細菌耐藥研究的進展及對策0004051chmjampc抗生素時代細菌耐藥性的問題“ThewarofHumanVsBacteria”Whowillbethelastwinner？“生命總會找到出路”摘自“失落的世界”0004052chmjampc1940-1960年 青霉素時代 1953年耐藥率達80%1960-1978年 廣譜青霉素和1,2代 1970s出現(xiàn)攜帶多種耐藥基因的菌株 頭孢菌素時代 產(chǎn)頭孢菌素酶的不動桿菌廣泛流行

1978-1995年 廣譜-內(nèi)酰胺類時代 細菌產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBLs和 第3，4代頭孢菌素 BushI型-內(nèi)酰胺酶，細菌對三代 單環(huán)內(nèi)酰胺類 頭孢菌素和單環(huán)內(nèi)酰胺類耐藥

-內(nèi)酰胺酶抑制劑 碳青霉素類1995-2000年 ？？ 全球范圍內(nèi)產(chǎn)誘導酶的腸桿菌對 頭孢他啶和頭孢噻肟的耐藥率高 達20-70%控制細菌耐藥不能單純依靠研制和開發(fā)新型抗生素MedeirosAA,etal.ClinInfectDis.1997;24(Suppl):S19-45SentryStudy2000-內(nèi)酰胺類抗生素及其耐藥菌發(fā)展史0004053chmjampc耐萬古霉素腸球菌和金葡菌。耐青霉素肺炎鏈球菌。多重耐藥的結(jié)核菌。產(chǎn)ESBLs和AmpC酶菌多重耐藥的嗜麥芽窄食單胞菌。多重耐藥的綠膿桿菌。人類征服耐藥將面臨著長期艱巨的任務(wù)。根本的辦法是合理有效使用抗生素，加強耐藥菌的分子流行病學監(jiān)控，及時阻斷耐藥菌傳播0004055chmjampc細菌耐藥機制1. 產(chǎn)生滅活酶：1) 內(nèi)酰胺酶(最大的一類)2) 氨基甙鈍化酶等2. 靶位改變:PBP的數(shù)量或結(jié)構(gòu)改變3.低通透性屏障作用1) 膜通透性下降2) 生物被膜4. 主動泵出(activeeffluxprocess)5. 細菌缺乏自溶酶，對抗菌藥物產(chǎn)生耐受0004056chmjampc蛋白通道：

綠膿桿菌、克雷伯菌屬、在細菌細胞外膜，不同藥物有各自不同的通道，藥物通過時通道可關(guān)閉。

脂多糖細胞外膜、細胞壁細胞膜OprD23/31/2023主動外排作用(反泵作用)：

將范圍極其廣泛的結(jié)構(gòu)不相關(guān)的抗生素或其他有毒物質(zhì)排出細胞外，以減少藥物在細胞周質(zhì)的積累，從而使細菌產(chǎn)生固有耐藥性。

1.經(jīng)典:細胞質(zhì)細胞周質(zhì)

2.穿過細胞內(nèi)膜及外膜2細胞外膜、細胞壁細胞膜13/31/2023綠膿桿菌有多藥泵出系統(tǒng)，至少有17種多藥泵

常見4種外排系統(tǒng)：MexAB-OprM，MexXY-OprM，MexCD-OprJ，MexEF-OprN

1.綠膿桿菌MexA（連接蛋白）,MexB（轉(zhuǎn)運蛋白）-OprM（外膜通道）外排系統(tǒng)。

藥物藥物細菌泵（綠膿熒光素.環(huán)丙沙星.四環(huán)素.氯霉素。與抗生素多重耐藥有關(guān)）3/31/20232.綠膿桿菌MexC,MexD-OprJ外排系統(tǒng)。

藥物藥物細菌泵（b-內(nèi)酰胺類）3/31/2023綠膿桿菌外膜泵的表達和抗生素的耐藥性菌株泵 MIC(ug/ml)

PAM MexABMexBCMexEF

LevoFepCpoCarbAztr1275---------0.03

0.1250.250.50.251020(wt)+ --- --- 0.1250.516421032+++------1

44256161438 ++++++--- 2.0 416256162281+++---- +++ 4-844256162303 +++ ++++++4-8481288ModifiedfromLeeet.alJ.Bacteriol200000040513chmjampc生物膜形成：

