第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞制藥基礎(chǔ)知識(shí)一、動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核亞細(xì)胞器無(wú)細(xì)胞壁第十二章單克隆抗體二、動(dòng)物細(xì)胞代謝葡萄糖和谷氨酰胺提供能量和合成代謝的前體葡萄糖受限谷氨酰胺谷氨酰胺：氮源，受限，消耗其他氨基酸葡萄糖代謝：進(jìn)入糖酵解途徑，大部分分解為丙酮酸乳酸，分泌到胞外（積累）丙酮酸還可以轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進(jìn)入TCA循環(huán)，徹底氧化為CO2和水

4%-8%的少部分葡萄糖進(jìn)入五糖磷酸途徑PPP，轉(zhuǎn)化為4、5、7碳糖和NADPH.5碳糖用于核酸合成，其他中間產(chǎn)物進(jìn)入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。

葡萄糖代謝旺盛，產(chǎn)生大量乳酸，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

谷氨酰胺代謝：進(jìn)入氨基酸代謝途徑，合成其他氨基酸

大多數(shù)谷氨酰胺在脫氨酶作用下，生成谷氨酸，并釋放氨，產(chǎn)生細(xì)胞毒性小部分谷氨酰胺通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖。谷氨酰胺谷氨酸還原酶α-酮戊二酸TCA能量在快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)系中，轉(zhuǎn)氨作用是主要代謝途徑：

谷氨酰胺與丙酮酸和草酰乙酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用丙氨酸和天冬氨酸葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝重疊于丙酮酸常流加葡萄糖代謝和谷氨酰胺，控制整個(gè)代謝，避免有毒廢物積累

三、動(dòng)物細(xì)胞的分類(lèi)原代細(xì)胞（primarycell):從動(dòng)物體內(nèi)直接分離得到的細(xì)胞

特點(diǎn)：生長(zhǎng)分裂不旺盛，與體內(nèi)細(xì)胞相似

傳代細(xì)胞（passagecell):原代細(xì)胞轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的細(xì)胞特點(diǎn)：分裂增殖旺盛二倍體細(xì)胞系（diploidcell):原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代、篩選、克隆、純化后，獲得的具有一定特征的細(xì)胞系。

如：W1-38,MRC-5,ZBS等有限細(xì)胞系(finitecell):生長(zhǎng)和壽命有限的細(xì)胞系，二倍細(xì)胞系特點(diǎn)：多次傳代培養(yǎng)，失去增殖能力，老化死亡（壽命取決于細(xì)胞來(lái)源的物種、年齡和器官）人細(xì)胞：50-60代，胚成纖細(xì)胞：人50代；雞胚30代；小鼠8代四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性

4.1.細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，分裂周期12～48h，易受微生物污染；4.2.動(dòng)物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大得多，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；4.3.培養(yǎng)過(guò)程需氧量少，且不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌；4.4.在機(jī)體中，細(xì)胞相互粘連以集群形式存在，培養(yǎng)過(guò)程（電荷作用，鈣鎂離子作用）具有群體效應(yīng)，錨地依賴(lài)性，接觸依賴(lài)性及功能全能性；→接觸抑制（contactinhibition）現(xiàn)象。4.5.培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)物分布于細(xì)胞內(nèi)外，反應(yīng)過(guò)程成本較高，但產(chǎn)品價(jià)格昂貴；（注：多數(shù)分泌胞外，收集純化方便，得到較完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，與天然產(chǎn)品一致）4.6.大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，不可套用微生物反應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)；有限細(xì)胞系（finitecellline）五、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基組成與制備

5.1.培養(yǎng)的環(huán)境因素

溫度（37±0.5）oC；滲透壓（生理?xiàng)l件下）260～320mOsm/Kg

氫離子濃度

7.2～7.4，接近中性（不能超過(guò)6.8～7.6）其它有機(jī)離子主要代謝物補(bǔ)充的代謝物激素影響細(xì)胞代謝的其他因素細(xì)胞生長(zhǎng)的基質(zhì)各因素間的相互作用5.2.主要因素：培養(yǎng)基組成和濃度溫度培養(yǎng)液的酸堿度

