經(jīng)典色譜法液相第一頁，共八十九頁，2022年，8月28日第1節(jié)液-固吸附柱色譜(LSC)（一）分離原理（二）常用吸附劑（三）色譜條件的選擇

(四)操作方法第二頁，共八十九頁，2022年，8月28日

各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心，

利用吸附劑表面的活性吸附中心對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離，吸附能力大小用吸附平衡常數(shù)K表示（一）分離原理1.吸附與吸附平衡第三頁，共八十九頁，2022年，8月28日2.吸附等溫線：一定溫度下，某一組分固定相和流動相之間達到平衡時，以Cs為縱坐標，Cm為橫坐標得到的曲線。類型：線性、凸形、凹形等溫線第四頁，共八十九頁，2022年，8月28日吸附等溫線色譜柱內(nèi)溶液濃度的分布流出曲線第五頁，共八十九頁，2022年，8月28日當吸附等溫線是線性時,流出曲線是對稱的,當吸附等溫線是凸型或凹型時，流出曲線形成拖尾峰或前延峰，克服方法：減少進樣量或樣品濃度，利用等溫線的直線部分，防止超載。第六頁，共八十九頁，2022年，8月28日（二）、吸附劑對吸附劑的要求：（1）具有較大的表面積和一定的吸附能力（2）顆粒要有一定的細度(d=75-150μm，即 100-200目)，且粒度均勻（3）與洗脫劑及樣品不起反應(yīng)，不溶解于洗脫劑常用：硅膠、氧化鋁、聚酰胺、活性炭、大孔樹脂第七頁，共八十九頁，2022年，8月28日吸附機制：表面的硅醇基，與物質(zhì)形成氫鍵適用范圍：微酸性（pH=4~5），適于酸性和中性物質(zhì)失活：水與硅醇基結(jié)合使其失去活性活化：105-110℃加熱30min粒度：100-200目1.硅膠（SiO2·H2O）中等極性吸附劑第八頁，共八十九頁，2022年，8月28日

堿性氧化鋁pH9～10適于分析堿性、中性物質(zhì)如：生物堿中性氧化鋁pH7.5適于分析酸性、堿性和中性物質(zhì)如：生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體及在酸堿中不穩(wěn)定的苷類、酯、內(nèi)酯等化合物酸性氧化鋁pH4～5適于分析酸性、中性物質(zhì)如：酸性色素、氨基酸、對酸穩(wěn)定的中性物質(zhì)2.氧化鋁：吸附力較強第九頁，共八十九頁，2022年，8月28日硅膠、氧化鋁的含水量與活性關(guān)系硅膠含水量%活度級氧化鋁含水量%0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ15活度測定法：Brockmamn法結(jié)論：含水量越低，活度級別越小，吸附力越強。第十頁，共八十九頁，2022年，8月28日3、聚酰胺商品名：錦綸、尼龍-6不溶于水和有機溶劑，易溶于濃無機酸分離機制：主要是氫鍵吸附適用對象：黃酮類、鞣質(zhì)、醌粒度：20~200目氫鍵能力↑強組分越后出柱

第十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日4、大孔樹脂是一種具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。不溶于酸、堿及有機溶劑分類：非極性和中等極性特點：在水中吸附力較強，在有機溶劑中吸附力較弱適用對象：皂苷類、黃酮苷類化合物粒度：20~60目第十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日（三）色譜條件的選擇：1.被測組分性質(zhì)（極性大?。?/p>

烷烴＜烯烴＜醚<硝基化合物<二甲胺＜酯＜酮＜醛<胺＜酰胺＜醇＜酚＜羧酸依據(jù)被測組分、吸附劑和流動相的性質(zhì)第十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日2.吸附劑的選擇：

吸附劑的活性↑大，對被測組分的吸附能力↑強

強極性物質(zhì)——選擇弱吸附劑

弱極性物質(zhì)——選擇強吸附劑酸性成分：硅膠堿性成分：氧化鋁黃酮類：聚酰胺第十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日

