1第三章

離心技術(shù)及儀器centrifugaltechniqueandcentrifuge2經(jīng)典的分離分析技術(shù)：離心技術(shù)、電泳技術(shù)、光譜技術(shù)、色譜技術(shù)3

離心現(xiàn)象是指物體在離心力場中表現(xiàn)的沉降運動現(xiàn)象。應用離心沉降進行物質(zhì)的分析和分離的技術(shù)稱為離心技術(shù)（centrifugaltechnique）,實現(xiàn)離心技術(shù)的儀器是離心機（centrifuge）。前言概念:56第一節(jié)離心技術(shù)原理第二節(jié)離心機結(jié)構(gòu)第三節(jié)離心方法第四節(jié)高、超速離心技術(shù)

主要內(nèi)容7教學基本要求1.掌握離心技術(shù)的基礎(chǔ)原理，常用的離心方法.2.熟悉離心機的分類與結(jié)構(gòu)，各種離心機的臨床應用3.了解離心機的維護、離心方法的進展9重力時間當懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用可使得其中懸浮的顆粒逐漸下沉，下沉的速度與微粒的大小、形態(tài)、密度、重力場的強度及液體的黏度有關(guān)。如紅細胞顆粒，直徑為數(shù)微米，可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過程。此外，物質(zhì)在介質(zhì)中沉降時還伴隨有擴散現(xiàn)象。重力沉降：混合液靜置一段時間后10擴散現(xiàn)象

擴散是由于微粒的熱運動而產(chǎn)生的質(zhì)量遷移現(xiàn)象,主要是由于密度差引起的。對小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質(zhì)等，它們在溶液中成膠體或半膠體狀態(tài)，僅僅利用重力是不可能觀察到沉降過程的，因為顆粒越小，與溶液密度越相近，擴散現(xiàn)象則越嚴重，而沉降越慢。

擴散現(xiàn)象是不利于樣品分離的，如果加大重力，就可能克服擴散現(xiàn)象的不利影響,實現(xiàn)生物大分子的分離。

11離心沉降：在離心機中，離心管（centrifugetube）放于離心轉(zhuǎn)頭里，當離心機開動時，離心管繞離心轉(zhuǎn)頭的軸旋轉(zhuǎn)，作圓周運動，在離心管內(nèi)的樣品顆粒將同樣運動。13在離心力場中加速度達到數(shù)萬甚至數(shù)十萬倍重力加速度時，顆粒的沉降也加快了同樣的倍數(shù)。這就使得許多在重力場中不能沉降的細小顆粒及密度較低的物體組份能用離心技術(shù)進行分離純化。5ml血液離心5分鐘血漿血細胞14離心機工作原理:懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而使溶液得以分離、濃縮和提純，顆粒的沉降速度取決于離心機的轉(zhuǎn)速、物質(zhì)的沉降系數(shù)、顆粒的質(zhì)量、大小和密度。血漿試管離心沉降物血液15一、離心力當物體所受外力小于運動所需要的向心力時，物體將向遠離圓心的方向運動。物體遠離圓心運動的現(xiàn)象稱為離心現(xiàn)象。也叫離心運動。離心運動是由于向心力消失或不足而造成的。

旋轉(zhuǎn)離心力離心運動：17二、相對離心力(relativecentrifugalforce，RCF)

相對離心力是指在離心力場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”。

由于各種離心機轉(zhuǎn)子的半徑或離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力也不同,因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力,例如25000×g,表示相對離心力為25000。只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結(jié)果。一般情況下,低速離心時相對離心力常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示，高速離心時則以“g”表示。=1.118×10-5×(rpm)2×rg為地球重力加速度(980cm·sec-2)18通常稱離心管頂部到旋轉(zhuǎn)中心的距離為最小離心半徑rmin，該處承受的離心力場為最小離心力場；稱離心管底部到旋轉(zhuǎn)中心的距離為最大離心半徑rmax，該處承受的離心力場稱為最大離心力場。最小離心半徑最大離心半徑在計算時規(guī)定旋轉(zhuǎn)半徑均用平均半徑“Rav”代替：19三、沉降系數(shù)微粒(分子)的沉淀性質(zhì)以沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient，S)表示，其量綱為秒(s)。1924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義為：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。積分得:(X1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離)