綠膿桿菌克雷伯菌屬細菌形成黏液樣物質(zhì)（藻酸鹽）保護細菌不受藥物作用且避免吞噬細胞吞噬，長期潛伏在病灶處。藻酸鹽

綠膿桿菌3/31/2023生物被膜的耐藥機制1.彌散屏障2.延緩生長3.各區(qū)域生物被膜細胞不同耐藥基因的表達00040515chmjampc內(nèi)酰胺酶---最主要的滅活酶1. 到目前已發(fā)現(xiàn)200多種；2. 新的種類不斷發(fā)現(xiàn)；3. 對內(nèi)酰胺類抗生素造成威脅。00040517chmjampcB-內(nèi)酰胺酶分類按結(jié)構(gòu) 功能 活性 棒酸[Ambler][Bush]頭孢噻肟 氨曲南 IMP抑制

A 2a - - - ++ 2b - - - ++

2be ++ ++ - ++ 2br - - - - 2c - - - + 2e ++ ++ - ++

.2f+ ++ ++ +

C1 + + - - D 2d - - - +/- ? 4 v - - -

B 3 ++ - ++ -00040518chmjampc針對內(nèi)酰胺酶的對策1. 側(cè)鏈加笨重的基因(Bulkychain)：一代三代2. 復合制劑：酶抑制劑只解決了部分問題3. 發(fā)現(xiàn)新的抗菌藥物---碳氫酶烯類等4. 正確使用抗菌藥物00040519chmjampcESBLs的發(fā)現(xiàn)和流行1982年英國發(fā)現(xiàn)一株耐頭孢他啶的產(chǎn)酸克雷 伯菌，與TEM-1相比僅有一個氨基酸的差異1983年德國發(fā)現(xiàn)首例ESLBs的臭鼻克雷伯菌(SHV-2)，與SHV-1相比，僅有一個氨基酸的差異1992年法、英、葡醫(yī)院分離出的KP中有14%~16%產(chǎn)ESBL，而在EC中的比例僅為0.1%00040521chmjampcESBLs的發(fā)現(xiàn)和流行1992~1996，美國一醫(yī)院的EC和KP的檢出率分別為1%和4%；1996年另兩家醫(yī)院ESBL的檢出率分別是35%和42%ESBL除南極洲外均有發(fā)現(xiàn)。歐洲以TEM-3為主，美國以TEM-10,12,16為主，而SHV-2,5似乎世界內(nèi)流行1997年瑞士發(fā)現(xiàn)SHV亞型韓國報道存在產(chǎn)SHV-11,2的細菌90年代以來，已成為全球性問題00040522chmjampcESBLs的發(fā)現(xiàn)和流行香港：90年：ECO(1.6%)KL-(2.8%)EN-(24.1%) 95年：ECO(2.6%)KL-(10.8%)EN-(22.7%)廣州：95年：ECO，KPN(5%，ICU，默沙東)96年：ECO(18%)KPN(19%)EN-(16%)98年：ECO(40%)KPN(38%)EN-(38%)

2000年后？00040523chmjampcESBL基本概念細菌一旦產(chǎn)生此類酶，臨床上對所有青霉素類、頭孢類和單酰胺類抗生素耐藥，而對碳青霉烯類和頭霉烯類較為敏感對酶抑制劑敏感00040525chmjampcESBLs的基本概念主要由克雷伯菌和大腸埃希菌產(chǎn)生；為絲氨酸蛋白酶衍生物，水解內(nèi)酰胺環(huán)體外試驗：對三代頭孢和氨曲南抑菌環(huán)縮小，但不一定在耐藥范圍加入克拉維酸可使抑菌環(huán)擴大臨床對內(nèi)酰胺類耐藥，對碳青霉烯類和頭霉烯類藥物敏感由質(zhì)粒介導，往往由普通的內(nèi)酰胺酶基因(TEM-1、TEM-2、SHV-1)突變而來，能水解氧亞氨基-b-內(nèi)酰胺抗生素，目前已有1百多種，多重耐藥00040526chmjampc廣譜酶(TEM-1，TEM-2，SHV-1)主要滅活青霉素和窄譜頭孢菌素(一、二代頭孢)，三代頭孢菌素對其穩(wěn)定

