疫苗及免疫研究進(jìn)展第1頁/共92頁

疫苗是將病原微生物（如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。人們將多種滅活或減毒疫苗稱為第一代疫苗。將用基因工程的方法研制的亞單位疫苗稱為第二代疫苗。理想疫苗應(yīng)具備的特征有：安全、廉價、熱穩(wěn)定性好，含有多種具有保護(hù)作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前前兩代均不能滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。故基因疫苗應(yīng)運(yùn)而生。基因疫苗被稱為第三代疫苗。第2頁/共92頁1990年wolff等從事于基因治療工作時，用外源性重組質(zhì)粒給小鼠肌肉注射后，質(zhì)粒被攝取并能在體內(nèi)至少兩個月穩(wěn)定地表達(dá)所編碼蛋白。1991年Williams等發(fā)現(xiàn)外源基因輸入體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。1992年Tang等將表達(dá)人生長激素的基因質(zhì)粒DNA導(dǎo)入小鼠皮內(nèi)，小鼠產(chǎn)生特異性抗體，從而提出了基因免疫的概念。1993年Ulmer等將注射技術(shù)用于研究流感核酸疫苗，證實(shí)核酸注射不但能在體內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，還可以誘導(dǎo)具有顯著保護(hù)作用的免疫應(yīng)答。因此，1994年在日內(nèi)瓦召開的專題會議上將這種疫苗定名為核酸疫苗。第3頁/共92頁關(guān)于核酸免疫的國際會議1994年5月17-18日，瑞士日內(nèi)瓦。WHO主辦。主題：核酸疫苗。1995年2月16-17日，美國馬里蘭州，Bethesda（NIH）。主題：基因疫苗和核酸疫苗戰(zhàn)略。1995年4月6-9日，美國弗吉尼亞州。主題：DNA疫苗：疫苗學(xué)的新時代。1996年2月5-8日，美國馬里蘭州NIHNatcher會議中心。主題：核酸疫苗預(yù)防傳染性疾病和控制核酸疫苗。

第4頁/共92頁定義

核酸疫苗(nucleicacidvaccine),也稱基因疫苗(geneticvaccine),是指一類將抗原基因重組到表達(dá)載體上的重組質(zhì)粒疫苗，經(jīng)肌肉注射或黏膜免疫等方法導(dǎo)入宿主體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。第5頁/共92頁第6頁/共92頁基因疫苗的構(gòu)建基因疫苗構(gòu)建的基本途徑第7頁/共92頁基因疫苗的構(gòu)建一、構(gòu)建基因疫苗的載體載體是將抗原基因?qū)氲綑C(jī)體細(xì)胞的必要工具。1.載體的分類按照載體功能可分為克隆載體和表達(dá)載體；按照載體來源可分為質(zhì)粒、噬菌體、黏粒和病毒載體等。2.常用于構(gòu)建基因疫苗的載體pcDNA3.1、pcDNA3.1-E、pcDNA3.1/Zeo（+/-）、pcDNA4、pcDNA4/HisMAX、pBudCE4、pRc/RSV、pRc/CMV2等多種第8頁/共92頁基因疫苗的構(gòu)建二、基因疫苗的構(gòu)建方法1.抗原基因和載體的制備獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)，從中調(diào)用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA片段，建立cDNA文庫；（3）利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）特異性地擴(kuò)增所需要的目的基因片段，等等。（4）化學(xué)合成第9頁/共92頁基因疫苗的構(gòu)建基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+啟動子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因

為了保證抗原基因的定向正確插入，只有以正確的方向插入表達(dá)載體讀框啟動子下游才能表達(dá)抗原基因，故抗原基因兩端應(yīng)具有不同的酶切位點(diǎn)，在設(shè)計(jì)時須注意這點(diǎn)。第10頁/共92頁2.抗原基因與載體的連接