若ω用2πn／60表示，則:定義10-13s為一個Ｓvedberg單位，即１Ｓ＝10-13s。21Fc=FB+Ff

+FKFc：離心力FB：由離心力場所引起的浮力Ff：摩擦阻力FK:擴散作用力

Fc=FB=Ff=f·(dx/dt)（f為摩擦系數(shù)，單位是g/s)FbFgFBFf沉降速度的推導方法:代入上式得：dx/dt=縱向力橫向力Fc-fFK22第二節(jié)離心機構(gòu)造一、各式離心機的主要結(jié)構(gòu)裝置二、驅(qū)動部分三、制冷和溫度控制四、離心機的主要類型23離心機的主要構(gòu)件組成:驅(qū)動電機制冷系統(tǒng)(高速離心機)真空系統(tǒng)(超離離心機)

顯示系統(tǒng)自動保護系統(tǒng)控制系統(tǒng)必要配件:離心轉(zhuǎn)頭和離心管25一、各式離心機的主要結(jié)構(gòu)裝置26二、驅(qū)動部分(一)轉(zhuǎn)頭室轉(zhuǎn)頭室的設(shè)計要求:安全、密閉、隔熱①應具有一定的強度，外有防護鋼板，保證內(nèi)部破裂飛濺物不能擊穿飛出。②達到高速旋轉(zhuǎn)時，自動鎖定，不能人為地開啟。③有隔熱保護屋。④有蒸發(fā)盤管組成的內(nèi)室壁，壁的材質(zhì)為不銹鋼的，便于清潔消毒和耐蝕。⑤有真空裝置的轉(zhuǎn)頭室，對室蓋、電機軸與轉(zhuǎn)室交換處設(shè)有密封裝置，保證轉(zhuǎn)頭室具有良好的密封性。29(二)驅(qū)動電機多為串激式,包括定子和轉(zhuǎn)子兩部分30(三)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)系統(tǒng)1．交流變頻調(diào)速將逐步取代直流調(diào)速2．多功能、自動化和微機控制31三、制冷和溫度控制１．制冷系統(tǒng)高超速離心機和一部分低速大容量制備用離心機配置2．溫度控制轉(zhuǎn)頭室內(nèi)的溫度由測溫元件完成,如蒸汽壓力式溫度表、半導體熱敏電阻和紅外線遙感元件。測溫元件感測到的信號，通過放大器放大來控制制冷系統(tǒng)32四、離心機的主要類型根據(jù)用途：分析型、制備型、分析－制備型根據(jù)操作方式：間歇、連續(xù)和半連續(xù)

根據(jù)分離形式：沉降式和過濾式

根據(jù)離心機轉(zhuǎn)速：分常速(低速)、高速和超速

根據(jù)結(jié)構(gòu)特點：管式、吊籃式、轉(zhuǎn)鼓式和碟式

根據(jù)是否冷凍：高速冷凍離心機、大容量冷凍離心機33制備性離心機:

用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大

分析性離心機:

一般都帶有光學系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)341.制備性離心機:

根據(jù)轉(zhuǎn)速常速（低速）高速超速rpm

500010000~25000＞25000ＲＣＦ6000×g89000×g＞89000×g適用分離對象細胞微生物菌體、大細胞器亞細胞器、病毒和和細胞碎片等

生物大分子等352.分析性離心機:都是超速離心機使用了特殊設(shè)計的轉(zhuǎn)頭和光學檢測系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程，從而確定其物理性質(zhì)在分析離心杯中物質(zhì)沉降情況時，在重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個折射的透鏡，結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)生了一個“峰”，由于沉降不斷進行，界面向前推進，因此峰也移動，從峰移動的速度可以計算出樣品顆粒的沉降速度。36第三節(jié)離心方法一、分離離心法二、分析離心法三、普通低速離心機使用的注意事項37離心方法分類：差速離心法密度梯度離心方法速率區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法分離離心方法分析離心方法：監(jiān)測沉降過程，研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)38一、分離離心法又稱制備離心法，包括差速離心法和密度梯度離心法391．差速離心法