ESBLs能分解三代頭孢(頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢曲松)以及單環(huán)酰胺類的氨曲南，但大多數(shù)產(chǎn)ESBLs菌株對復合制劑(如特治星、舒普深)敏感，幾乎所有產(chǎn)ESBLs菌株對泰能敏感產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥特點00040529chmjampc

頭孢他啶可以選擇出產(chǎn)生ESBLs的菌株產(chǎn)生ESBL的病人53%曾經(jīng)在前一個月使用過頭孢他啶在ESBL爆發(fā)流行之前頭孢他啶的用量是以前的六倍頭孢他啶治療中性粒細胞減少性發(fā)熱的兒科腫瘤病房發(fā)生ESBL爆發(fā)流行

AnnInternMed1993選擇產(chǎn)生ESBLs的危險因素00040530chmjampc

ESBL基因型已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了150多種TEM 65SHV 38OXA 15CTX-M 23其他型 1000040531chmjampc產(chǎn)ESBL的大腸桿菌、克雷伯菌的敏感性*抗生素 大腸桿菌

克雷伯菌屬

ESBL(+) ESBL(-) ESBL(+) ESBL(-)菌株數(shù) 71 172 44 106泰能 100 100 100 100美唑 88 92 94 86西叮 70 83 86 60他啶 76 95 90 97吡肟 89

94

88

97氨曲南 9 93 21 90噻肟 1 91 0 89曲松 2 93 0 93*數(shù)據(jù)來源于協(xié)和醫(yī)院ddstmethod00040532chmjampc產(chǎn)ESBL大腸、克雷伯的敏感性*（%）抗生素 Eco.

Kpn

ESBL(+) ESBL(-) ESBL(+) ESBL(-)菌株數(shù) 71 172 44 106

阿米 85 94 82 99舒普深 19 94 42 95派拉 0 35 0 63特治星 56 89 79 91特美叮 7 63 20 83環(huán)丙 20 44 75 86*數(shù)據(jù)來源于協(xié)和醫(yī)院00040533chmjampcESBLs檢測、判斷和臨床辨認00040534chmjampcESBLs檢測的原理和方法ESBLs能水解三代頭孢及氨曲南酶抑制劑能抑制ESBLsESBLs的檢測方法

雙紙片法、三維試驗法、肉湯稀釋法、Vitek-AMS法、E-test法、抑制劑增強的紙片擴散法和肉湯稀釋法00040535chmjampcDefinitionbyNCCLSin2001Diminishedzones,whichshouldbesuspectedofharboringanESBL,around:Ceftazidime ≤22mm，Cefpodoxime ≤22mm,Aztreonam ≤27mmCefotaxime ≤27mm，ceftriaxone ≤25mmThesezonediametershouldincreaseinthepresenceofclavulanicacid00040536chmjampc查K.Pneumoniae,K.oxytoca&E.coli菌中的ESBLs（初步篩選法)

培養(yǎng)基：CAMHB抗生素濃度： 瓊脂內(nèi)頭孢泊肟 1ug/mlor頭孢他啶 1ug/mlor氨曲南 1ug/mlor頭孢噻肟 1ug/mlor頭孢曲松 1ug/mlor使用2種以上的抗生素可以提高檢測的敏感性00040537chmjampc第1級方法00040538chmjampc產(chǎn)ESBL大腸、克雷伯的敏感性*（%）

進一步分析雙紙片協(xié)同法:圓心間距離：20mm25mm30mm距20~30mmCTXAugmentin00040539chmjampc產(chǎn)ESBL大腸、克雷伯的敏感性*（%）

進一步分析紙片確證法CAZ，CAZ+ClavCTX，CTX+ClavCTXCTX+Clav兩圈差距>=5mm81400040540chmjampc第2級方法00040541chmjampc產(chǎn)ESBL大腸、克雷伯的敏感性*（%）

進一步分析MIC確證法加棒酸后MIC降低8倍,16/2＝8.12.25.512481632ug/ml＝不長＝長00040542chmjampcEtest法(頭孢噻肟+克拉維酸噻肟)