連接的方式可分為粘性末端連接和平末端連接兩種，其中前者連接效率較高，使用比較多。連接反應(yīng)時應(yīng)考慮反應(yīng)體積、抗原基因與載體的比例、溫度和時間和酶量。第11頁/共92頁粘性末端連接用同一種或兩種限制性內(nèi)切酶酶切DNA連接酶重組質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點(diǎn)第12頁/共92頁平末端連接

質(zhì)粒產(chǎn)生平末端的內(nèi)切酶DNA連接酶產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶核酸酶S1目的基因重組質(zhì)粒產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶核酸酶S1本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點(diǎn)！第13頁/共92頁基因疫苗的構(gòu)建3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒或者以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。轉(zhuǎn)染：將質(zhì)粒或者以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。感受態(tài)：細(xì)菌經(jīng)過CaCl2溶液處理和短暫熱激后，容易攝入外源DNA，這種狀態(tài)稱為感受態(tài)。其原理是細(xì)菌處于0℃、低滲CaCl2溶液中時，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性增加。此時轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)短暫的熱激（42℃）處理后，外源基因容易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。常用的方法為氯化鈣共沉淀法和電穿孔法。第14頁/共92頁基因疫苗的構(gòu)建4.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定一般重組質(zhì)粒鑒定主要按照表型篩選、酶切鑒定和測序鑒定的順序進(jìn)行（1）插入片段鑒定：酶切鑒定；PCR鑒定。（2）插入片段方向性鑒定：可利用聯(lián)合酶切方案進(jìn)行目的基因的插入方向鑒定。（3）DNA序列測定：末端終止法測序；自動測序儀測序第15頁/共92頁基因疫苗的構(gòu)建三、重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)與檢測1.重組質(zhì)粒導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體介導(dǎo)等方法都可以用來將外源質(zhì)粒導(dǎo)入真核細(xì)胞，其中脂質(zhì)體介導(dǎo)容易成功，是最常用的方法。2.抗原基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的檢測（1）蛋白水平的檢測：免疫沉淀法檢測表達(dá)蛋白；Western印跡檢測；酶聯(lián)免疫吸附測定。（2）核酸水平的檢測：RNA印跡；RT-PCR檢測。第16頁/共92頁

由于這個過程實(shí)際上是相當(dāng)復(fù)雜的，所以人們對一些具體的細(xì)節(jié)并不清楚。下面通過對基因疫苗經(jīng)過肌肉組織和黏膜免疫的抗原呈遞途徑來說明基因疫苗的工作原理。第17頁/共92頁第18頁/共92頁基因疫苗經(jīng)黏膜和皮膚組織免疫的抗原呈遞

皮膚或者黏膜是具有高水平免疫監(jiān)視系統(tǒng)的組織，黏膜淋巴組織的功能：參與粘膜局部免疫應(yīng)答和產(chǎn)生分泌型IgA。而且在免疫動物時比較方便，尤其是大面積預(yù)防時，所以關(guān)于基因疫苗通過皮膚或黏膜免疫激活機(jī)體免疫反應(yīng)機(jī)制的研究也比較活躍。

基因疫苗經(jīng)過黏膜和皮膚組織免疫可以分為直接免疫機(jī)體和重組減毒胞內(nèi)菌系統(tǒng)免疫兩種形式。第19頁/共92頁（1）直接免疫旅美中國科學(xué)家范泓然用皮膚涂抹法給小鼠接種乙肝疫苗取得成功，且檢測其效果可以和所用的肌肉注射相媲美。黏膜淋巴結(jié)提供了漿細(xì)胞抗體型轉(zhuǎn)化與Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞定向分化的微環(huán)境。基因疫苗經(jīng)過黏膜免疫可以很好地激活B細(xì)胞分泌IgA，同時啟動Th2細(xì)胞功能，但其對細(xì)胞免疫（尤其是CTL細(xì)胞）活化不足，通過黏膜免疫獲得的保護(hù)作用不如通過肌肉免疫獲得的強(qiáng)烈。第20頁/共92頁（2）用重組減毒胞內(nèi)菌系統(tǒng)采用志賀氏菌、沙門氏菌或李斯特菌等重組減毒胞內(nèi)菌系統(tǒng)，通過粘膜自然感染途徑運(yùn)送DNA疫苗是一類很好的方法。因?yàn)樗鼈兛梢詫⒒蛞呙缰苯映仕徒oAPCs，所以這種方法運(yùn)送效率高、免疫方法簡單、免疫效果好，能同時激活粘膜免疫和全身免疫，并可獲得對載體菌的免疫等優(yōu)點(diǎn)。減毒沙門氏菌通過自然感染的方式高效地將基因疫苗直接運(yùn)送給體內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞（APCs）如樹突細(xì)胞（DCs）和巨噬細(xì)胞，在粘膜和全身淋巴組織誘發(fā)以Th1型應(yīng)答為主的細(xì)胞免疫和體液免疫，APCs尤其是DCs可能在其中起到了關(guān)鍵作用。第21頁/共92頁攜帶基因疫苗重組減毒沙門氏菌誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的機(jī)制

