實驗一薄層板的制備、活度測定及應用一、 目的要求1.掌握薄層板的制備及薄層層析的操作方法掌握吸附劑活度測定的原理及方法應用薄層層析法檢測識中草藥化學成分二、 薄層板的制備硅膠（H）羧甲基纖維鈉（CMC-Na）薄層取羧甲基纖維素0.20g，溶于25ml水中，在水浴上加熱攪拌使完全溶解，倒入燒杯中，加薄層層析用硅膠（顆粒度10~40pm的6.02g）。攪拌均勻30min，用玻璃棒把其薄薄地涂到玻璃板的一面，盡量保持其平整。將未粘附硅膠糊的那一面水平放在一張清潔的紙上，讓其自然陰干，110°C下烘1h活化。冷后于干燥器內(nèi)備用。三、 硅膠活度的測定實驗步驟：本實驗選用兩種染料的薄層層析法進行測定。分別取0.01%二甲基黃溶液、蘇丹紅II的苯溶液各10pl點滴于硅膠H薄層上，再取兩種溶液各10pl點滴于同一個點于同一塊硅膠H薄層上。并與市面上售的標準硅膠H薄層做對比實驗。以苯為展開劑，展開至薄層板的上端線，取出，觀察。兩種染料應明顯分離，二甲基黃斑點在薄層的中間，蘇丹紅斑點應該爬得比二甲基黃要慢，則認為薄層板活性符合要求。實驗結(jié)果：3.討論與分析：從上圖可知，與標準硅膠H薄層比較，兩種染料在待測硅膠H薄層的Rf值幾乎相等，且現(xiàn)象符合薄層板活性要求，因此可判定待測薄層板活性符合要求。同一個點上不同的點二甲基黃溶液蘇丹紅II的苯溶液二甲基黃溶液蘇丹紅II的苯溶液樣品薄層板的Rf值0.880.720.850.70標準薄層板的Rf值0.800.650.790.65四、薄層層析的應用薄層層析法在天然藥物化學成分的研究中，主要應用于化學成分的預試、化學成分的鑒定及探索柱層分離的條件。用薄層層析進行中草藥化學成分檢識，可依據(jù)各類成分性質(zhì)及熟知的條件有針對性地進行。由于在薄層上展開后，可將一些雜質(zhì)分離，選擇性高，可使預試結(jié)果更為可靠，不僅可通過顯色獲知成分類型，而且可初步了解主要成分的數(shù)目及其極性大小。湖北貝母生物堿成分的TLC檢識吸附劑：硅膠CMC-Na薄層樣品：湖北貝母總生物堿氯仿溶液展開劑：C6H5-EtoAc-NHEt2（3：4：1）顯色劑：改良碘化鉍鉀噴霧實驗現(xiàn)象：這個實驗里我們實驗室的所有人都沒有做出現(xiàn)象出來討論與分析：分析可能的原因有以下幾個：（1）展開劑的配比不對，不能使樣品分離開來（2）顯色劑過期，在這實驗里起不了顯色的作用丹參色素的TLC檢識吸附劑：硅膠G-CMc-Na板樣品：丹參乙醚提取液展開劑：石油醚-醋酸乙酯（9：1）記錄TLC結(jié)果溶質(zhì)遷移距離cm流動項遷移距離cmRf樣品薄層板3.454.480.77標準薄層板3.354.470.75討論與分析：由于原來的展開劑組分是石油醚-醋酸乙酯（9：1），極性比例太小，爬板的現(xiàn)象不明顯，經(jīng)過嘗試，把石油醚-醋酸乙酯改為3:1,增大極性成分的比例，爬板的現(xiàn)象變得較為明顯，上圖為石油醚-醋酸乙酯比例為3:1的爬板現(xiàn)象。此時的展開劑配比才是最佳的配比。另外，自制的樣品板得到的Rf值與標準薄層板的Rf值進行對比，可以看出來是比較相近的，說明自制的薄層板的活性還是可以的。實驗二植物化學成份的鑒別方法一、生物堿的鑒別檢品溶液的制備：取粉碎的苦參樣品1.98g，加蒸餾水25ml，并滴加數(shù)滴鹽酸，使呈酸性。在60。。水浴上加熱15分鐘，過濾，濾液供作以下試驗。生物堿類成分的鑒別：生物堿類成分大部分與多種生物堿沉淀試劑在酸性溶液中產(chǎn)生沉淀反應。