溶解氧（O2、CO2）—95%空氣，5%CO2混合氣體，氧的傳遞非常困難（40%—50%）合適各種代謝物濃度5.3培養(yǎng)基組成5.3.1.AA；5.3.2.維生素類(lèi)；VB或VB+VC

5.3.3.鹽類(lèi)Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-、HCO3-調(diào)節(jié)滲透壓酸堿平衡、酶的活性等；5.3.4.葡萄糖—能量；

5.3.5.緩沖系統(tǒng)—磷酸鹽

CO2→HCO3-；5.3.6.礦物質(zhì)—來(lái)源于血清，無(wú)血清時(shí)，補(bǔ)充Fe2+、Cu2+、Zn2+、Se2+

和其他稀有元素；5.3.7.有機(jī)補(bǔ)充物，如核苷類(lèi)，TCA循環(huán)中間產(chǎn)物、丙酮酸鹽、類(lèi)脂等；5.3.8.激素

如胰島素、生長(zhǎng)激素；5.3.9.生長(zhǎng)因子類(lèi)

各來(lái)自于血清中，存在的是一些多肽；粘附因子，如纖維結(jié)合蛋白、膠原等。

關(guān)鍵因素：葡萄糖；谷氨酰胺；能源濃度高氧氣

六、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法與操作方式

6.1細(xì)胞培養(yǎng)方式6.1.1.體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞分為兩種類(lèi)型：非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞→懸浮培養(yǎng)（anchorage-independent）→血液、淋巴組織、腫瘤細(xì)胞。6.1.2.貼壁依賴(lài)性細(xì)胞→貼壁培養(yǎng)（anchorage-dependent）→大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞（吸著于帶正電荷的固體或半固體表面上生長(zhǎng)）其生長(zhǎng)必須有給以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子（attachmentfactor）才能在該表面上生長(zhǎng)、繁殖。6.1.3.兼性貼壁細(xì)胞：如中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞。小鼠L929細(xì)胞。

貼壁培養(yǎng)

成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞等中胚層細(xì)胞。上皮細(xì)胞、皮膚細(xì)胞等外胚層細(xì)胞和內(nèi)胚層細(xì)胞。滾瓶系統(tǒng)培養(yǎng)→微載體系統(tǒng)培養(yǎng)法（攪拌罐）

（攪拌槽，中空纖維管）

粘附比率（玻璃、纖維素、明膠等增加了比表面積）。接種細(xì)胞密度104/cm2→(1～2)×105/cm2(勞動(dòng)密集型)

懸浮培養(yǎng)小規(guī)模：轉(zhuǎn)瓶或滾瓶大規(guī)模：細(xì)胞反應(yīng)器（空氣提升式、中空纖維管、攪拌槽）與微生物細(xì)胞相比較缺點(diǎn)：細(xì)胞密度較低（1～2)×105個(gè)/mL→(1～3)×106個(gè)/mL。

(操作簡(jiǎn)單、易于放大、均勻、易于控制)固定化培養(yǎng)（流化床、固定床）

6.2細(xì)胞培養(yǎng)操作方式

分批式流加式半連續(xù)式連續(xù)式灌流式注意：生物污染（其它動(dòng)物細(xì)胞、微生物、病毒）控制關(guān)鍵：實(shí)時(shí)檢測(cè)?？贵w（Antibody.Ab）是有抗原刺激機(jī)體后，由淋巴B細(xì)胞經(jīng)分化增殖的漿細(xì)胞合成的分泌的，能與響應(yīng)抗原特異結(jié)合并具有多方面免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（Immunoglobin,Ig）是只具有抗體活性或其化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。Ab與Ig是同義體，已知相應(yīng)配體的Ig稱(chēng)為抗體。