重組減毒沙門氏菌攜帶的基因疫苗激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫的機(jī)制還不完全清楚?？赡芡緩揭唬篋Cs和巨噬細(xì)胞吞噬侵入腸粘膜屏障的重組沙門氏菌并被激活，活化的DCs和巨噬細(xì)胞遷移到脾臟等淋巴組織（DCs具有很強(qiáng)的遷移能力，而巨噬細(xì)胞尚有一些疑問），載體菌在此裂解，基因疫苗進(jìn)入胞液，然后進(jìn)入細(xì)胞核，最后表達(dá)目的抗原。接著激活特異的CTL，裂解表達(dá)抗原的APCs，APCs內(nèi)的抗原被釋放激活輔助T細(xì)胞和誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，激活細(xì)胞免疫和體液免疫?？赡芡緩蕉褐亟M沙門氏菌引起吞噬它的APCs凋亡，凋亡產(chǎn)物（含有目的抗原/基因疫苗）被鄰近的APCs吞噬。第22頁/共92頁核酸疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1免疫保護(hù)力增強(qiáng)

2制備簡單，省時省力

3同種異株交叉保護(hù)

4應(yīng)用較安全

5產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答

6貯存、運(yùn)輸方便

7可用于防治腫瘤缺點(diǎn)：1質(zhì)粒DNA可能誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)

2持續(xù)表達(dá)外源抗原可能產(chǎn)生一些不良后果

3肌肉注射質(zhì)粒后，僅有很少部分被肌細(xì)胞所攝取

4影響核酸疫苗誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的因素很多５外源DNA注入體內(nèi)后，可能整合到宿主基因組上，使宿主細(xì)胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞第23頁/共92頁核酸疫苗的應(yīng)用現(xiàn)狀有關(guān)質(zhì)粒DNA疫苗在人類及動物產(chǎn)生預(yù)防和治療作用的研究報道不斷增加，應(yīng)用范圍也逐漸擴(kuò)大。人們期望用核酸疫苗來征服諸如微生物感染性疾病、寄生蟲病等頑癥，并用于腫瘤、遺傳病和其他多種疾病的基因水平治療，所以作了多方面的嘗試。病毒感染性疾病的核酸疫苗非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗寄生蟲核酸疫苗腫瘤核酸疫苗第24頁/共92頁發(fā)展前景

核酸疫苗的研究只是近十幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)新的生物技術(shù)，它已成為疫苗研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一，特別是其研究方向與世界衛(wèi)生組織兒童疫苗計(jì)劃的長遠(yuǎn)目標(biāo)（用一種疫苗預(yù)防多種疾?。┫辔呛稀，F(xiàn)在已獲得了迅速的發(fā)展。它的研究具有深遠(yuǎn)意義，可用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲等多種疾病的防治，其多價、高效、廉價等優(yōu)點(diǎn)使其潛在的應(yīng)用價值不可估量。核酸疫苗可能對人類疾病的防治以及畜牧業(yè)的健康發(fā)展起到劃時代的作用。