操作如下：（1） 取上備酸水浸液四份（每份1ml左右），分別滴加碘-碘化鉀、碘化汞鉀試劑、碘化鉍鉀試劑、硅鎢酸試劑。若四者均有或大多有沉淀反應，表明該樣品可能含有生物堿，再進行下項試驗，進一步識別。（2） 取上備其余酸水浸液，加Na2CO3溶液呈堿性，置分液漏斗中，加入乙醚約10ml振搖，靜置后分出醚層，再用乙醚3ml，如前萃取，合并醚液。將乙醚液置分液漏斗中，加酸水液10ml振搖，靜置分層，分出酸水液，再以酸水液5ml如前提取，合并酸水液，如此酸提液四份，分別滴加碘-碘化鉀、碘化汞鉀試劑、碘化鉍鉀試劑、硅鎢酸試劑，觀察能否產(chǎn)生沉淀。此酸水提液與以上四種試劑均（或大多）產(chǎn)生沉淀反應，即預示本樣品含有生物堿。（3） 備注：以上（1）、（2）沉淀反應結(jié)果：若（1）項試驗全呈負反應，則可確定樣品中不含生物堿，不必再進行（2）項試驗。實驗現(xiàn)象：滴加的沉淀劑碘-碘化鉀碘化汞鉀試劑碘化鉍鉀試劑硅鎢酸試劑酸水浸液棕色沉淀奶白色沉淀紅橙色沉淀灰白色沉淀酸水提取液澄清溶液變渾濁，有白色沉淀生成無明顯沉淀生成無明顯沉淀生成有灰白色沉淀生成討論與分析：從上述實驗現(xiàn)象中可得苦參中可能有生物堿的存在，如需確定是否有生物堿，還需進一步的實驗。二、昔類的鑒別（一）苷的一般鑒別反應檢品溶液的制備：中草藥水浸液：取白芷粉末2.03g，加蒸餾水20ml70。。水浴加熱10分鐘，過濾取濾液。中草藥醇浸液：取白芷粉末少許于試管，加乙醇10ml，在溫水浴加熱10分鐘，過濾取濾液。鑒別試驗：（1） a-萘酚試驗（Molish）反應取醇浸液1ml，加10%a-荼酚醇液1滴，搖勻，沿管壁緩慢加入濃H2SO410滴，不振搖，觀察兩液介面間是否出現(xiàn)紫紅色杯（若有微量濾紙纖維或中草藥粉末存在于溶液中，都能產(chǎn)生上述反應，故在過濾時應加以注意）。（2） 水解反應取水浸液3ml于試管中，加5%HCl1ml在沸水浴上加熱20分鐘，觀察是否有絮狀沉淀產(chǎn)生。（3） 堿性酒石酸銅（斐林試劑Fehling’stestsolir試驗取水浸液2ml，加入新配制的斐林試劑（甲+乙等量混合）1ml，在沸水浴上加熱數(shù)分鐘，如產(chǎn)生紅色的氧化亞銅沉淀，則行過濾，濾液中加10%HCl調(diào)成酸性，置水浴上加熱10分鐘。進行水解，如有絮狀沉淀則濾去。然后用10%NaOH中和，再加入斐林試劑1ml，仍置沸水浴上加熱5分鐘，觀察是否有黃色，磚紅或棕色沉淀產(chǎn)生？（此反應試多糖，苷類）從反應結(jié)果說明供試中草藥中是否含有苷？（此試驗法亦可采用同體積同濃度的中草藥浸液兩份，一份先經(jīng)酸水解過濾堿化后，另一份再同時進行如上的還原反應，對比生成的氧化亞銅量，兩份是否有差異來判斷，具體方法見系統(tǒng)預試實驗）。3.實驗現(xiàn)象:反應-萘酚試驗反應水解反應堿性酒石酸銅試驗現(xiàn)象有紅色環(huán)生成有磚紅色沉淀生成有磚紅色沉淀生成4.討論與分析：從上述現(xiàn)象中可以看出，各個鑒定試驗的現(xiàn)象較為明顯，因此白芷含有苷。（二） 蒽昔的鑒別檢品溶液的制備：取大黃粉末2克，加乙醇20ml，在沸水浴上回流浸提10分鐘，過濾供鑒別用。鑒別試驗：與堿成鹽顯色反應：取1ml乙醇提取液，加入1ml10%NaOH溶液，如產(chǎn)生紅色反應，加入少量30%過氧化氫液，加熱后紅色不褪，加酸使呈酸性時，則紅色消褪再堿化又出現(xiàn)紅色。實驗現(xiàn)象：加入堿溶液之后，溶液產(chǎn)生了紅色反應，加入過氧化氫溶液，加熱后紅色沒褪掉，加酸使其呈酸性則紅色褪掉，加堿使其呈堿性則又出現(xiàn)紅色。