1：8頭孢噻肟+克拉維酸噻肟MIC=0.5MIC=4.000040543chmjampc第3級方法00040544chmjampc鑒定大腸桿菌及肺炎克雷伯菌中的beta-內(nèi)酰胺酶的流程Sanders,AAC，1999，43(6):1393-1400. MIC值(ug/ml)產(chǎn)酶類型 噻肟 噻肟/棒酸 曲松 曲松/棒酸 臨床驗證非ESBL <2 22/22OBL非ESBL

>2 <0.5

1/36ESBLESBL >2 降>8倍 36/36

ESBL. >2 >0.5 降>8倍 36/36ESBL

00040545chmjampc鑒定腸桿菌、枸櫞酸桿菌中的beta-內(nèi)酰胺酶的流程Sanders,AAC，1999，43(6):1393-1400.MIC值(ug/ml) 臨床驗證產(chǎn)酶類型 頭孢曲松 曲松/棒酸

其他B-內(nèi)酰胺酶 <=4 14/15非ESBLESBL >8 降>8倍 15/16ESBL 00040546chmjampcESBLs的辯認:耐藥性特點腸桿菌科細菌，尤其大腸,克雷伯菌對一個或多個三代頭孢敏感性下降常伴有氨基甙,喹諾酮協(xié)同耐藥頭孢呋新耐藥酶抑制劑,頭孢西丁部分有效亞胺培南敏感臨床治療效果不好00040547chmjampcESBLs的治療對策(1)頭孢菌素：(1) 三代頭孢菌素：CTX和CAZ耐藥率高.(2) 四代頭孢菌素：耐藥率不很高，對部分ESBLs（如CTX型）穩(wěn)定。

00040548chmjampcESBLs的治療對策(2)頭霉素類和碳氫霉烯類：ESBLs雖然不能水解頭霉素FX，但MIC90值為≥256g/ml，耐藥率為16%，可能是由于細菌外膜孔蛋白的缺失造成的。所有產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs細菌對IP敏感，證實了碳氫霉烯類是目前對產(chǎn)ESBLs細菌最穩(wěn)定的內(nèi)酰胺抗菌藥物。00040549chmjampcESBLs的治療對策(3)含酶抑制劑的復合制劑：耐藥率較低，分別為8%和2%，但中度敏感率較高，分別為22%和28%，可能是這些細菌同時產(chǎn)生一定量的TEM-1和SHV-1而造成對復合制劑耐藥程度的增加。在用復合制劑來治療產(chǎn)ESBLs細菌感染時需適當增加劑量。近年來對酶抑制劑耐藥的ESBLs的出現(xiàn)對復合制劑構(gòu)成威脅，需開發(fā)新抑制劑。00040550chmjampcESBLs的治療對策(4)喹諾酮類和氨基糖甙類

產(chǎn)ESBLs細菌對AK的耐藥率達42%，對CI的耐藥率更高，達70%，說明這兩類藥物不適于產(chǎn)ESBLs菌株感染的治療，除非有藥敏資料證實是敏感的，且只能聯(lián)合用藥。00040551chmjampc

ESBL(＋)菌株的治療建議加酶抑制劑的復合藥：哌拉西林/三唑巴坦頭孢哌酮/舒巴坦 嚴重感染碳青霉烯類：美羅培南，亞胺培南頭孢吡肟和頭孢他啶體外顯示敏感，國外證明頭孢吡肟臨床療效和細菌清除率>80%，數(shù)據(jù)2003年NCCLS將修改。三代頭孢菌素、頭霉素類是不安全的，不適于產(chǎn)ESBL菌株感染的治療；阿米卡星和環(huán)丙沙星不適于產(chǎn)ESBLs菌株感染的治療，尤其是環(huán)丙沙星，除非體外藥敏實驗證明是敏感的

00040552chmjampcESBL的臨床預后高死亡率

在一項兒童腫瘤患者的研究中，由產(chǎn)ESBLs細菌所致的感染引起或直接導致了15%的患者死亡。在一次醫(yī)院內(nèi)爆發(fā)流行，在可提供治療及預后資料記錄的患者中的初步死亡率達53%高比例持續(xù)性定殖