第25頁/共92頁核酸疫苗研究

進(jìn)展第26頁/共92頁

一、概述第27頁/共92頁

核酸疫苗又稱基因疫苗或DNA疫苗，就是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)粒基因直接免疫機(jī)體，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。（一）概念第28頁/共92頁（二）DNA疫苗的構(gòu)成：

1.抗原表達(dá)基因

2.真核細(xì)胞啟動子（如CMVI.E啟動子）

3.PolyA終止序列（如來自SV40或BGH基因）

4.原核細(xì)胞選擇標(biāo)志（如青霉素抗性基因）

5.增強(qiáng)免疫原性的核苷酸序列（如非甲基化CpG二核苷)第29頁/共92頁第30頁/共92頁

二、DNA疫苗載體第31頁/共92頁1.裸DNA疫苗：質(zhì)粒、MIDGE載體2.病毒載體：天花病毒、腺病毒3.細(xì)菌載體：減毒活菌苗和繁殖缺陷細(xì)菌，如傷寒菌苗、腸炎沙門氏菌苗、志賀氏菌苗、單核細(xì)胞增生李斯特菌苗和小腸炎耶爾森氏菌苗4.微粒包裹載體：金顆粒(goldparticle)、脂質(zhì)體(liposomes)、聚丙交酯-聚乙交酯（PLGA）、藻酸鹽微粒(alginate)、和納米微粒(nanoparticles)第32頁/共92頁Variousmethodsofgenedelivery第33頁/共92頁

三、DNA疫苗與常規(guī)疫苗的比較第34頁/共92頁DNA疫苗減毒活疫苗滅活疫苗/蛋白亞單位抗原類型內(nèi)源性內(nèi)源性外源性APC加工過程蛋白酶體蛋白酶體溶酶體體液免疫應(yīng)答B(yǎng)細(xì)胞＋＋＋＋＋＋＋＋＋主要的IgG類別IgG2aIgG2aIgG1DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較第35頁/共92頁DNA疫苗減毒活疫苗滅活疫苗/蛋白亞單位細(xì)胞免疫應(yīng)答CD4＋＋＋＋Th＋/－Th1＋/－Th1CD8＋＋＋＋＋＋－抗原提呈Ⅰ/ⅡⅠ/ⅡⅡ免疫記憶體液免疫＋＋＋＋＋＋＋＋＋細(xì)胞免疫＋＋＋＋＋＋/－參與細(xì)胞因子IL-2,4，IFN-γ,TNF-βIL-2,IFN-γ,TNF-βIL-4，5，10,13DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較(續(xù)1）第36頁/共92頁DNA疫苗減毒活疫苗滅活疫苗/蛋白亞單位效應(yīng)機(jī)制CTLCTL中和反應(yīng)激活補(bǔ)體ADCC效應(yīng)制備易于構(gòu)建、生產(chǎn)＋＋＋＋

＋＋＋費(fèi)用＋＋＋

＋＋運(yùn)輸/存儲＋＋＋

＋＋＋＋安全性＋＋＋＋＋＋＋＋＋DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較(續(xù)2）第37頁/共92頁核酸疫苗與第一、二代疫苗相比具有如下優(yōu)勢：(1)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，其保護(hù)性免疫應(yīng)答對不同亞型的病原體具有交叉抵御作用；(2)無減毒、滅活疫苗可能引起的致病作用，具有可靠的安全性；(3)能表達(dá)經(jīng)修飾的天然抗原，具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性；(4)與亞單位疫苗共有的高產(chǎn)性；(5)可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個質(zhì)粒中，或?qū)⒉煌乖虻亩喾N重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用，制備多價核酸疫苗；(6)核酸疫苗既有預(yù)防作用，也有治療作用；(7)生產(chǎn)簡便，成本低廉，穩(wěn)定性好，貯運(yùn)方便。 第38頁/共92頁四、核酸疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)核酸疫苗誘導(dǎo)的全身免疫應(yīng)答反應(yīng)