（三） 黃酮昔的鑒別檢品溶液的制備：取槐花米1克壓碎于試管中加乙醇10~20ml在水浴上加熱20分鐘。過濾，濾液供以下試驗。鑒別試驗：取醇浸液2ml，加濃鹽酸2~3滴及鎂粉少量，放置（或于水浴中微熱），產(chǎn)生紅色反應。取醇浸液1ml，滴加pbAC2溶液數(shù)滴，產(chǎn)生黃色沉淀。紙片法：將醇浸液滴于濾紙上，進行以下試驗：先在紫外燈下觀察熒光，然后噴1%AlCL試劑，再觀察熒光是否加強。3實驗現(xiàn)象：反應滴加濃鹽酸滴加pbAC2溶液紙片法（噴1%AlCl3試劑）現(xiàn)象還沒加熱，就有紅色沉淀生成生成的沉淀較少，變成淡黃色濁液噴了1%AlCl3試劑之后，熒光變強，且為黃色熒光偏綠色討論與分析：從上述現(xiàn)象中可知，各種鑒定反應現(xiàn)象非常明顯，因此槐花米中含有黃酮苷。（四）皂昔的鑒別檢品溶液的制備：1）取皂角1g于大試管中，加蒸餾水15ml，于60°C水浴上加熱15分鐘后過濾取濾液。取薯蕷碎塊0.5g加上法同樣制備得薯蕷水浸液。取薯蕷碎塊0.5g于小錐形瓶中加95%乙醇10ml于水浴上溫浸15分鐘，濾液供鑒別。鑒別試驗：泡沫試驗：薯蕷浸液，皂角浸液各2ml，分別置于試管中。用力振搖一分鐘后放置，在10分鐘內(nèi)觀察二管是否都有持久性泡沫產(chǎn)生？醋酐濃硫酸試驗：皂角浸液5ml，于蒸發(fā)皿中在水浴上蒸干，加入1ml醋酐使其溶解，滴于干燥比色盤中，從邊沿緩緩滴加濃硫酸1滴，觀察顏色變化。另取薯蕷浸液5ml，置于蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，加入1ml醋酐溶液，并傾入比色盤中，(試管)沿管壁加入幾滴濃硫酸，觀察界面間是否有紫紅色環(huán)產(chǎn)生？實驗現(xiàn)象：泡沫試驗醋酐濃硫酸試驗現(xiàn)象產(chǎn)生的泡沫很多，且一直持續(xù)著產(chǎn)生皂角浸液：漸漸變紅紫色薯蕷浸液：界面間有紫紅色環(huán)生成4、討論與分析：從上述的現(xiàn)象中可知，現(xiàn)象都比較明顯，因此可以推出皂角、薯蕷都含有皂苷。氰昔的鑒別實驗步驟：取苦杏仁1.51g，研碎，置50ml錐形瓶中加入3ml5%硫酸溶液，充分混合，塞好，進行以下反應?？辔端徕c試驗：取濾紙條先滴加飽和苦味酸液侵潤，稍干后，再滴加10%碳酸鈉1~2滴潤濕，干后，懸于上述錐形瓶中，在水浴上加熱10分鐘，濾紙漸變?yōu)槌壬虼u紅色。取濾紙條先滴加3~4滴愈創(chuàng)木樹酯醇溶液潤濕，干后，再滴加1%硫酸鈉液3~4滴潤濕后，懸于同一錐形瓶中，放置，濾紙條漸變?yōu)轷r蘭色(放置過入色漸褪)。亞鐵氤化鐵反應：另取苦仁0.54g研碎，放入試管中，加水1~2滴潤濕(切勿過量)，立即用已被10%NaOH試劑1滴濕潤的濾紙條懸于管口置50。。水浴上約10分鐘，將濾紙取出，于濾紙上加10%FeSO4液1滴，加10%HCl1~2滴及1%FeCl3，試液1滴即顯蘭色。實驗結(jié)果：反應苦味酸鈉試驗愈創(chuàng)木樹酯醇溶液濾紙條亞鐵氤化鐵反應現(xiàn)象濾紙漸變?yōu)榇u紅色濾紙條漸變?yōu)轷r蘭色，放置過入色漸褪濾紙條變蘭色討論與分析：從上述現(xiàn)象中可知，各個鑒定反應現(xiàn)象非常明顯，因此杏仁中含氤苷。三、揮發(fā)油的定性鑒別實驗步驟：取各種揮發(fā)油(松節(jié)油、薄荷油、丁香油)觀察其色澤，是否有特殊香氣。