蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組（proteome）:PROTEins+genOME，意為proteinexpressedbygenome—基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）:Thestudyoftheproteome—研究全部蛋白質(zhì)的存在及存在形式的一門學(xué)科根據(jù)研究目的，蛋白質(zhì)組學(xué)可分為

表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)(expressionproteomics）

結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)(structureproteomics)

功能蛋白質(zhì)組學(xué)(functionalproteomics)現(xiàn)在是1頁\一共有33頁\編輯于星期五1.表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)和量的變化，以及不同時間基因表達(dá)譜的改變2.結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)以繪制出蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)或存在于一個特殊細(xì)胞器中的蛋白為研究目的，用于建立細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)圖譜并解釋某些特定蛋白的表達(dá)對細(xì)胞的作用3.功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究在不同生理和病理?xiàng)l件下，細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和修飾現(xiàn)在是2頁\一共有33頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)組學(xué)研究路線現(xiàn)在是3頁\一共有33頁\編輯于星期五主要技術(shù)1.雙向凝膠電泳（two-dimensionalelectrophoresis,2-DE）

第一向：等電聚焦（IEF），根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行分離第二向：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差異進(jìn)行分離現(xiàn)在是4頁\一共有33頁\編輯于星期五2.雙向熒光差異凝膠電泳（two-dimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE）

采用專有的熒光染料與多重樣本和圖像分析的方法，在同一塊膠上可同時分離多個有不同熒光標(biāo)記的樣品，并以熒光標(biāo)記的樣品混合物為內(nèi)標(biāo)，對每個蛋白質(zhì)樣品和每個差異都可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度分析現(xiàn)在是5頁\一共有33頁\編輯于星期五生物質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)量的大小順序排列的圖像

質(zhì)譜儀是一類能使物質(zhì)離子化并通過適當(dāng)?shù)碾妶?、磁場將它們按空間位置、時間先后或軌道穩(wěn)定與否實(shí)現(xiàn)質(zhì)量比分離，并檢測強(qiáng)度后進(jìn)行物質(zhì)分析的儀器。質(zhì)譜儀主要由分析系統(tǒng)、電學(xué)系統(tǒng)和真空系統(tǒng)組成基本原理：通過對被測樣品離子的質(zhì)核比的測定來進(jìn)行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場的運(yùn)動行為的不同，把離子按質(zhì)荷比（m/z）分開而得到質(zhì)量圖譜，通過樣品的質(zhì)量圖譜和相關(guān)信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果?，F(xiàn)在是6頁\一共有33頁\編輯于星期五質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展1912英國物理學(xué)家Thomson研制成功第一臺質(zhì)譜儀20世紀(jì)20年代質(zhì)譜成為一種分析手段被化學(xué)家所采用40年代開始質(zhì)譜廣泛用于有機(jī)物質(zhì)的分析1966Munson&Field報道了化學(xué)電離源，質(zhì)譜第一次可以檢測熱不穩(wěn)定的生物分子80年代隨著軟電離技術(shù)（快原子轟擊FAB、電噴霧ESI、基質(zhì)輔助激光解吸MALDI）的發(fā)展，生物質(zhì)譜得到了飛速發(fā)展現(xiàn)在是7頁\一共有33頁\編輯于星期五軟電離

在質(zhì)譜分析中，離子源是將分子離解成離子或解離成碎片，在這里分子失去電子，生成帶正電荷的分子離子。分子離子可進(jìn)一步裂解生成質(zhì)量更小的碎片離子。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對于不同的分子應(yīng)選擇不同的離解方法。通常稱能給樣品較大能量的電離方法為硬電離方法，而給樣品較小能量的電離方法為軟電離方法，后一種方法適用于易破裂或易電離的樣品?！败洝笔窍鄬τ谧畛Ｓ玫碾娮与婋xEI而言。采用軟電離技術(shù)容易獲得能指明相對分子質(zhì)量的準(zhǔn)分子離子（M+H）+、（M-H）+，但能提供結(jié)構(gòu)信息的碎片離子較少?，F(xiàn)在是8頁\一共有33頁\編輯于星期五生物質(zhì)譜的一般結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是9頁\一共有33頁\編輯于星期五質(zhì)譜儀組成