關(guān)于核酸疫苗誘導(dǎo)全身免疫應(yīng)答反應(yīng)的機(jī)制目前了解的還不十分清楚，但其誘導(dǎo)過程可大致分為以下幾個階段：①疫苗的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)及表達(dá)；②抗原的加工和提呈；③淋巴細(xì)胞的活化；④免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子的作用。

第39頁/共92頁第40頁/共92頁第41頁/共92頁ImmunemechanismsinducedbyinoculationwithnakedDNA第42頁/共92頁Depictionofthemechanismsofgenerationofantigen-specifichumouralandcellularresponses.第43頁/共92頁五、核酸疫苗的構(gòu)建

1、將亞單位疫苗的編碼基因作為核酸疫苗的候選基因。2、多肽合成疫苗的核酸推導(dǎo)序列作用核酸疫苗的候選基因3、從病原體亞單位成分中篩選保護(hù)性抗原及編碼基因

3．1免疫篩選法3．2化學(xué)分解法

候選基因的篩選原則第44頁/共92頁LigatePCRproductintopTARGETTMVectorTransformTG1cellsSelecterecombinantclonesbyampicillinpstⅠ酶切鑒定挑取S基因正向插入的重組質(zhì)粒pTARGET-hanS測序重組質(zhì)粒pTARGET-hanS的構(gòu)建:引物1:CTACTATGGCAACTATGGAGGAA引物2:ACTAATTAGAGTTTCAAAGGCTCPCR正向:酶切成3674，1870，1470反向:可酶切成3674，2600,740第45頁/共92頁可酶切成5.6kb和1.3kb左右兩個片段EcoRⅠ酶切瓊脂糖凝膠電泳回收5.6kb左右的大片段對照空載體pTARGET的構(gòu)建：用連接酶連接成為閉環(huán)pTARGET空載體,作為對照載體備用。第46頁/共92頁培養(yǎng)Vero-E6細(xì)胞MEM培養(yǎng)基(10%FCS)37℃，5%CO2細(xì)胞長至對數(shù)生長期電穿孔轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后72h，收獲細(xì)胞檢測核蛋白的瞬時表達(dá),熒光顯微鏡下觀察并拍照。間接免疫熒光法重組質(zhì)粒pTARGET-hanS體外瞬間表達(dá):第47頁/共92頁核蛋白的瞬時表達(dá)結(jié)果第48頁/共92頁第49頁/共92頁作為DNA免疫的注射樣品。質(zhì)粒的大量制備及純化:按分子克隆手冊所述方法提純質(zhì)粒pcDNA3.1+和pcDNA3.1+S用滅菌的PBS溶解調(diào)整濃度至1.0mg/ml用分光光度計(jì)測定A260/A280比值以確定核酸樣品的純度，A260確定樣品的濃度第50頁/共92頁實(shí)驗(yàn)動物的DNA免疫6～8W齡的BABC/c小鼠空白質(zhì)粒pcDNA3.1+重組質(zhì)粒pcDNA3.1+S免疫前先用鹽酸布比卡因注射液預(yù)處理3天后相同部位進(jìn)行DNA接種加強(qiáng)免疫一次，共免疫3次。間隔2周第51頁/共92頁細(xì)胞因子的動態(tài)變化常規(guī)方法分離脾細(xì)胞，濃度1×10724孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入脾細(xì)胞懸液0.5ml，NP10l(同時設(shè)空白對照孔，ConA刺激孔)均設(shè)3個復(fù)孔37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48小時后收集脾細(xì)胞上清液，貯于-70℃，統(tǒng)一用ELISAkits檢測IL-4和IFN-分別于免疫后5d,10d,17d,35d,42d每組處死3只小鼠第52頁/共92頁淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng):脾細(xì)胞取自初次免疫后42d的免疫鼠以重組的核蛋白刺激免疫小鼠的脾細(xì)胞陰性對照孔和陽性對照孔(ConA)用MTT法檢測脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)，計(jì)算刺激指數(shù)（SI）常規(guī)方法分離脾細(xì)胞,濃度調(diào)整至2×106第53頁/共92頁免疫鼠血清的抗NP抗體的測定:免疫前和免疫后5d,10d,17d,35d,42d經(jīng)尾靜脈采血N=6/group以被檢標(biāo)本復(fù)孔（3孔）OD值與免疫前血清（陰性對照）的比值≥2.1者為陽性。重組的NP作為包被物，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗ELISA法檢測血清的抗NP抗體第54頁/共92頁血清抗NP抗體滴度的測定:將初次免疫后42天的免疫鼠眼球取血N=6/group留置血清，以10倍稀釋為起點(diǎn),再做系列稀釋ELISA法檢測血清抗體滴度第55頁/共92頁六、核酸疫苗的優(yōu)化1、免疫效果的優(yōu)化選擇高效表達(dá)載體添加DNA免疫激活序列2、免疫途徑的優(yōu)化

