第七章序列測定第一頁，共二十四頁，2022年，8月28日DNA序列測定：DNAsequencing酶法或末端終止法：由Sanger等人1977年建立；化學(xué)法：由MaxamandGilbert等人1977年建立；自動測序系統(tǒng)：在末端終止法基礎(chǔ)上發(fā)展而來。第二頁，共二十四頁，2022年，8月28日末端終止法特性：利用DNA聚合酶進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；其引物是帶有放射性標(biāo)記的，可通過放射自顯影檢出；雙脫氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）作為鏈終止劑；采用聚丙烯酰胺區(qū)分長度僅差一個(gè)堿基的單鏈DNA。原理：雙脫氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）不會與正常的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）形成磷酸二酯鍵，從而鏈的隨機(jī)終止；建立4個(gè)系統(tǒng)，就可得到4個(gè)套組（nestedsets）；在一個(gè)膠板上同時(shí)電泳，就可讀出模板鏈的互補(bǔ)鏈的順序。第三頁，共二十四頁，2022年，8月28日雙脫氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）第四頁，共二十四頁，2022年，8月28日DNA的序列測定（1）－－ddNTP法Sanger法第五頁，共二十四頁，2022年，8月28日第六頁，共二十四頁，2022年，8月28日第七頁，共二十四頁，2022年，8月28日化學(xué)法測序的基本原理將雙鏈或單鏈DNA經(jīng)過不同的化學(xué)方法降解，得到隨機(jī)的短的DNA片段，再通過電泳分離讀取順序。每次只能在一個(gè)特定的核苷酸處降解：

G反應(yīng)：硫酸二甲脂（DMS）使鳥嘌呤N7甲基化；

A+G反應(yīng)：甲酸使嘌呤環(huán)上的氮質(zhì)子化導(dǎo)致糖苷鍵被削弱，進(jìn)而嘌呤環(huán)被嘧啶取代；

C+T反應(yīng)：肼能夠裂解嘧啶環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致其脫落；

C反應(yīng)：在一定濃度的條件下，肼只對胞嘧啶起作用第八頁，共二十四頁，2022年，8月28日DNA的序列測定（2）－－化學(xué)法Maxam/Gilbert法第九頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十頁，共二十四頁，2022年，8月28日到2030年，預(yù)計(jì)只要1000美金就能得到個(gè)人的基因組序列。

注：人與人之間平均1000個(gè)堿基對就有一個(gè)堿基呈多態(tài)性。因此共有300萬堿基上可能存在差異。第十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日DNA序列的自動測定基本原理：末端終止法引物用熒光素標(biāo)記測序系統(tǒng)由反應(yīng)系統(tǒng)，電泳系統(tǒng)及驅(qū)控系統(tǒng)組成ALFexpressTM全自動激光熒光核酸測序儀400-500bppersampleABI最新型全自動DNA測序儀700bppersample第十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日DNA自動測序原理第十三頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十四頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十五頁，共二十四頁，2022年，8月28日DNA自動測序工作站第十六頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十七頁，共二十四頁，2022年，8月28日DNA測序結(jié)果第十八頁，共二十四頁，2022年，8月28日Pyrosequencing:焦磷酸測序法仍然根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則單個(gè)核苷酸或堿基按給定順序發(fā)放通過檢測焦磷酸發(fā)光反應(yīng)來判斷正確的核苷酸順序

AGGATCTGAGGCAAG

TCCTAGAC…第十九頁，共二十四頁，2022年，8月28日ANewLightonDNAJoJoGeneCompanyLimited第二十頁，共二十四頁，2022年，8月28日PPiATPPrincipleofPyrosequencing第二十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日Peakheightisproportionalto

thenumberofincorporatednucleotidesAllele1:ACTGAllele2:GCTGHeterozygotesample:第二十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日AdvantageandBenefitofPyeosequencingFastAccuracyFlexibilityMultiplexingSimpleSequenceEfficientShortOptimizationTimeDedicatedSoftwareDedicatedReagentKitScalable第二十三頁，共二十四頁，2022年，