“相似相溶”原則：分離極性大的物質(zhì)應(yīng)選用極性大的溶劑作流動相，分離極性小的物質(zhì)應(yīng)選用極性小的溶劑作流動相3、流動相的選擇流動相極性順序：石油醚<環(huán)已烷<苯<甲苯<乙醚<三氯甲烷<乙酸乙酯<丙酮<正丁醇<乙醇<甲醇<水常用：混合溶劑如：不同配比的甲醇-水或甲醇親脂性成分用氯仿、乙酸乙酯第十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日4.三者關(guān)系：

組分吸附劑流動相極性大活性小極性非(弱)極性活性大非極性或弱極性第十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日（四）、操作方法2、上樣3、洗脫1、色譜柱的制備

要求：填裝均勻、緊密，不能有氣泡。裝柱時柱要垂直，表面平整。固定相的用量適宜。柱體：色譜柱

固定相：顆粒大小100-200目，用量

方法：干法裝柱、濕法裝柱4、檢視第十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日第2節(jié)液-液分配柱色譜法（LLC）一、基本原理

原理：利用不同組分在固定相中溶解度不同，而進行分離過程：第十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日二、載體作用：支撐與分散固定液的作用要求：1）化學(xué)惰性，不易與其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)2）對被分離組分沒有吸附能力3）能吸留較大量的固定相液體常用載體：硅膠、硅藻土、纖維素等第十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日三、固定液、流動相及其選擇分類：正相分配色譜和反相分配色譜正相分配色譜：固定液極性大于流動相固定液：水、各種緩沖溶液、甲醇等強極性物質(zhì)流動相：石油醚、三氯甲烷等低極性物質(zhì)適合分離的物質(zhì)：極性物質(zhì)各種極性物質(zhì)流出順序：t非極性<t中極性<t強極性第二十頁，共八十九頁，2022年，8月28日反相分配色譜：固定液極性小于流動相固定液：硅油、液狀石蠟等極性小物質(zhì)流動相：水、與水相混溶的有機溶液適于分離物質(zhì)：中等極性至非極性物質(zhì)各種極性物質(zhì)流出順序：t極性<t中極性<t非極性第二十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日選擇原則：固定液與流動相的選擇，要根據(jù)被分離物中各組分在兩相中的溶解度之比即分配系數(shù)而定?？上仁褂脤Ω鹘M分溶解度大的溶劑為洗脫劑，再根據(jù)分離情況改變洗脫劑的組成，即在流動相中加入一些可調(diào)節(jié)溶解度的溶劑．以改變各組分被分離的情況與洗脫速率。第二十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日四、操作方法1.固定液的涂布與裝柱：裝柱前，首先將固定液與載體混合均勻2.加樣與洗脫：加樣方法：①試樣配成濃溶液；②試樣溶液用少量固定相吸附，待溶劑揮干后，加入柱內(nèi)；③用一塊比色譜柱內(nèi)徑略小的圓形濾紙吸附試樣溶液，待溶劑揮發(fā)后，加入柱內(nèi)第二十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日洗脫：洗脫時流動相應(yīng)先與固定相互相飽和，防止固定相流失應(yīng)用：適合各種類型化合物的分離第二十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日第3節(jié)離子交換柱色譜法（IEC）1、離子交換樹脂：樹脂：母體骨架是苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的球形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物-SO3H、-COOH陽離子交換樹脂-N(CH3)3+、-NH2陰離子交換樹脂定義：利用離子交換劑對各組分交換性能的差異使其分離分析的方法第二十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日陽離子交換樹脂：強酸型弱酸型樹脂酸性強度次序交換與再生反應(yīng)第二十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日陰離子交換樹脂：強堿型如弱堿型如交換與再生反應(yīng)第二十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日①交聯(lián)度：交聯(lián)劑（如二乙烯苯）的用量，重量百分比表示陽離子交換樹脂交聯(lián)度以8％，陰離子交換樹脂交聯(lián)度以4％左右為宜。高交聯(lián)度樹脂緊密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，交換速度慢，但選擇性好，反之，則具有較好的滲透性，選擇性差。2、性能第二十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日②交換容量：每克干樹脂含有可交換基團的數(shù)目，單位以mmol/g表示。交換容量表示離子交換樹脂進行離子交換能力大小。實際交換容量與理論有所不同。③溶脹：樹脂吸收水分后，引起的膨脹。溶脹程度取決于交聯(lián)度高低，交聯(lián)度高，溶脹小，反之，溶脹大。第二十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日④粒度：交換樹脂顆粒的大小，一般以溶脹狀態(tài)下通過的篩孔來表示。顆粒小，離子交換達到平衡快，但洗脫慢。第三十頁，共八十九頁，2022年，8月28日3、離子交換平衡平衡常數(shù)KA/B也稱離子選擇性系數(shù)，是衡量某樹脂交換能力大小的一種量度。K越大，保留時間越長。第三十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日4、影響選擇性系數(shù)的因素離子價數(shù)越高，水合離子半徑越小和離子交換樹脂的親和力越大，即選擇系數(shù)越大（1）強酸型陽離子交換樹脂不同價態(tài)的離子，電荷越高，親和力越強，選擇性系數(shù)越大，如Th4+＞Al3+＞Ca2+＞Na+