肌肉注射（im）基因槍導(dǎo)入皮內(nèi)(id)和皮下(sc)注射黏膜表面接種第56頁/共92頁EffectsofCpGmotifsonvariouscells第57頁/共92頁GenerationofImmunityafterInoculationofDNAPlasmidwithGpGMotifs第58頁/共92頁2、免疫途徑的優(yōu)化

第59頁/共92頁3、基因佐劑的應(yīng)用細(xì)胞因子類共刺激分子分子佐劑聯(lián)合

4、抗原蛋白的泛素化表達(dá)IL-12、IL-15、IL-18及IFN-γ以增強(qiáng)Th1型細(xì)胞應(yīng)答為主。

IL-4加強(qiáng)體液免疫IL-2能同時加強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫

集落刺激因子5、與基因重組疫苗聯(lián)合應(yīng)用第60頁/共92頁

細(xì)胞因子產(chǎn)生的動態(tài)變化第61頁/共92頁細(xì)胞因子產(chǎn)生的動態(tài)變化第62頁/共92頁免疫鼠脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)第63頁/共92頁血清特異性抗體的檢測結(jié)果第64頁/共92頁血清特異性抗體的檢測結(jié)果第65頁/共92頁第66頁/共92頁免疫鼠脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)第67頁/共92頁免疫鼠脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)第68頁/共92頁血清的抗NP抗體的測定結(jié)果第69頁/共92頁血清的抗NP抗體的測定結(jié)果第70頁/共92頁七、核酸疫苗的安全性問題

①局部反應(yīng)原性和全身毒性研究，即考慮DNA疫苗是否有免疫毒性作用，機(jī)體是否對疫苗編碼的抗原產(chǎn)生耐受性，或是否導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)，還應(yīng)對疫苗中污染的細(xì)菌蛋白是否誘發(fā)抗體產(chǎn)生進(jìn)行評估；②遺傳性作用，即質(zhì)粒DNA是否與宿主基因組的整合問題；③生殖毒性研究，可采用PCR方法對經(jīng)質(zhì)粒DNA疫苗免疫的雄性或雌性動物的性腺DNA提取物進(jìn)行檢測④致腫瘤性研究，如果質(zhì)粒DNA疫苗構(gòu)建具有與人的基因組同源的DNA序列，或其載體含有已知的潛在致癌基因序列時，需展開這方面的研究。第71頁/共92頁1、有關(guān)基因整合的研究

一個最重要的理論危機(jī)是質(zhì)粒DNA與宿主基因組整合的問題，因?yàn)楫?dāng)外源DNA與基因組整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染色體斷裂，或染色體重排而致染色體不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形成。

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尚無證據(jù)證明以自身表達(dá)質(zhì)粒的形式存在于染色體外的外源DNA能整合入宿主染色體中。其整合發(fā)生率較自然整合發(fā)生率低3個數(shù)量級，另鮭魚精DNA已經(jīng)以一種非處方藥形式經(jīng)口服或注射等多種方式使用了數(shù)十年，卻未見任何明顯的副作用。