樣品離子源形成離子(帶電分子)檢測質(zhì)譜質(zhì)量分析器離子檢測器電離質(zhì)量分選(過濾)根據(jù)m/z分選離子數(shù)據(jù)處理檢測離子基本步驟:1.樣品離子化2.根據(jù)質(zhì)量(m/z)不同分離離子3.檢測每種質(zhì)量離子的數(shù)目4.收集、處理數(shù)據(jù)得到質(zhì)譜圖現(xiàn)在是10頁\一共有33頁\編輯于星期五生物質(zhì)譜儀的離子源與質(zhì)量分析器離子源ElectroSprayIonization(ESI)Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization(MALDI)質(zhì)量分析器TimeofFlight(TOF)IonTrap(IT)Quadrapoles(Q)FourierTransformIonCyclotronResonance(FT-ICR)

現(xiàn)在是11頁\一共有33頁\編輯于星期五ESI借助強(qiáng)電場使電子分離，當(dāng)樣品溶液以低流速經(jīng)毛細(xì)管流出后，在霧化器的輔助下霧化成細(xì)小的帶點(diǎn)液滴。這些液滴在運(yùn)動過程中逐漸脫溶劑化導(dǎo)致體積變小，表面電荷密度增大，當(dāng)達(dá)到一定極限時，液滴發(fā)生爆裂產(chǎn)生更小的液滴。如此不斷重復(fù)，直至液滴很小時，由于液滴表面電荷密度極大，足以從液滴中解析出分子離子，而后者最終進(jìn)入質(zhì)譜分析器現(xiàn)在是12頁\一共有33頁\編輯于星期五電噴霧離子化僅能容忍較低容量的緩沖溶液、鹽和表面活性劑，這些物質(zhì)可以和分析物形成化合物從而干擾分子量的測定或抑制分析物離子的形成。HPLC是分離去除污染物的常用手段，而ESI的一大優(yōu)點(diǎn)就是可以很容易的和HPLC等各種預(yù)分離技術(shù)相連接。隨著20世紀(jì)90年代，納噴霧的出現(xiàn)，ESI-MS靈敏度大大提高，已經(jīng)可以檢測Femtomole(毫微微克分子)和Attomole(10-18mole)級的生化樣品現(xiàn)在是13頁\一共有33頁\編輯于星期五DESI(desorptionelectrosprayionization)