一價陽離子的親和力順序為Ag+＞Tl+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+

第三十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日（2）強堿型陰離子交換樹脂陰離子的親和力順序為檸檬酸根＞SO42-＞CrO42-＞I-＞HSO4-＞NO3-＞Br-＞CN-＞NO2-＞Cl-＞HCOO-＞CH3COO-＞OH-＞F-第三十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日5、操作方法及應(yīng)用（1）樹脂處理和再生處理目的：除去雜質(zhì)、轉(zhuǎn)變?yōu)樗枰男问疥栯x子樹脂轉(zhuǎn)變?yōu)闅湫?，陰離子樹脂轉(zhuǎn)變?yōu)槁刃突蛄u基型。處理方法：樹脂再生：第三十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日（2）裝柱處理好的樹脂加少量水攪拌后倒入色譜柱中，注意防止氣泡進入。（3）洗脫洗脫劑一般為水，或弱酸弱堿溶液，必要時加入少量有機溶劑（4）應(yīng)用除去干擾離子，微量元素的富集、水的純化等第三十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日第4節(jié)空間排阻柱色譜法（SEC）又稱為凝膠色譜法、分子排阻色譜法、分子篩色譜法和尺寸排阻色譜法分類：凝膠滲透色譜法（流動相為有機溶劑）凝膠過濾色譜法（流動相為水溶液）作用：用于大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖的分離第三十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日一、基本原理分子篩效應(yīng)：分子排阻色譜是根據(jù)溶質(zhì)分子大小的不同即分子篩效應(yīng)而進行分離的。大分子的流程短，移動速度快，先流出色譜柱；小分子的流程長，移動速度慢，后流出色譜柱；而中等分子居兩者之間，可使分子大小不一樣的混合組分實現(xiàn)分離。第三十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日滲透系數(shù)K溶膠孔穴內(nèi)外同等大小的溶質(zhì)分子處于擴散平衡狀態(tài)。

滲透系數(shù)K由溶質(zhì)分子的體積大小與孔穴的孔徑大小的相對關(guān)系決定，與流動相的種類無關(guān)。K越大，保留時間越長第三十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日三、操作方法及應(yīng)用（自學(xué)）二、凝膠的分類（自學(xué)）第三十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日小結(jié)經(jīng)典液相柱色譜的主要用途：色譜分析前樣品預(yù)處理、化學(xué)分離熟悉各種柱的使用掌握常用吸附劑的性質(zhì)掌握色譜條件的選擇掌握洗脫規(guī)律第四十頁，共八十九頁，2022年，8月28日第5節(jié)薄層色譜法（ThinLayerchromatography，TLC）1、定義：將固定相(吸附劑)均勻地鋪在具有光潔表面的薄板上形成薄層，在此薄層上進行色譜分離的方法。薄板：玻璃、塑料薄膜、鋁箔吸附劑：硅膠、氧化鋁第四十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日操作形式:平面流動相：展開劑操作：點樣、展開驅(qū)動力:毛細管力第四十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日特點：①分析時間短②分離能力強，一次可分離多個組分③靈敏度高④檢視方便⑤設(shè)備簡單分類：1.按分離機理分：吸附、分配、離子交換、空間排阻色譜等。2.按薄層板的分離效率不同：經(jīng)典薄層色譜法和高效薄層薄層色譜法應(yīng)用：藥物的定性鑒別第四十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日一、基本原理及名詞術(shù)語1.分離過程：以吸附薄層色譜法為例由于各組分與吸附劑具有不同的吸附能力，展開劑對各組分的溶解能力不同，即各組分有不同的吸附平衡常數(shù)，因此在展開過程中，產(chǎn)生差速遷移，實現(xiàn)分離。第四十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日3、比移值（Rf）可用范圍：0.2-0.8最佳范圍：

