微生物培養(yǎng)技術(shù)演示文稿當(dāng)前1頁，總共50頁。微生物非細(xì)胞生物：病毒原核生物：細(xì)菌、放線菌、支原體、立克次氏體真核生物：真菌（酵母菌、霉菌）當(dāng)前2頁，總共50頁。菌落1、概念：

單個(gè)或少數(shù)微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)、繁殖到一定程度，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。2、菌落是鑒定微生物的重要依據(jù)：不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落一般具有穩(wěn)定的特征，如菌落的大小、形狀、邊緣特征、隆起程度、顏色等。當(dāng)前3頁，總共50頁。細(xì)菌菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異當(dāng)前4頁，總共50頁。如圖是酵母菌電子顯微鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)真菌：酵母菌和霉菌青霉當(dāng)前5頁，總共50頁。一、微生物的分離和純培養(yǎng)（3項(xiàng)技術(shù)1個(gè)案例）（一）培養(yǎng)基配制技術(shù)（二）無菌技術(shù)（三）接種技術(shù)

案例：大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)

當(dāng)前6頁，總共50頁。（一）無菌技術(shù)1、概念：無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒；②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌；④實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行——酒精燈的火焰旁的局部高溫使微生物難以生存當(dāng)前7頁，總共50頁。2、消毒（1）定義：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）當(dāng)前8頁，總共50頁。A、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min，日常生活常用B、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min，適用于不耐高溫的液體，如牛奶。C、化學(xué)藥劑消毒法:用酒精進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源D、射線消毒法，如紫外線（2）消毒的方法：當(dāng)前9頁，總共50頁。（1）定義：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。2、滅菌當(dāng)前10頁，總共50頁。（2）滅菌的方法：A、灼燒滅菌方法：直接在酒精燈火焰的充分燃燒層(溫度最高)灼燒(迅速?gòu)氐?適用范圍：接種環(huán)、接種針、金屬用具(接種工具)；試管口或瓶口(在接種過程中易被污染的部位)當(dāng)前11頁，總共50頁。C、濕熱滅菌方法：高壓蒸汽滅菌P8適用于培養(yǎng)基的滅菌B、干熱滅菌：方法：干熱滅菌箱,160-170℃下加熱1-2h。適用范圍：吸管、培養(yǎng)皿(玻璃器皿)、金屬用具(能耐高溫的、需保持干燥的物品)當(dāng)前12頁，總共50頁。1、培養(yǎng)基定義：（課本第9頁）2、營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成：環(huán)境條件：pH、氧氣、二氧化碳、滲透壓等

（二）培養(yǎng)基配制技術(shù)基本營(yíng)養(yǎng)成分：水、無機(jī)鹽、碳源、氮源等特殊營(yíng)養(yǎng)成分：維生素、生長(zhǎng)因子等特殊的、能滿足微生物不同需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)前13頁，總共50頁。固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等半固體培養(yǎng)基可觀察微生物的運(yùn)動(dòng)液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。3.培養(yǎng)基的分類當(dāng)前14頁，總共50頁。固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基（課本第9頁）斜面培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基中需加入凝固劑，如瓊脂當(dāng)前15頁，總共50頁。半固體培養(yǎng)基無運(yùn)動(dòng)有運(yùn)動(dòng)半固體培養(yǎng)基中也需要加入凝固劑瓊脂，但加入量少于固體培養(yǎng)基。當(dāng)前16頁，總共50頁。液體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)均勻混濁生長(zhǎng)沉淀生長(zhǎng)當(dāng)前17頁，總共50頁。選擇培養(yǎng)基（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:抑制細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)，分離酵母菌、霉菌等真菌。

不加氮源的無氮培養(yǎng)基:分離固氮菌定義（課本第18頁）舉例：加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌當(dāng)前18頁，總共50頁。鑒別培養(yǎng)基

根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物。

例如：在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍(lán)，可以用來鑒別大腸桿菌。如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈藍(lán)紫色，并帶有金屬光澤。

(課本15頁)當(dāng)前19頁，總共50頁。

用化學(xué)成分已知的化學(xué)物質(zhì)配成的，因成分明確，常用于分類、鑒定等合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。合成培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基：（3）按成分：合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基(P9用化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)配成的，如血清、組織提取液等當(dāng)前20頁，總共50頁。稱量：準(zhǔn)確地稱取各種成分。牛肉膏比較黏稠，可以用玻棒挑取，放在稱量紙上稱量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，稱量時(shí)動(dòng)作要迅速，稱后要及時(shí)蓋上瓶蓋。4.培養(yǎng)基的配制步驟（第10頁）（1）.計(jì)算:根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的比例，計(jì)算配制100mL的培養(yǎng)基時(shí)，各種成分的用量。（以牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基為例）當(dāng)前21頁，總共50頁。（2）.溶化：①加水加熱熔化牛肉膏

將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯加入少量的水，加熱。當(dāng)牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻棒取出稱量紙。②加入蛋白胨和氯化鈉，用玻棒攪拌，使其溶解；③加入瓊脂；④用蒸餾水定容到100mL。整個(gè)過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。（3）.調(diào)節(jié)pH（4）.分裝、包扎（5）.滅菌（6）擱置斜面P11或倒平板P13當(dāng)前22頁，總共50頁。擱置斜面------斜面培養(yǎng)基(P11)待試管冷卻至50℃左右，將試管口部枕在高約1cm的木條或其他合適高度的物體上，使其自然冷卻，斜面長(zhǎng)度不超過試管總長(zhǎng)的1/2.當(dāng)前23頁，總共50頁。待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。倒平板------平板培養(yǎng)基(P13)①在火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；②右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰；③左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋。④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。平板冷凝后倒置的原因：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，①既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，②又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