在一群已定殖產(chǎn)ESBL菌株數(shù)月的兒童腫瘤患者中，重新篩選檢查發(fā)現(xiàn)其中60%患者持續(xù)出現(xiàn)無癥狀性細菌尿00040553chmjampcAmpC酶由ampC基因編碼產(chǎn)生，ampC基因表達同時受ampD，ampR，ampG等多種基因調(diào)控，是頭孢菌素酶的代表酶，屬于染色體Bush1型酶或AmblerC類酶。常見的易產(chǎn)AmpC酶的細菌：陰溝腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌粘質(zhì)沙雷菌 弗勞地枸櫞酸桿菌,摩根摩根菌綠膿桿菌什么是AmpC酶？00040554chmjampcAmpC酶水解以下抗生素：青霉素類 耐藥頭霉素類 耐藥1,2,3代頭孢菌素類 耐藥 單環(huán)類 耐藥加酶抑制劑復合藥（克拉維酸，舒巴坦，他唑巴坦）耐藥可分為誘導型，結(jié)構(gòu)型和質(zhì)粒型。

什么是AmpC酶？00040555chmjampc頭孢菌素酶誘導型+

-AmpR激活子ampC激活轉(zhuǎn)錄AmpC-lactamasPBPsAmpG感受器或跨膜轉(zhuǎn)運阻斷細胞壁五肽交聯(lián)橋（肽聚糖片斷）中間產(chǎn)物（配體）AmpD循環(huán)利用內(nèi)膜外膜00040556chmjampc+

-AmpR激活子ampC激活轉(zhuǎn)錄去阻遏持續(xù)高產(chǎn)或高度誘導型AmpC-lactamasPBPsAmpG阻斷細胞壁五肽交聯(lián)橋（肽聚糖片斷）中間產(chǎn)物缺陷AmpD蛋白

內(nèi)膜外膜調(diào)節(jié)基因ampD突變頭孢菌素酶結(jié)構(gòu)型00040557chmjampc5種抗生素對60株耐頭孢他啶的

腸桿菌屬和枸櫞酸桿菌屬的活性S%00040558chmjampc6種抗微生物藥對

109株腸桿菌屬的活性藥名 敏感％ 耐藥％MIC50MIC90

亞胺培南100 0 0.324頭孢吡肟 896 0.38 12頭孢哌酮/舒巴坦69 16 296頭孢他啶64 28 2 512 頭孢曲松5535 2512哌拉西林 51 46 16 512

YingchunXu,MinjunChenetal.DiagnMicrobiolInfectDis1999;35:135-142

00040559chmjampc14株陰溝腸桿菌耐藥株對10種抗生素的MIC（g/ml）

菌株 哌拉 哌唑 噻肟 曲松 他啶 曲南 吡肟 亞培 慶大 1 64 16 32 128 128 32 0.25 0.5 0.5

2 512 64 256 256 128 128 4 0.125 0.5

5 128 64 128 128 128 64 4 2

32 6 64 32 64 64 128 64 0.5 0.125 0.5

8 512 64 256 512 256 64 4 0.125 0.5

13 512 64 256 256 256 64 4 0.125 0.5

14 256 32 128 256 128 64 2 0.125 0.5

18 256 64 128 128 128 64 4 0.25 0.25

19 128 16 64 256 128 32 0.5 0.25 4

20 128 32 256 256 128 32 2 0.125 1

23 512 128 128 256 256 64 4 0.25

32 24 128 16 128 256 128 64 0.5 0.25 0.25

25 256 64 128 256 128 64 2 0.25 0.25

27 512 128 256 512 256 128 4 0.25 0.25

ESBLAmpC－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋吳偉元，陳民鈞等。中國臨床藥理學雜志，2001,70:104-10900040560chmjampc

90％的基因與陰溝腸桿菌的AmpC同源肺炎克雷伯菌質(zhì)粒介導的MIR－1酶傳播水解：頭孢西丁頭孢他啶頭孢噻肟頭孢曲松1988年美國Papanicolaou

質(zhì)粒型AmpC酶00040561chmjampc00040562chmjampc如何推測大腸桿菌和肺炎克雷伯菌產(chǎn)生質(zhì)粒AmpC酶？頭孢西丁或頭孢美唑 R三代頭孢菌素 R/I/S加酶抑制劑類 R/I/S頭孢吡肟 S碳青霉烯類 S00040563chmjampcESBL與AmpC的差別

ESBL高產(chǎn)AmpC質(zhì)粒AmpC SSBL 酶＋膜蛋白

碳青霉烯類 S S

S S

R頭孢吡肟 S/I/R

SS