2、原點、溶劑前沿、展距分離的前提：k不同l0l第四十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日1、Rf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開劑的性質(zhì)有關(guān)2、色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，是薄層色譜基本定性參數(shù)，說明組分的色譜保留行為討論第四十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日3.相對比移值Rs

討論參考物與被測組分在完全相同條件下展開可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；參考物可以是后加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組分相對比移值Rs與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于121LLRRRffs===中心的距離原點到參考物斑點質(zhì)量心的距離原點到組分斑點質(zhì)量中（參）（組）第四十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日二、固定相常用的固定相：硅膠、氧化鋁、聚酰胺等粒度：200~300目吸附劑的選擇：根據(jù)樣品的性質(zhì)如極性、酸堿性及溶解度來選擇如：氧化鋁一般適合堿性物質(zhì)和中性物質(zhì)的分離硅膠適用于酸性及中性物質(zhì)的分離第四十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日1.硅膠：硅膠H、硅膠G、硅膠HF254、硅膠GF254G：指含煅石膏(Gypsum)黏合劑H：不含黏合劑F254：含一種在254nm下能發(fā)出黃綠 色熒光的無機熒光劑F365：含熒光劑，365nm紫外光照發(fā)光粒度：10~40μm(250~300目）含熒光劑的硅膠適用于本身不發(fā)光又無適當顯色劑顯色的物質(zhì)第四十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日三、展開劑展開劑選擇：主要根據(jù)被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活性及展開劑本身的極性來選擇

組分吸附劑流動相極性大活性小極性非(弱)極性活性大非極性或弱極性第五十頁，共八十九頁，2022年，8月28日

制板

點樣

展開

檢視四、操作方法第五十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日（一）制板（2）粘合劑：水或0.3~0.7%CMC-Na，用量1:3（3）涂鋪厚度：0.3mm，0.5mm（4）活化：自然晾干后，105℃烘1h（5）貯備：干燥器（1）載板的準備：多用玻璃板，要求表面光滑，平整清潔。常用規(guī)格：10cm×10cm、20cm×20cm、載玻片等第五十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日薄層板的鋪制方法（1）手工涂鋪法（2）機械涂鋪法（半自動、全自動）（3）燒結(jié)玻璃法第五十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日（1）樣品溶液的制備：一般用溶解度大，低沸點、弱極性、易揮發(fā)的有機溶劑。不宜用水。（2）器具：毛細管、微量注射器、自動點樣器2、點樣（3）點樣量：1~10μl操作要點：溶解樣品的溶劑、點樣量和正確的點樣方法第五十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日（4）點樣方法：垂直方向，不能用力太大（5）點樣后溶劑須揮干點樣斑點直徑≤2mm一般為圓點，或條帶狀1cm1cm1cm第五十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日1)展開裝置：展開槽（層析缸）3、展開單槽雙槽第五十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日展距：8~15cm2）展開方式a上行法展開、近水平展開方式第五十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日b單向多次展開：取展開一次后的薄層板，揮干溶劑，再用同一種展開劑，按同樣的展開方向進行多次展開，以達更好的分離效果。ABAB一次展開多次展開第五十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日c單向多級展開：取一次展開后的薄層板，揮干溶劑，再改用另一展開劑，按同樣的展開方向進行多次展開，以達更好分離效果。d雙向展開：取一次展開后的薄層板，揮干溶劑，將薄層板旋轉(zhuǎn)90°，再改用另一種展開劑展開，以達更好分離效果。對象：極性相差較大的組分對象：復(fù)雜體系中極性相差較小的組分第五十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日3）注意事項

