基因工程5重組DNA構(gòu)建與篩選第1頁/共46頁一、粘末端DNA片段的連接（一）具有相同粘末端的連接

第2頁/共46頁EcoRIHindIIIEcoRI載體酶切HindIIIEcoRI對(duì)基因酶切（二）具有不同粘性末端的連接用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體和外源DNA進(jìn)行切割后，在它們兩端會(huì)產(chǎn)生非互補(bǔ)的突出端，經(jīng)DNA連接酶連接后即產(chǎn)生定向重組體。

HindIII第3頁/共46頁二、平末端DNA片段的連接（一）直接用T4連接酶連接第4頁/共46頁（二）同聚物加尾法優(yōu)點(diǎn)：接“尾”后的載體不能自身環(huán)化，提高了轉(zhuǎn)化效率。

缺點(diǎn)：①可能改變目的基因或載體的閱讀框，影響外源DNA表達(dá)

②外源DNA無法收回

第5頁/共46頁（三）銜接物連接法銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。第6頁/共46頁（四）

DNA接頭連接法

接頭的一端是齊平的，而另一端是某種內(nèi)切酶的粘性末端第7頁/共46頁（五）

PCR引入酶切位點(diǎn)第8頁/共46頁防止載體自身環(huán)化的措施

1、堿性磷酸酶脫磷酸基法

2、雙酶切法

3、過量法：基因片段：載體（5:1or10:1)

三、重組DNA連接注意事項(xiàng)第9頁/共46頁第三節(jié)基因轉(zhuǎn)移一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌

轉(zhuǎn)化、電激法二、重組DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法載體介導(dǎo)、基因槍法三、重組DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法

轉(zhuǎn)染第10頁/共46頁一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌

（一）轉(zhuǎn)化

將外源DNA分子導(dǎo)入某一宿主細(xì)菌細(xì)胞的過程都叫轉(zhuǎn)化。

為了有效地使細(xì)菌吸收外源的DNA分子，我們通常要對(duì)它們進(jìn)行一些物理或化學(xué)的處理，處理后的細(xì)胞吸收外源DNA的能力大大提高，被稱為感受態(tài)細(xì)胞。第11頁/共46頁1、轉(zhuǎn)化過程

E.coli：感受態(tài)細(xì)胞＋重組DNA分子加入LB擴(kuò)增

涂布選擇性平板

2、DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞過程①吸收：DNA分子吸附于受體菌表面②轉(zhuǎn)入：雙鏈DNA分子解鏈，單鏈DNA進(jìn)入，另一條鏈降解③自穩(wěn)：進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的單鏈又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA④表達(dá)：目的基因隨載體同時(shí)被復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯3、質(zhì)粒DNA的大小及構(gòu)型對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響（1）大小＞10Kb，轉(zhuǎn)化效率很低（2）構(gòu)型超螺旋＞環(huán)形＞線狀第12頁/共46頁熱激法（HeatShockMethod）第13頁/共46頁（三）電激法(electroperation)

電激法是利用高壓電脈沖的作用對(duì)原生質(zhì)體或細(xì)胞擊出微孔而使基因轉(zhuǎn)移的一種新方法?？赡鎿舸簱舸┬】卓稍谝欢〞r(shí)間內(nèi)復(fù)原。不可逆擊穿：擊穿小孔不可修復(fù)，處理細(xì)胞成活率低。第14頁/共46頁1.電轉(zhuǎn)化流程（1）電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備（2）電轉(zhuǎn)化操作程序電擊復(fù)蘇涂布（3）電擊杯清洗第15頁/共46頁二、重組DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法

（一）載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法

1、共培養(yǎng)法(cocultivation)

（1）原生質(zhì)體共培養(yǎng)法

取含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛長出細(xì)胞壁的原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞之間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。第16頁/共46頁第17頁/共46頁（2）葉盤共培養(yǎng)法

優(yōu)點(diǎn)：適用性廣，對(duì)于那些能被農(nóng)桿菌感染的、并能從葉子再生植株的各種植物均適用。第18頁/共46頁2、活體接種(inoculationinvivo)

第19頁/共46頁（1）基因槍法

80年代末期，由康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出，主要是為了克服以往各種基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的局限。該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速?zèng)_擊細(xì)胞，把細(xì)胞擊孔，使目的基因進(jìn)入受體。