揮發(fā)性：取濾紙一小塊，滴加薄荷油一滴，放置2小時或微熱后觀察濾紙上有無油跡pH檢查：取樣品一滴加乙醇5滴，以預先用蒸餾水濕潤的廣泛pH試紙進行檢查，如顯酸性，示有游離的酸或酚類化合物。FeCl3反應(檢酚類)：取樣品一滴，溶于1ml乙醇中，加入1%得FeCL3醇液1~2滴，如顯藍紫或綠色，示有酚類。（5）苯肼試驗（檢酮、醛類）取2,4一二硝苯肼試液0.5~1ml,加1滴樣品的無醛醇溶液，用力振搖，如有酮醛化合物，應析出黃一橙紅色沉淀，如無反應，可放置15min后再觀察之。2.實驗現(xiàn)象：顏色是否有特殊香氣揮發(fā)性pH檢查FeCl3反應苯肼反應松節(jié)油無色有強pH=5，弱酸性無顏色變化，無酚類無明顯變化，無酮醛化合物薄荷油淺黃色有強pH=4~5，弱酸性無顏色變化，無酚類無明顯變化，無酮醛化合物丁香油紅棕色有強pH=4~5，弱酸性顯墨綠色，有酚類有黃橙色沉淀生成，有酮醛化合物四、鞣質(zhì)類化合物的鑒別檢品溶液的制備：取五倍子（含可水解鞣質(zhì)），兒茶（含縮合鞣質(zhì)），沒食子酸（鞣質(zhì)水解產(chǎn)生偽鞣質(zhì)）少量（約0.1克）分別置大試管中，加蒸餾水約10ml，加熱煮沸，過濾，濾液作以下試驗：鞣質(zhì)的一般反應（鞣質(zhì)與偽鞣技的區(qū)別鑒定）（1） 感觀試驗：取制備的鞣質(zhì)和偽鞣質(zhì)溶液，嘗其味，用石蕊試紙檢查溶液是否呈酸性反應。（2） 三氯化鐵反應：取制備的鞣質(zhì)溶液（五倍子溶液或兒茶溶液）及食子酸溶液各1~2ml，分別加入三氯化鐵試液，鞣質(zhì)產(chǎn)生綠色或蘭黑色反應或沉淀;偽鞣質(zhì)產(chǎn)生蘭色反應?？伤怊泛涂s合鞣質(zhì)的區(qū)別鑒定（1） 鞣紅反應：取五倍子浸液（含可水解鞣質(zhì)），兒茶浸液（含縮合鞣質(zhì)）各2ml，分別加鹽酸0.5ml，加熱煮沸30分鐘左右放冷?？伤怊焚|(zhì)不發(fā)生沉淀，縮合鞣質(zhì)有紅色沉淀產(chǎn)生。（2） 三氯化鐵反應：取五倍子浸液及兒茶浸流各1~2ml，分別加入三氯化鐵試液數(shù)滴，可水解鞣質(zhì)顯蘭色或黑蘭色反應，縮合鞣質(zhì)顯黑綠色反應。（3） 醋酸溶液中與醋酸鉛反應：取五倍子浸液及兒茶浸液各1~2ml，分別加醋酸液數(shù)滴，搖勻后再分別滴加醋酸鉛溶液數(shù)滴，可水解鞣質(zhì)產(chǎn)生絮狀沉淀，縮合鞣質(zhì)無沉淀產(chǎn)生。實驗現(xiàn)象：4.1鞣質(zhì)的一般反應：五倍子兒茶沒食子酸酸堿性酸性中性酸性三氯化鐵的反應生成蘭黑色沉淀生成綠色沉淀生成蘭色沉淀4.2可水解鞣和縮合鞣質(zhì)的區(qū)別鑒定:鞣紅反應三氯化鐵反應醋酸溶液中與醋酸鉛反應五倍子浸液開始時有沉淀生成，后來沉淀消失，溶液變澄清顯蘭色反應產(chǎn)生絮狀沉淀兒茶浸液有沉淀生成，且沉淀不會隨時間而消失顯棕色反應無明顯沉淀生成

實驗三粉防己生物堿的提取分離與鑒定一、 目的要求通過漢防己中幾種生物堿的提取分離和鑒定，要求掌握生物堿的一般提取方法。用低壓柱層析分離，純化單體的方法及薄層層析鑒定二、 已知生物堿的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)漢防己為防己科千金藤屬物的根，是祛風解熱鎮(zhèn)痛藥物，其有效成分為生物堿。主要是漢防己甲素和漢防已乙素。臨床上除用作治療高血壓、神經(jīng)性疼痛、抗阿米巴原蟲外，還將粉防已生物堿的碘甲基、或漠甲基化合物作為肌肉松弛劑應用，此外漢防已甲素在動物實驗中有抗癌和擴張血管的作用。