a層析缸必須密閉良好b防止邊緣效應(yīng)邊緣效應(yīng)：同一物質(zhì)的色譜斑點在同一薄層板上出現(xiàn)的兩邊緣的Rf值大于中間部分的Rf值的現(xiàn)象。第六十頁，共八十九頁，2022年，8月28日原因：色譜缸內(nèi)溶劑蒸氣未達飽和，造成展開劑的蒸發(fā)速率在薄層板兩邊與中間部分不等克服辦法：a“預(yù)飽和”b層析缸內(nèi)壁貼浸濕的濾紙條c點樣時不要太靠邊緣第六十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日c在展開過程中注意恒溫恒濕相對濕度硫酸（ml）+水（ml）32%6810042%5710058%39.510065%3410072%27.510088%1.8100溫度和濕度的改變會影響Rf值和分離效果，降低重現(xiàn)性。第六十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日對展開劑的基本要求：?不與組分或吸附劑存在化學(xué)反應(yīng)?使樣品各組分完全分離?使待測組分的Rf在0.3~0.5?展開后各斑點圓而集中，不拖尾?具有適中的沸點和小的粘度?臨用前配制4）展開劑第六十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日展開劑的組成：單一溶劑、多元溶劑單一溶劑：重現(xiàn)性好，分離能力差多元展開劑：可改善分離效果，重現(xiàn)性差展開系統(tǒng)的優(yōu)化優(yōu)化原則：先調(diào)整展開劑極性使待測組分Rf值適中，保持這個極性不變，改變展開劑的選擇性，直至所有組分有合適的分離度第六十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日Stahl圖解法展開劑極性非極性V活性I吸附劑待測物非極性極性Rf值的決定因素：①組分極性②展開劑的極性③吸附劑的活性第六十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日?加入少量的酸堿常用酸：甲酸、冰醋酸常用堿：濃氨水、乙二胺?展開劑用量：展開劑浸沒薄板下端約0.5cm第六十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日附：常用展開系統(tǒng)人參皂苷、黃芪甲苷：氯仿-甲醇-水（65：35：10，下層）正丁醇-醋酸乙酯-水（4：1：5，上層）黃酮苷：醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10：1：1：1）糖：正丁醇-冰醋酸-水（4：1：5，上層）中等極性：甲苯-醋酸乙酯-甲酸（10：3：0.5)

第六十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日苯—醋酸乙酯—甲醇—異丙醇—濃氨水（6：3：1.5：1.5：0.5）例：第六十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日1、定位方法：日光檢視4.檢測熒光淬滅斑點2.紫外光下檢視（254nm、365nm）第六十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日3、顯色檢視：利用顯色劑與待測物質(zhì)反應(yīng)，從而顯色。顯色劑分類：通用型顯色劑和專屬型顯色劑通用型顯色劑：對大部分物質(zhì)均顯色的試劑。如碘、硫酸乙醇等專屬型顯色劑：對某個或某一類化合物顯色的試劑。如茚三酮，三氯化鐵乙醇液等第七十頁，共八十九頁，2022年，8月28日常用顯色劑10%硫酸乙醇溶液5%三氯化鐵乙醇液（酸性）：酚生物堿：改良碘化鉍鉀黃酮：5%三氯化鋁乙醇液蒽醌：氨氣揮發(fā)油及低極性分子：5%香草醛硫酸液第七十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日五、薄層色譜法的應(yīng)用定性分析限量分析含量測定：洗脫測定法薄層掃描法第七十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日依據(jù)：固定色譜條件下，相同物質(zhì)的Rf值相同對照品供試品12定性分析第七十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日限量檢查如：附子中烏頭堿的限量檢查1.烏頭堿對照品2，3，4.樣品1234第七十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日定量分析一、冼脫法二、薄層掃描法（TLCS）第七十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日75薄層掃描法定義：將一定波長的單色光照射展開后的薄層板，測定薄層色譜斑點的吸收度，根據(jù)其色譜峰積分面積與待測物濃度或量成正比的定量方法薄層色譜掃描曲線hAL第七十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日常用：CS-9000雙波長飛點掃描儀CAMAGSCANNERⅢ光源單色器連續(xù)光單色光狹縫樣品點λI0I檢測器記錄儀器結(jié)構(gòu)：第七十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日單色器檢測器1薄層板光源A檢測器21.基本原理：折射光吸光度反射光吸光度：第七十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日2.掃描條件的選擇1）光學(xué)模式的選擇反射法：測量的是反射光的強度透射法：測量的是透射光的強度2）波長模式的選擇單波長模式：使用一種波長的光束對薄層進行掃描。分為單光束及雙光束兩種形式。第七十九頁，共八十九