本文格式為Word版，下載可任意編輯——細胞增殖和凋亡在組織中檢測細胞增殖、分化和凋亡的方法一、檢測細胞增殖的方法（1）直接方法：通過直接測定舉行分裂的細胞來評價細胞的增殖才能1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質。用同位素3H標記TdR即3H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DAN合成代謝過程，通過測定細胞的放射性強度，可以反映細胞DAN的代謝及細胞增殖處境。但是具有放射性。

2、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細胞膜的熒光染料，具有與細胞特異性結合的琥珀酰亞胺脂基團和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團，使CFSE成為一種良好的細胞標記物。CFSE進入細胞后可以不成逆地與細胞內的氨基結合偶聯(lián)到細胞蛋白質上。當細胞分裂時，CFsE標記熒光可平均調配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半。這樣，在一個增殖的細胞群中，各連續(xù)代細胞的熒光強度呈對遞減，利用流式細胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對其舉行分析。

3、Brdu檢測法Brdu中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細胞培養(yǎng)參與，而后利用抗Brdu單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物，雙重染色，可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義4、增殖標志檢測有些抗原只存在于增殖細胞中，而非增值細胞缺乏這些抗原，您也可以通過特異性的單抗來對細胞增殖舉行檢測。例如，在人體細胞中，Ki-67抗體識別同名蛋白，在細胞周期S期、G2期和M期表達，而在G0期和G1期(非增殖期)不表達。用針對Ki-67蛋白的單抗就可以檢測細胞的增值處境。由于需要組織切片，這種方法無法舉行高通量分析。不過這一方法頗受癌癥研究者們的青睞，由于它能夠用來檢測體內腫瘤細胞的增殖。其他普遍使用的細胞增殖或細胞周期調控標志還包括，增殖細胞核抗原PCNA、拓撲異構酶IIB和磷酸化組蛋白H3。

（2）間接方法：通過檢測樣品中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖才能1、MTT檢測法MTT檢測法主要反映細胞的能量代謝，是檢測細胞增殖活力的一種簡便切實的方法，其原理是在活細胞生長和增殖過程中，線粒體內的脫氫酶可將黃色的MTT分解成蘭紫色的甲（Formazan），生成的甲量的多少與細胞的數(shù)量和細胞的活力成正比。

2、ATP檢測細胞內的ATP含量受到了嚴作風控，檢測ATP也可以得到細胞增殖的信息。死亡細胞或即將死亡的細胞幾乎不含ATP，在細胞溶解物或提取物中測得的ATP濃度與細胞數(shù)之間存在嚴格的線性關系。利用熒光素酶luciferase及其底物熒光素luciferin的ATP檢測以生物發(fā)光為根基，能夠為您供給分外靈敏的結果。假設有ATP存在熒光素酶就會發(fā)光，而且其發(fā)光強度與ATP濃度成正比，用能讀取發(fā)光信號的光度計和酶標儀都可以便當?shù)呐e行檢測。這種方法分外適用于高通量細胞增殖檢測和篩選。

二、檢測細胞分化的方法1、流式鑒定細胞外觀標志，以判斷細胞是否分化2、查看細胞形態(tài)，與已分化的細胞舉行比較3、分化誘導評估其分化才能三、檢測細胞凋亡的方法（1）形態(tài)學檢測1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡染色細胞：凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。

常用染色方法：①蘇木精=伊紅染色②甲基綠-派諾寧染色：與壞死相比，細胞凋亡的細胞內常有RNA表達的鞏固，用甲基綠特異性染色DNA，派諾寧對RNA親和力強，若胞質呈派諾寧陽性為凋亡，陰性為壞死。（前提是已經(jīng)判斷細胞處于死亡形態(tài)，通過形態(tài)學判斷）③吖啶橙染色法：。它與細胞中DNA和RNA結合量存在區(qū)別，可發(fā)出不同顏色的熒光，與DNA結合量少發(fā)綠色熒光，與RNA結合量多發(fā)桔黃色或桔紅色熒光。該染料具有膜通透性，能透過細胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在熒光顯微鏡下查看，吖啶橙可透過正常細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色平勻熒光；

在凋亡細胞中，因染色質固縮或斷裂為大小不等的片斷，形成凋亡小體。吖啶橙使其染上致密濃染的黃綠色熒光，或黃綠色碎片顆粒；

而壞死細胞黃熒光減弱甚至消散。吖啶橙染液有毒，操作時要戴手套，需避光。

（凋亡小體）2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質的形態(tài)學變更為指標來評判細胞凋亡的進展處境。常用的DNA特異性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPI。三種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時放射亮堂的藍色熒光。

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5~1mg/ml。

結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態(tài)學變更分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased)，片面染色質展現(xiàn)濃縮狀態(tài);Ⅱa期細胞核的染色質高度凝結、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體（如圖）。

3、透射電子顯微鏡查看凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，展現(xiàn)大量稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡布局(如圖)；

Ⅱa期細胞核的染色質高度凝結、邊緣化；

細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

（2）檢測凋亡標記物質1、磷脂酰絲氨酸外翻分析(AnnexinV法)磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的外觀，暴露在細胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+憑借性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V舉行熒光素(FITC、PE)或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。

2、線粒體膜勢能的檢測線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)回響過程中最早發(fā)生的事情，它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質濃縮、DNA斷裂)展現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，那么細胞凋亡不成逆轉。

線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine123、3，3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide[JC-1]、Tetramethylrhodaminemethylester(TMRM)等可結合到線粒體基質，其熒光的鞏固或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。

將正常培養(yǎng)的細胞和誘導凋亡的細胞參與使用終濃度為Rhodamine123(1mM)或終濃度為DiOC6(25nM)，JC-1(1mM)，TMRM(100nM)，37°C平衡30min，流式細胞計檢測細胞的熒光強度。

3、TUNEL法細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3-末端，從而可舉行凋亡細胞的檢測，這類方法（稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體舉行原位染色，能切實地回響細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分開的細胞的細胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

（3）DNA片斷化檢測1、大分子染色體DNA片段的測定細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。全體超過確定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度一致。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達成辨識力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為“爬行“。因此，細胞凋亡早期產(chǎn)生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普遍的瓊脂糖凝膠電泳來分開。通常采用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向變更后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能持續(xù)向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。

2、DNALadder測定細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發(fā)生濃縮,染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長的DNA大片段,或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)。細胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分開提純DNA，舉行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可查看到典型的DNAladder。假設細胞量很少，還可在分開提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)使DNA標記，然后舉行電泳和放射自顯影，查看凋亡細胞中DNAladder的形成。

3、凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析（4）Caspase-3活性的檢測Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著分外重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的大量途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

1、westernblot2.熒光分光光度計分析活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點，設計出熒光物質偶聯(lián)的短肽Ac-D