該技術(shù)的突破在于可以直接在大氣壓環(huán)境下分析未經(jīng)任何處理的樣品，如皮膚、花朵、尿液、生理組織等

DESI直接將電噴霧的帶點(diǎn)液滴和溶劑離子射向被分析物表面，就可以使樣品表面的分子解吸附并帶上電荷被質(zhì)譜檢測。Cooks課題組曾使用DESI技術(shù)直接分析人肝腺癌組織樣品，成功找到一些特殊磷脂在癌變區(qū)域含量異常升高的現(xiàn)象，而這些磷脂的存在正是和人體器官內(nèi)機(jī)能紊亂神經(jīng)酰胺引導(dǎo)的細(xì)胞死亡通路相關(guān)聯(lián)現(xiàn)在是14頁\一共有33頁\編輯于星期五DART(directanalysisinrealtime)現(xiàn)在是15頁\一共有33頁\編輯于星期五MALDI使用基質(zhì)的目的是為了保護(hù)待分析物不會因過強(qiáng)的激光能量導(dǎo)致化合物被破壞使用特定波長的激光（常用337nm和355nm紫外激光、1.06μm紅外激光等）照射到樣品靶上，樣品靶上的基質(zhì)將吸收到的能量傳遞給樣品，使樣品產(chǎn)生瞬間膨脹相變而發(fā)生本體解吸，使樣品離子化現(xiàn)在是16頁\一共有33頁\編輯于星期五常規(guī)的MALDI源處在真空系統(tǒng)內(nèi)，不允許MALDI-MS直接在線和其他樣品預(yù)分離系統(tǒng)聯(lián)用，也無法直接和其他自動化、機(jī)器人處理系統(tǒng)聯(lián)用，不可避免影響整個MALDI-MS樣品檢測的高通量性APMALDI(AtmospherePressure)SELDI(SurfaceEnhanced現(xiàn)在是17頁\一共有33頁\編輯于星期五TOF離子在離子源里產(chǎn)生，在電壓為V的電場作用下加速，飛過漂移區(qū)后到達(dá)檢測器內(nèi)，這段飛行時間為其在加速區(qū)中飛行時間和漂移區(qū)的飛行時間之和，正比于其質(zhì)量的平方根IT離子阱的上下端罩與左右環(huán)電極構(gòu)成可變電場，帶電離子在一定軌道上旋轉(zhuǎn)，改變電壓可使相同m/z離子依次離開進(jìn)入電子倍增器而分離Q樣品離子沿電極間軸向進(jìn)入電場后，在極性相反的電極間振蕩，只有質(zhì)荷比在某個范圍的離子才能通過四級桿到達(dá)檢測器，其余離子因振幅過大與電極碰撞，放點(diǎn)中和后被抽走FT-ICR離子在磁場作用下成為回旋離子，離子回旋時吸收與磁場垂直的電場能量，當(dāng)離子能量和吸收能量相等時產(chǎn)生共振，此時切斷交變電場，回旋離子在電極上產(chǎn)生感應(yīng)電流，感應(yīng)電流隨時間衰減，記錄該信號并通過傅里葉變換將時域圖轉(zhuǎn)換為頻域圖（質(zhì)譜圖）現(xiàn)在是18頁\一共有33頁\編輯于星期五01TOF離子在離子源里產(chǎn)生，在電壓為V的電場作用下加速，飛過漂移區(qū)后到達(dá)檢測器內(nèi)，這段飛行時間為其在加速區(qū)中飛行時間和漂移區(qū)的飛行時間之和，正比于其質(zhì)量的平方根離子阱的上下端罩與左右環(huán)電極構(gòu)成可變電場，帶電離子在一定軌道上旋轉(zhuǎn)，改變電壓可使相同m/z離子依次離開進(jìn)入電子倍增器而分離03Q樣品離子沿電極間軸向進(jìn)入電場后，在極性相反的電極間振蕩，只有質(zhì)荷比在某個范圍的離子才能通過四級桿到達(dá)檢測器，其余離子因振幅過大與電極碰撞，放點(diǎn)中和后被抽走02IT04FT-ICR離子在磁場作用下成為回旋離子，離子回旋時吸收與磁場垂直的電場能量，當(dāng)離子能量和吸收能量相等時產(chǎn)生共振，此時切斷交變電場，回旋離子在電極上產(chǎn)生感應(yīng)電流，感應(yīng)電流隨時間衰減，記錄該信號并通過傅里葉變換將時域圖轉(zhuǎn)換為頻域圖（質(zhì)譜圖）現(xiàn)在是19頁\一共有33頁\編輯于星期五MALDI-TOF-MS質(zhì)譜的分析步驟2.樣本被激光電離形成多肽離子混合物

Pulsedlaser3.多肽離子在TOF管里飛行，飛行速度取決于多肽離子的M/Z的大小1.基質(zhì)與多肽樣本共同置于剛靶上5.檢測到每個離子的M/Z后，同一張圖譜上計(jì)算機(jī)輸出每個肽段M/Z，即蛋白質(zhì)的多肽圖譜，通過與理論數(shù)據(jù)庫中的肽圖片比對，從而鑒定蛋白4.到達(dá)檢測器的離子，通過檢測器檢測出每個肽段離子的M/ZTimeFlighttubeHighvacuumHighvoltage20-25kV現(xiàn)在是20頁\一共有33頁\編輯于星期五現(xiàn)在生物質(zhì)譜主要在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中承擔(dān)以下任務(wù)：（1）通過精準(zhǔn)的質(zhì)量分析器來測定蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確分子量或檢測肽指紋譜（2）通過CID、CAD、PSD等串級方式對肽段進(jìn)行序列測定（3）對蛋白質(zhì)巰基及二硫鍵進(jìn)行定位（4）對蛋白質(zhì)翻譯后修飾狀況進(jìn)行定位（5）檢測生物分子相互作用及非共價化合物現(xiàn)在是21頁\一共有33頁\編輯于星期五生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的利用1.蛋白質(zhì)的定性分析依據(jù)分析對象是整體蛋白質(zhì)混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白質(zhì)組的定性分析方法分為自下向上法（bottom

