-.z.A、EVs外部特征〔大小和外表蛋白〕檢測方法Dynamiclightscattering(DLS)：動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)原理：通過測量樣品散射光強(qiáng)度起伏的變化來得到樣品顆粒大小信息的一種技術(shù)。"動(dòng)態(tài)〞是因?yàn)闃悠分械姆肿硬煌５刈霾祭蔬\(yùn)動(dòng)，正是這種運(yùn)動(dòng)使散射光產(chǎn)生多普勒頻移。步驟：首先根據(jù)散射光的變化，機(jī)多普勒頻移測得溶液中分子的擴(kuò)散系數(shù)D，再由D=KT/6πnr可求出分子的流體動(dòng)力學(xué)半徑r(K為玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對溫度，n為溶液的粘滯系數(shù))關(guān)鍵參數(shù)：濃度〔不能太濃，易發(fā)生二次散射，導(dǎo)致檢測信號減弱〕/光到樣品以及散射光到檢測器的距離。測量粒徑范圍：1nm-6um優(yōu)點(diǎn)：樣品制備簡單，不需要特殊處理，可以反映樣品分子真實(shí)狀態(tài)；速度快，樣品可回收；靈敏度高。缺點(diǎn)：分析粒徑差不多的樣品比擬準(zhǔn)確。對于樣品顆粒大小差異大的，并不是很準(zhǔn)確。如果樣品中有比擬多大顆粒樣品，小顆粒樣品的測量結(jié)果會(huì)受影響；不能檢測熒光信息。Nanoparticletrackinganalysis(NTA)：納米顆粒跟蹤技術(shù)原理：與DSL類似。利用激光光源照射納米顆粒懸浮液，利用全黑背景則功能強(qiáng)信號，可以清晰觀察到帶有散射光的顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)?？梢赃M(jìn)展計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)、濃度檢測。具有熒光模式。測量粒徑范圍：10nm-2000nm〔有文獻(xiàn)報(bào)道能檢測EV的最小粒徑為70nm〕樣品濃度范圍：0.5E+6-1E+10/cm3,相比于DLS更低。推薦分析1000-10000個(gè)。缺點(diǎn)：1、熒光模式和散射模式是分開的。2、計(jì)術(shù)限制，檢測的是二維平面信息，而Z軸方向是檢測不到。Flowcytometry:流式細(xì)胞儀粒徑檢測極限：300-500nmRamanMicrospectroscopy〔RM〕：拉曼光譜原理：基于非彈性散射〔改變方向和頻率〕。優(yōu)點(diǎn)：可用于EVs亞型的鑒定缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴，技術(shù)要求高；樣品制備和采集時(shí)間長，10-100個(gè)/小時(shí)；信號弱，非彈性散射信號強(qiáng)度小于彈性散射信號的1/10000；測量重復(fù)性差；EVs置于高劑量的光線下，會(huì)產(chǎn)生光反響，且是不可逆的。AtomicForceMicroscopy(AFM):原子力顯微鏡原理：利用微小探針與待測物之間交互作用力，來呈現(xiàn)待測物的外表的物理特性。將一個(gè)對力極為敏感的微懸臂的一端固定，另一端固定針尖。當(dāng)針尖再樣品外表掃描時(shí)，因針尖尖端原子與樣品外表原子存在的范德華力，使微懸臂產(chǎn)生微小彎曲。檢測懸臂彎曲所造成的微笑位移量，得到樣品外表信息。缺點(diǎn)：EV的固定可能會(huì)影響其拓?fù)錁?gòu)造，結(jié)果會(huì)受到樣品制備模式的影響；檢測結(jié)果受微懸臂探頭影響非常大，針尖的卷積效應(yīng)可能會(huì)使橫向結(jié)果的偏差很大；成像范圍太小，只要~10μm*10μm；檢測速度慢，測試一個(gè)樣品通常要1小時(shí)以上。ResistivePulseSensing(RPS)：電阻脈沖傳感原理：當(dāng)高電阻率的絕緣顆粒流經(jīng)檢測微孔時(shí)，會(huì)置換微孔中等體積的低電阻率電解質(zhì)溶液，使得檢測微孔電阻發(fā)生改變，并在檢測微孔兩端產(chǎn)生一個(gè)電流脈沖值或電壓脈沖值。脈沖信號得個(gè)數(shù)反映流經(jīng)檢測微孔得顆粒數(shù)目，脈沖信號的幅值大小反映顆粒的尺寸大小。另外，當(dāng)顆粒在電解質(zhì)溶液中均勻分布且溶液流經(jīng)檢測微孔的速度一定時(shí)，可以用于濃度檢測。測量粒徑范圍：100nm-100um，測量懸浮液顆粒絕對大小和濃度。缺點(diǎn)：樣品形態(tài)，孔徑大小和樣品的導(dǎo)電性均會(huì)影響結(jié)果。不能檢測生理鹽水狀態(tài)下的樣品，因此限制生物樣品的使用。