當(dāng)前24頁，總共50頁。倒平板技術(shù)當(dāng)前25頁，總共50頁。（三）接種技術(shù)1.定義:在無菌條件下將微生物接入培養(yǎng)基的操作過程。3.平板培養(yǎng)基上接種方法平板劃線法、稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法2.斜面培養(yǎng)基上接種方法目的：菌種轉(zhuǎn)移、擴(kuò)大培養(yǎng)和保存純凈菌種目的：用來培養(yǎng)、分離細(xì)菌等微生物當(dāng)前26頁，總共50頁。斜面培養(yǎng)基上接種方法準(zhǔn)備接種接種環(huán)滅菌挑取菌種劃線接種培養(yǎng)、觀察點(diǎn)燃酒精燈、取斜面培養(yǎng)基、取菌種試管灼燒多次，迅速?gòu)氐椎販缇嚬芸谕ㄟ^火焰2-3次，殺滅試管口微生物試管口滅菌接種環(huán)冷卻后挑取菌種不要將培養(yǎng)基的表面劃破37℃下培養(yǎng)24h當(dāng)前27頁，總共50頁。平板培養(yǎng)基上接種方法1、平板劃線法將混在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞。準(zhǔn)備接種接種環(huán)滅菌劃線接種培養(yǎng)、觀察試管口滅菌挑取菌種當(dāng)前28頁，總共50頁。平板劃線操作當(dāng)前29頁，總共50頁。⑵平板劃線要點(diǎn)①在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)的原因——A.操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；B.每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。②在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍需灼燒接種環(huán)的原因——?jiǎng)澗€結(jié)束后灼燒接種環(huán)能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。③在灼燒接種環(huán)之后，要等其冷卻后再進(jìn)行劃線的原因——以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。④在做第二次以及其后的劃線操作時(shí)，總是從上一次劃線的末端開始劃線的原因——?jiǎng)澗€后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。當(dāng)前30頁，總共50頁。2、稀釋涂布平板法

將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落,即為純培養(yǎng)物。當(dāng)前31頁，總共50頁。系列稀釋操作當(dāng)前32頁，總共50頁。70%的酒精涂布平板操作步驟取菌液滴加到培養(yǎng)基表面當(dāng)前33頁，總共50頁。1、微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序（1）器具的滅菌（2）培養(yǎng)基的配制（3）培養(yǎng)基的滅菌（4）倒平板（5）微生物接種（6）恒溫箱中培養(yǎng)（7）菌種的保存（四）案例：大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)當(dāng)前34頁，總共50頁。（1）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2、大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)步驟當(dāng)前35頁，總共50頁。（2)配制培養(yǎng)基：計(jì)算稱量；熔化；調(diào)PH；分裝；滅菌；倒平板（3）接種：平板劃線法；稀釋涂布平板法。（4）培養(yǎng)：倒置，37℃恒溫箱，12和24h。（5）純化培養(yǎng)：倒置，37℃恒溫箱，24h。（6）菌種保藏：臨時(shí)、長(zhǎng)期保存法。當(dāng)前36頁，總共50頁。菌種的保存

1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保存。2、長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法-20℃冷凍箱保存當(dāng)前37頁，總共50頁。二、測(cè)定微生物的數(shù)量當(dāng)前38頁，總共50頁。（一）測(cè)定微生物數(shù)量的方法1.直接計(jì)數(shù)法最常用：顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（方法、優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)、適用條件）一、基礎(chǔ)知識(shí)當(dāng)前39頁，總共50頁。2、間接計(jì)數(shù)法：最常用的是稀釋平板計(jì)數(shù)法稀釋平板法稀釋涂布平板法稀釋混合平板法當(dāng)前40頁，總共50頁。1、土壤取樣、制備土壤懸液土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)2、配制選擇性培養(yǎng)基：采用唯一氮源為尿素的培養(yǎng)基尿素瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基二、實(shí)踐案例當(dāng)前41頁，總共50頁。當(dāng)前42頁，總共50頁。3、樣品稀釋細(xì)菌：一般選用104、105、106倍的稀釋液進(jìn)行培養(yǎng)放線菌：一般選用103、104、105倍的稀釋液真菌：一般選用102、103、104倍的稀釋液4、取樣及平板接種（涂布平板或混合平板）當(dāng)前43頁，總共50頁。

在以尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，指示劑變紅，就可以準(zhǔn)確的鑒定該種細(xì)菌能夠分解尿素。5、培養(yǎng)與觀察：細(xì)菌：30～370C的溫度下培養(yǎng)1～2d；放線菌：25～280C的溫度下培養(yǎng)5～7d；霉菌：25～280C的溫度下培養(yǎng)3～4d。當(dāng)前44頁，總共50頁。當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。每克樣品中的菌數(shù)＝(C/V)×MC:代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)V:代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積M：稀釋的倍數(shù)6、細(xì)菌計(jì)數(shù)當(dāng)前45頁，總共50頁。菌落數(shù)的選擇：一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。當(dāng)只有一個(gè)稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落乘以稀釋的倍數(shù)；若有兩個(gè)稀釋倍的平均菌落數(shù)均在30～300之