是以不同離心力來分離不同質(zhì)（沉降系數(shù)）的微粒的一種動力學方法，因不同的粒子在同一離心條件的離心力場中沉降速度不同，若不斷增加相對離心力，一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子將分步沉淀。原理：速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

40用差速離心法分離已破碎的細胞各組份

特點及應用：

特點：分辨率不高；離心次數(shù)多，操作繁雜；產(chǎn)品的純度和回收率都達不到理論值。應用：用于組織勻漿液中細胞器和病毒的分離及其他分離手段之前的粗制品提取。如破碎細胞各組分(細胞核、細胞膜碎片、線粒體、溶酶體、核糖體)的沉淀分離。412．密度梯度離心法原理：將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。

分類：依據(jù)離心分離原理。（連續(xù)密度梯度離心法）

（不連續(xù)密度梯度離心法）

42(1)速率區(qū)帶離心法原理：

在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)(如蔗糖)，把待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，與梯度液一起離心。靠近旋轉(zhuǎn)軸處的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠處的介質(zhì)密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度。

這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達到彼此分離的目的。

43梯度液（聚蔗糖(ficoll)、硅溶膠(pereoll)及蔗糖(sucrose)）在離心過程中以及離心完畢后，取樣時起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。44特點及應用：特點：分辨力高，但離心時間要嚴格控制。應用：速率區(qū)帶離心法是一種動力學方法，適用于測定生物大分子顆粒的沉降系數(shù)。速率區(qū)帶離心是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般應用于物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。45(2)等密度區(qū)帶離心法原理：根據(jù)樣品組分的密度差別進行分離純化，一般是將待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合

，密度梯度液柱的密度范圍很大，液柱底部的密度明顯大于樣品組分的密度。如果樣品中有幾個密度不相同的組分，它們將分別集中于密度梯度液柱中相應的密度位置上，形成幾個分離的區(qū)帶，收集各個區(qū)帶即得到各個提純的組分。46分辨力高，耗時。是一種測定生物大分子或顆粒的浮力密度的靜力學方法。此法一般應用于物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時，如分離核酸、亞細胞器等，也可以分離復合蛋白質(zhì)，簡單蛋白質(zhì)不適用。梯度介質(zhì)通常為氯化銫(CsCl)特點及應用：47二、分析離心法目的:

為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專門收集某一特定組分。方法:

使用特殊的轉(zhuǎn)子和檢測手段，連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程

沉降速度法沉降平衡法等密度區(qū)帶分析離心法48特點:在短時間內(nèi)，用少量樣品就可以得到一些重要信息確定生物大分子是否存在、其大致的含量計算生物大分子的沉降系數(shù)結(jié)合界面擴散，估計分子的大小，檢測分子的不均一性及混合物中各組分的比例測定生物大分子的相對分子質(zhì)量檢測生物大分子的構(gòu)象變化49三、普通低速離心機使用的注意事項穩(wěn)定平衡限速清潔50第四節(jié)高、超速離心技術(shù)一、高、超速離心機的組成及特點二、高、超速離心機的機型介紹和應用三、超速離心在醫(yī)學中的應用

四、高、超速離心機操作的注意事項

51一、高、超速離心機的組成及特點1．高、超速離心機的驅(qū)動裝置2．高、超速離心機的溫度控制3．超速離心機的真空系統(tǒng)4．高、超速離心機的轉(zhuǎn)頭5．高、超速離心機離心管的選用速度控制系統(tǒng)過速保護系統(tǒng)