中間孔徑小于1um可調(diào)電阻脈沖傳感〔TRPS〕:A、由于EVs的粒徑異質(zhì)性很大，較大的孔徑可能會(huì)堵塞微孔。B、標(biāo)準(zhǔn)品的大小需要與樣品尺寸一樣，這對于未知樣品檢測不夠靈活。FieldFlowFractionation(FFF)：場流別離技術(shù)原理：用于大分子、膠體和微粒的別離。在相距很近的上下平板間構(gòu)成扁平帶狀流道，載流液流于其中。載流為層流，其流型為拋物線型，中心線上速度最大。側(cè)向場從側(cè)面垂直與流動(dòng)方向施加，側(cè)向場導(dǎo)致不同成分處在距下壁不同位置上，從而有不同移動(dòng)速度，在此前提下進(jìn)展別離。通常矩形流道寬高比一般大于100：1。可分為電場場流別離、熱場場流別離、沉降場流別離和流場場流別離。Cryo-TEM:冷凍電鏡冷凍電鏡技術(shù)結(jié)合受體特異性金標(biāo)記可用于EVs表型描述。冷凍電鏡不需要對樣品進(jìn)展固定和脫水處理，因此EV的形態(tài)是真實(shí)狀態(tài)下的。9、ScanningElectronMicroscopy掃描電子顯微鏡：原理：用極狹窄的電子束去掃描樣品，通過電子束與樣品的原子相互作用產(chǎn)生各種效應(yīng)，其中主要是樣品的二次電子發(fā)射。樣品需要固定和脫水，因此形狀呈現(xiàn)一種扭曲的杯狀。SingleEVAnalysis(SEA)Method光鏡單個(gè)EV檢測方法：E*oCounter:細(xì)胞外囊泡檢測系統(tǒng)類似ELISA方法，用抗體捕獲外泌體.。但是CD9CD63CD81在外泌體的表達(dá)量均達(dá)不到100%，因此會(huì)損失很多信息。納米流式檢測儀〔FlowNanoAnalyzer)原理：和傳統(tǒng)流式有點(diǎn)類似，均是靠激光激發(fā)顆粒產(chǎn)生光信號。不同的是，納米流式利用的是瑞利散射原理，主要檢測200nm以下的顆粒。優(yōu)點(diǎn)：散射檢測范圍7~1000nm〔EV檢測下限為40nm)，可以同時(shí)檢測樣品的粒徑、濃度、外表蛋白信息以及內(nèi)容物。缺點(diǎn)：熒光標(biāo)記的樣品需要超速離心去除游離染料。B、EVs內(nèi)容物檢測技術(shù)傳統(tǒng)核酸的提取與檢測RNA提?。悍勇确鲁樘幔禾崛r(shí)間長，步驟繁瑣；純度高；商品化柱提法檢測：PCR;RT-PCR;電泳；ne*tgenerationsequencing(NGS)。DropletPCR原理：在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對樣品進(jìn)展微滴化處理，即將含有核酸分子的反響體系分成數(shù)萬個(gè)納升級的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待測核酸靶分子，或者含一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，對每個(gè)微滴的熒光信號進(jìn)展逐一分析，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0。根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子起始拷貝數(shù)或濃度。技術(shù)優(yōu)勢：靈敏度高達(dá)0.001%；能克制核酸降解的不利影響；所需樣本量少；可統(tǒng)計(jì)突變率；缺點(diǎn)：模板添加量要求較高〔濃度過高導(dǎo)致全部孔都有信號，濃度過低陽性信號孔過少，均不準(zhǔn)確〕；對引物特異性要求高。MicrofluidicsforOn-ChipE*tractionandDetection〔用于芯片內(nèi)提取和檢測的微流體〕樣品小于100ul；檢測時(shí)間小于3小時(shí)。Ion-E*changeNanodetector〔離子交換納米檢測器〕原理：通過交織換能器在交流電流作用下壓電晶體外表產(chǎn)生外表聲波(saw)，實(shí)現(xiàn)了電動(dòng)勢的裂解。C、EVs蛋白的檢測技術(shù)細(xì)胞外囊泡的蛋白主要來源于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，并不來自細(xì)胞器。特別關(guān)注跨膜蛋白和包漿蛋白。外泌體膜蛋白主要有四分子交聯(lián)體大家族〔CD9/CD63/CD81〕，在膜轉(zhuǎn)運(yùn)和生物合成成熟起作用。但是這些蛋白并不只是在外泌體中存在。微囊泡膜蛋白主要有整合蛋白、選擇蛋白和CD40配體。