第20頁/共46頁第21頁/共46頁基因槍所用材料：（1）鎢粉使用起來經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對(duì)植物細(xì)胞的毒害也比金粉大。（2）將DNA包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。（3）所用動(dòng)力系統(tǒng)：火藥爆炸力電弧放電高壓氣體基因槍法的特點(diǎn)：（1）轉(zhuǎn)化效率高。（2）受體廣泛。（3）操作簡單。第22頁/共46頁（2）微注射法（micro-injection）

微量注射：用注射針或微針在受體細(xì)胞或組織穿刺成孔，DNA隨穿刺孔進(jìn)入細(xì)胞或隨穿刺針頭—道進(jìn)入。

顯微注射：利用顯微注射儀，通過機(jī)械方法把外源DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。常用的細(xì)胞固定方法有3種：一、瓊脂糖包埋法二、多聚賴氨酸粘連法三、吸管支持法第23頁/共46頁（2）DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染技術(shù)

（3）電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)

（4）脂質(zhì)體載體法（5）細(xì)胞核的顯微注射法

三、重組DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法

（1）磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)

（6）活體電穿孔技術(shù)

第24頁/共46頁（6）活體電穿孔技術(shù)

活體電穿孔法(invivoelectroporation)是將外源基因通過電場(chǎng)作用，導(dǎo)入動(dòng)物目標(biāo)組織或器官。活體電穿孔法的特點(diǎn)：靶器官的選擇面廣對(duì)導(dǎo)入的外源基因片段的大小沒有限制,從幾KB或十幾KB的表達(dá)載體,到100～200KB的YAC、BAC基因組,都有成功導(dǎo)入并獲得表達(dá)的報(bào)道?；铙w電穿孔法操作簡單快速,電穿孔的時(shí)間只有幾秒鐘,而且DNA片段不需要特殊的純化操作。第25頁/共46頁活體電穿孔法在基因治療方面的應(yīng)用腦瘤的治療人單核細(xì)胞趨化物蛋白基因到大鼠腦瘤治療機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病骨骼肌導(dǎo)入促紅細(xì)胞生成素基因第26頁/共46頁第四節(jié)重組DNA分子的篩選第27頁/共46頁外源基因與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可能的三種情況：（1）（2）（3）轉(zhuǎn)化E.coli第28頁/共46頁一、重組體的篩選遺傳檢測(cè)方法抗藥性標(biāo)記插入失活β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)免疫化學(xué)方法

放射性抗體檢測(cè)核酸雜交方法轉(zhuǎn)譯篩選法第29頁/共46頁（一）遺傳檢測(cè)方法

原理：

根據(jù)載體DNA分子上的篩選標(biāo)記賦予受體細(xì)胞在篩選平板

上表型的變化。如抗藥性引起生長與不長；顏色變化等。

方法：

①插入失活抗生素平板篩選法（pBR322系統(tǒng)）

由于外源DNA的插入引起抗藥性失活——插入失活第30頁/共46頁第31頁/共46頁插入失活-環(huán)絲氨酸篩選法四環(huán)素+環(huán)絲氨酸氨芐青霉素第32頁/共46頁②放射免疫篩選法

1.放射免疫篩選過程

A、制備抗原：培養(yǎng)菌落

（噬菌斑）

B、制備抗體：免疫動(dòng)物

C、抗原抗體反應(yīng)

D、檢測(cè)：放射自顯影

E、選出重組體第33頁/共46頁第34頁/共46頁2.放射免疫篩選法優(yōu)點(diǎn)：

①可以選出無表型特征的克隆

3.放射免疫篩選法缺點(diǎn)：

①必須是表達(dá)載體

②需要放射性物質(zhì)——同位素：污染昂貴

第35頁/共46頁(三)核酸雜交方法探針（probe）：用來探知被測(cè)物存在的小分子DNA或RNA。標(biāo)記物：探針上結(jié)合的易被檢測(cè)的化合物。分子雜交（molecularhybridization）：探針DNA或RNA與被測(cè)物的互補(bǔ)結(jié)合叫分子雜交。一、基本概念第36頁/共46頁二、核酸探針類型

雙鏈DNA探針

DNA探針核酸探針單鏈DNA探針

RNA探針單鏈RNA探針

放射性標(biāo)記探針探針標(biāo)記非放射性標(biāo)記探針核酸探針的類型和稱謂常有以下幾種：第37頁/共46頁非放射性標(biāo)記原理第38頁/共46頁三、菌落原位雜交第39頁/共46頁菌落生長轉(zhuǎn)移到NC膜上DNA釋放和變性固定雜交洗膜放射自顯影查找陽性克隆第40頁/共46頁四、斑點(diǎn)雜交（Dotblot）模板制備點(diǎn)膜固定雜交洗膜