一些事實(shí)已清楚地證明脾內(nèi)或口服裸DNA可能導(dǎo)致整合第73頁/共92頁2、關(guān)于免疫耐受的研究外源性抗原的持續(xù)表達(dá)可能產(chǎn)生不良后果：耐受性、自動免疫、過敏反應(yīng)、超免反應(yīng)等。持續(xù)低表達(dá)---可被抗體中和清除，無足夠的免疫應(yīng)答。持續(xù)高表達(dá)---超免反應(yīng)發(fā)生—免疫抑制

—其它病原感染。第74頁/共92頁

免疫2天的小鼠產(chǎn)生耐受免疫出生24小時內(nèi)的小鼠，與在成年小鼠中觀察到的沒有區(qū)別。

HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行DNA免疫，使已經(jīng)建立的對HBsAg的特異性免疫耐受狀態(tài)被打破，使小鼠產(chǎn)生抗HBsAg的特異性抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：結(jié)論：免疫耐受與抗原類型、濃度、給藥方式及宿主種屬、宿主年齡等因素有關(guān)。第75頁/共92頁3、關(guān)于自身免疫性疾病的研究

潛在性誘導(dǎo)抗質(zhì)粒DNA的免疫反應(yīng)是另一個必須關(guān)注的安全性問題。研究表明：用細(xì)菌DNA與mBAS及CFA形成的復(fù)合體免疫小鼠，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生與哺乳動物dsDNA發(fā)生反應(yīng)的IgG自身抗體。用各種構(gòu)建的質(zhì)粒載體進(jìn)行的質(zhì)粒DNA的免疫并未發(fā)現(xiàn)抗DNA抗體的產(chǎn)生。

DNA疫苗接種有自身免疫傾向的小鼠，重復(fù)給藥并沒有啟動或加重具有狼瘡傾向個體的疾病發(fā)生及發(fā)展過程。

第76頁/共92頁4、其它不良反應(yīng)進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明，未觀察到不可接受的不良反應(yīng)。第77頁/共92頁

八、DNA疫苗的應(yīng)用第78頁/共92頁

（一）感染性疾?。ǘ┠[瘤（三）自身免疫病與變態(tài)反應(yīng)第79頁/共92頁表病毒的DNA疫苗病毒抗原免疫途徑動物模型流感病毒HIV-1，2SIVFIVHTLV-1HBVHCVHEV狂犬病毒NP，HAenv混合，env，gag混合，envenv，rexHBsAg，envC，E2ORF3GP肌注，基因槍，皮下，靜注，in.肌注，基因槍，靜注，鼻內(nèi)，陰道內(nèi)肌注，基因槍，靜注肌注肌注肌注，皮下肌注肌注，基因槍，皮下小鼠、雞、豬、雪貂小鼠、恒河猴、猿猴、人恒河猴大鼠兔小鼠、猿猴小鼠小鼠小鼠、猴第80頁/共92頁病毒抗原免疫途徑動物模型偽狂犬病毒登革熱病毒麻疹病毒腦心肌炎LCMV輪狀病毒猿猴病毒40牛皰疹病毒柯薩奇病毒埃博拉病毒HSV-1，2細(xì)小病毒CRPVRSVIE180,gD,gCpreM＋envHA,NPVP1NPVP6,VP4,VP7T-AggDVP1，混合NP,GPgB,ICP27，gD2VP1L1F肌注，基因槍基因槍肌注肌注肌注，皮下，基因槍，口服肌注肌注，皮下肌注基因槍肌注，眼內(nèi)肌注肌注肌注，皮內(nèi)小鼠，豬小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠牛小鼠小鼠，豚鼠小鼠，豚鼠狗兔小鼠表病毒的DNA疫苗（續(xù)）第81頁/共92頁表細(xì)菌的DNA疫苗細(xì)菌抗原接種途徑動物模型結(jié)核分枝桿菌伯氏疏螺旋體破傷風(fēng)桿菌肺炎支原體沙眼衣原體傷寒沙門菌Hsp65，Ag85A,B,C19kDa.AhpCOspA破傷風(fēng)毒素ELIMOMP，CTPOmpC肌注肌注,皮下肌注肌注小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠第82頁/共92頁表寄生蟲的DNA疫苗寄生蟲抗原接種途徑