細(xì)胞外囊泡還包括特異的跨膜蛋白受體(皮生長受體〔EGFRs〕)和黏附蛋白〔上皮細(xì)胞黏附分子EpCAM〕細(xì)胞外囊泡囊內(nèi)蛋白：TSG101/ALI*/anne*ins/Rabs，在膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用；骨架蛋白〔肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、微管蛋白〕；分子伴侶HSPs；代謝酶GAPDH。WesternBlottingandELISA質(zhì)譜分析高通量肽譜分析，分析的關(guān)鍵是進(jìn)展肽別離〔SDS/二維相色譜/等電聚焦分餾〕優(yōu)點(diǎn)：高通量、定量和蛋白組學(xué)分析缺點(diǎn)：時(shí)間長〔天〕傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)+微球富集法缺點(diǎn)：不能進(jìn)展單一EV檢測；得到的結(jié)果是平均值。優(yōu)點(diǎn)：可進(jìn)展高通量檢測小顆粒流式細(xì)胞術(shù)〔100nm〕微型核磁共振原理：由于大多數(shù)生物實(shí)體缺乏鐵磁性背景，當(dāng)它們被納米磁珠〔MNPs〕靶向時(shí)，此時(shí)它們與原生的生物實(shí)體形成強(qiáng)烈比照。在基于核磁共振(NMR)的磁檢測中，將MNPs置于NMR磁場中，會(huì)產(chǎn)生局部磁場，改變周圍水分子的橫向弛豫速率，從而放大分析信號。檢測靈敏度是westernblot和ELISA的~103倍。Nano-plasmonicE*osome(nPLE*)Sensor〔納米等離子體外泌體傳感器〕原理：基于外表等離子體共振：1、根據(jù)法國物理學(xué)家菲涅爾所提出的光學(xué)定理：可知，當(dāng)光從光密介質(zhì)射入光疏介質(zhì)，入射角增大到*一角度，使折射角到達(dá)90°時(shí)，折射光將完全消失，而只剩下反射光，這種現(xiàn)象叫做全反射?！矆D1〕當(dāng)以波動(dòng)光學(xué)的角度來研究全反射時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)入射光到達(dá)界面時(shí)并不是直接產(chǎn)生反射光，而是先透過光疏介質(zhì)約一個(gè)波長的深度，再沿界面流動(dòng)約半個(gè)波長再返回光密介質(zhì)。則透過光疏介質(zhì)的波被稱為消逝波；2、等離子體通常指由密度相當(dāng)高的自由正、負(fù)電荷組成的氣體，其中正、負(fù)帶電粒子數(shù)目幾乎相等。把金屬外表的價(jià)電子看成是均勻正電荷背景下運(yùn)動(dòng)的電子氣體，這實(shí)際上也是一種等離子體。當(dāng)金屬受電磁干擾時(shí)，金屬內(nèi)部的電子密度分布會(huì)變得不均勻。因?yàn)閹靵隽Φ拇嬖?，?huì)將局部電子吸引到正電荷過剩的區(qū)域，被吸引的電子由于獲得動(dòng)量，故不會(huì)在引力與斥力的平衡位置停下而向前運(yùn)動(dòng)一段距離，之后電子間存在的斥力會(huì)迫使已經(jīng)聚集起來的電子再次離開該區(qū)域。由此會(huì)形成一種整個(gè)電子系統(tǒng)的集體震蕩，而庫侖力的存在使得這種集體震蕩反復(fù)進(jìn)展，進(jìn)而形成的震蕩稱等離子震蕩，并以波的形式表現(xiàn)，稱為等離子波。3、我們在前面提到光在棱鏡與金屬膜外表上發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí)，會(huì)形成消逝波進(jìn)入到光疏介質(zhì)中，而在介質(zhì)〔假設(shè)為金屬介質(zhì)〕中又存在一定的等離子波。當(dāng)兩波相遇時(shí)可能會(huì)發(fā)生共振。當(dāng)消逝波與外表等離子波發(fā)生共振時(shí)，檢測到的反射光強(qiáng)會(huì)大幅度地減弱。能量從光子轉(zhuǎn)移到外表等離子，入射光的大局部能量被外表等離子波吸收，使反射光的能量急劇減少。可以從左側(cè)的反射光強(qiáng)響應(yīng)曲線看到一個(gè)最小的尖峰，此時(shí)對應(yīng)的入射光波長為共振波長，對應(yīng)的入射角θ為SPR角。電子吸收光能量，從而使反射光強(qiáng)在一定角度時(shí)大大減弱，其中是反射光完全消失的角就是SPR角。SPR角隨金外表折射率變化而變化，而折射率的變化又與金外表結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。因此可以通過對生物反響過程中SPR角的動(dòng)態(tài)變化獲取生物分子之間相互作用的特異信號。外表等離子共振〔SPR〕優(yōu)點(diǎn)；檢測靈敏度是westernblot和ELISA的102~104倍；不同蛋白檢測更準(zhǔn)確；檢測時(shí)間小于30min.；可用于高通量檢測；7、IntegratedMagn