up，針對多肽混合物）和自上向下法(top

down，針對整體蛋白質(zhì)混合物)。

依據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中是否存在所鑒定的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組的定性分析方法進(jìn)一步分為：對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中含有待鑒定的蛋白質(zhì)，包括：肽質(zhì)量指紋譜法（PMF，適合于簡單蛋白質(zhì)混合物)；肽序列標(biāo)簽法（PST，適合于復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物）

。對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中不存在待鑒定的蛋白質(zhì)，采用從頭測序法（de

novo）

現(xiàn)在是22頁\一共有33頁\編輯于星期五Schematicshowingthetop-downandbottom-upapproachestoproteinanalysisandidentification.Inthetop-downapproach,theintactproteinisfragmentedinthegas-phasetocreatesequence-specificfragmentionstoaidinsequenceanalysis.Thebottom-upapproachusesproteolyticenzymestocreatepeptidesforsequenceanalysisusuallybyusingmultidimensionalliquidchromagoraphyincombinationwithtandemmassspectrometry現(xiàn)在是23頁\一共有33頁\編輯于星期五

自頂向下策略是以蛋白質(zhì)分子整體作為分析對象，通過蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋（peptide

mass

fingerprinting,PMF）對蛋白進(jìn)行鑒定的方法。為了有效地克服質(zhì)量簡并的現(xiàn)象，減少搜索目標(biāo)的范圍，一般選擇高精度和高分辨率的質(zhì)譜，如傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（2ppm，50000）。該策略具有較高的序列覆蓋度和翻譯后修飾特征的保持，適合于翻譯后修飾及特殊的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的分析。不足的是，(1)實(shí)驗(yàn)樣品蛋白質(zhì)需要高度純化；(2)在目前的實(shí)驗(yàn)條件下，較難分析大分子量的蛋白質(zhì)。

自底向上策略,

稱之為鳥槍法,

是利用串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，即肽碎片指紋（peptide

fragment

fingerprinting，PFF）來鑒定肽段序列，然后再推斷組裝樣品中包含的蛋白質(zhì),

是常用的高通量分析策略。由于肽碎片攜有呈幾何增長的組合信息，可以消除質(zhì)量簡并之憂，對質(zhì)譜的質(zhì)量分辨率要求不高，多用于對復(fù)雜樣品的混合物進(jìn)行高通量分析?，F(xiàn)在是24頁\一共有33頁\編輯于星期五成功鑒定樣品酶解酶解片斷一級質(zhì)譜PMF肽指紋圖譜串聯(lián)質(zhì)譜對庫檢索序列數(shù)據(jù)庫PSMs及后篩選De-novo序列分析未知蛋白蛋白質(zhì)鑒定流程現(xiàn)在是25頁\一共有33頁\編輯于星期五定性蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺現(xiàn)在是26頁\一共有33頁\編輯于星期五2.蛋白質(zhì)的定量分析

定量蛋白質(zhì)組學(xué):把一個基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個復(fù)雜體系中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確地定量和鑒定

原理：對于具有相同離子化能力的蛋白質(zhì)或多肽可以通過比較質(zhì)譜峰的強(qiáng)度或峰面積得到待比較蛋白質(zhì)的相對量

現(xiàn)在是27頁\一共有33頁\編輯于星期五方法

1.直接進(jìn)行比較，包括SDS、2DE、HPLC;2.標(biāo)記方法，包括同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽（ICAT、iTRAQ）、元素標(biāo)記親和標(biāo)簽（ECAT）、酶促18O標(biāo)記、DYGE技術(shù)和同位素氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)記（SILAC)現(xiàn)在是28頁\一共有33頁\編輯于星期五例：iTRQA試劑結(jié)合生物質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)組的相對定量方法(1)試劑的反應(yīng)基團(tuán)（