漢防已根中總生物堿含量為1.5~2.3%，主要為漢防已甲素，含量約1%，漢防已乙素，含量約0.5%；輪環(huán)藤酚堿，含量為0.2%；以及其它數(shù)種微量生物堿。1.漢防已甲素（漢防已堿，粉防已堿）無色針晶，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有機溶劑及稀酸水中，可溶于苯，mp216°C，有雙熔點現(xiàn)象，自丙酮中結(jié)晶者，150。。左右熔后加熱又固化，至213C復熔。CH3CH3R=CH3 漢防己甲素R=H 漢防己乙素漢防已乙素（又稱防已諾林堿，去甲粉防已堿）：溶解行為與漢防已甲素相似，因有一個酚羥基，故極性較漢防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于漢防已甲素而在乙醇中又大于漢防已甲素。籍此可以相互分離，用不同溶劑重結(jié)昌時，其晶形和溶點不同。輪環(huán)藤酚堿：為水溶性季銨生物堿，不溶于極性溶劑，氯化物為無色，八面體狀結(jié)昌，mp214~6C，碘化物為無色絹絲狀結(jié)晶，mp185C；苦味酸鹽為黃色結(jié)晶，mp154~6C。och3och3三、生物堿的提取分離1.總生物堿的提取和親脂性與親水性生物堿的分離漢防己藥材粗粉50g稀硫馥溶'液浸沒樣品（注一）酸水浸'液加入新鮮石灰水調(diào)ph值為g-w,靜置，抽濾泥黃色沉淀 堿水'液（水溶性季波堿以及水溶性雜質(zhì)）將沉淀與拌勻（注二）于勤E烘干，置于索氏提取器中用100ml乙酰提取至虹吸ST次后，I回收乙酰（注三）乙酎提取物用95%Z?20~30ml回流熱溶后，傾A250ml水中，此時會有晶體析出，澄清'溶'液變'渾濁.加入適量霎以鹽析出更多晶體。靜置：抽濾V白色沉淀（親脂性叔鐐總堿，以漢防己甲素、乙素為主）注一：往300ml蒸餾水中滴加一滴濃硫酸，再把酸水液倒入藥品粉末中至剛好浸沒樣品（大概100ml），攪拌靜置30min，過濾取濾液。注二：凈砂必須事前洗凈烘干，以沉淀與凈砂的質(zhì)量比為1:2加入凈砂，并混勻。注三：先將提取器內(nèi)濾紙筒取出。然后將提取玻筒內(nèi)最后一次乙醚提取液傾出（另器貯存），再將提取玻筒安裝好，繼續(xù)加熱，回收燒瓶中乙醚于玻筒中，至燒瓶內(nèi)的乙醚提取液體積較小時，停止回收，將燒瓶中乙醚提取液傾出。低壓柱層析分離漢防已甲素和乙素低壓柱層析在低壓下（0.5~3kg/cm2,一般0.3~1.2kg/cm2）采用顆粒直徑介于經(jīng)典柱層析（100~200pm）和HPLC（~37pm）之間的薄層層析用硅膠G（50~75pm）作為填充劑的一種柱層析柱，其基本原理與HPLC相同，分離效果也介于經(jīng)典柱與HPLC之間，用減壓干法裝柱，鋪層緊密均勻，層析帶分布集中整齊，同時薄層層析的最佳分離溶劑系統(tǒng)可以直接用于低壓柱層析，它是一種分離效果較好，設(shè)備簡單，操作方便，快速的方法。適宜和于天然產(chǎn)物的常量制備性分離。（1） 裝柱層析柱規(guī)格：柱長30cm，內(nèi)徑2cm，共裝硅膠約30g（高約22cm）。（2） 拌樣加樣把實驗產(chǎn)品的白色沉淀加少量丙酮熱溶（剛?cè)転槎龋?，加?.5g硅膠上，仔細拌勻，水浴上蒸干，碾細，通過一個長頸漏斗小心加在柱頂，輕輕垂直頓擊，待樣品表面平整不拌動時，上面再蓋約1~2cm高的空白硅膠，再加蓋一園形濾紙片，壓緊。（3） 洗脫先檢查從空壓機至層析柱各閥門管道是否正常，關(guān)緊各個閥門，開動空壓機至額定壓力（5.8k