一、基本概念第二節(jié)抗體

理化性質(zhì)及免疫學(xué)特性

是機(jī)體體液免疫的主要成分

血液中（主要）環(huán)境其他體液外分泌液人的抗體分為五類(lèi)IgGIgAIgMIgDIgEIg的生化本質(zhì)：大分子蛋白；具有抗體活性；

本身帶有多種抗原決定簇，具有一定的

抗原特異性。抗原（Antigen）：誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的外來(lái)物質(zhì)。

二、抗體的分類(lèi)三、抗體條件：

1.只有脊椎動(dòng)物（魚(yú)類(lèi)以上）的漿細(xì)胞才能產(chǎn)生；2.必須要有抗原物質(zhì)的刺激；3.能與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合；4.其化學(xué)本質(zhì)是一類(lèi)具有免疫功能的球蛋白。雜交瘤技術(shù)蛋白質(zhì)工程技術(shù)（疾病治療、診斷）應(yīng)用廣泛

發(fā)展前景轉(zhuǎn)基因抗體的功能區(qū)（domain）折疊成球狀結(jié)構(gòu)（AA排列順序因抗體的特異性而異）稱(chēng)可變區(qū)（Variableregion,簡(jiǎn)稱(chēng)V區(qū)），包括3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（VH，VL）（compiementarity-determiningregion;CDR）羥基-側(cè)，AA排列順序較恒定→恒定區(qū)（constantregion,c區(qū)）H鏈上有3個(gè)C區(qū)，CH1，CH2，CH3L鏈上有1個(gè)C區(qū)，CL鉸鏈區(qū)：H鏈的中間部分肽段?！癥”→“T”互變，不結(jié)合抗原，CH2區(qū)的補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)被掩蓋。木瓜蛋白酶作用后：Fab片段：抗原結(jié)合活性和特異性，一條完整

的L鏈和H鏈的VH區(qū)以及CH1Fab片段：兩條H鏈的CH2和CH3區(qū)域Fc片段：無(wú)抗原結(jié)合活性，但是抗體結(jié)合了抗

原以后，激活機(jī)體免疫反應(yīng)的主要部位。

抗體分解的三個(gè)部分

主要激活以下免疫反應(yīng)：(1)激活補(bǔ)償功能系統(tǒng)。(2)產(chǎn)生抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)毒素。(3)可結(jié)合巨噬細(xì)胞的Fc受體，使巨噬細(xì)胞吞食并毀滅抗原—抗體復(fù)合體。根據(jù)抗體重鏈的C區(qū)（CH）的不同，將人的重鏈分為γ、μ、ε、δ和α五大類(lèi)。→形成的Ig分別稱(chēng)為IgG，IgM，IgE，IgA和IgD。

各類(lèi)Ig各司其職，共同完成的機(jī)體免疫防護(hù)任務(wù)（1）IgG最主要的免疫球蛋白，15%，

參與幾乎所有的體液免疫反應(yīng)。作用：免疫凝集、免疫沉淀、免疫調(diào)理、抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）、激活補(bǔ)體系統(tǒng)、固定細(xì)菌和中和病毒。（2）IgA機(jī)體粘膜局部防御的重要作用因素

功能：殺菌、抗病毒活性和免疫凝集作用（分泌型IgA）。（3）IgM血液中

功能：補(bǔ)體激活、防止菌血癥和敗血癥。（4）IgE

（5）IgDPcAb：親和力高，制備過(guò)程簡(jiǎn)單，用于診斷試劑，毒蛇咬傷（特殊情況）抗蛇毒抗血清（PcAb）治療優(yōu)于McAb。第三節(jié)單克隆抗體多克隆抗體（Polycolonalantibody）：同一抗原產(chǎn)生的不同抗體（含有多個(gè)抗原決定簇）單克隆抗體McAb（monocolonalantibody）：由單個(gè)淋巴細(xì)胞針對(duì)某一抗原決定簇產(chǎn)生的單個(gè)抗體。（B細(xì)胞的純培養(yǎng)）上市藥物:Reopro,Herceptin,Campath-1H,Zevalin等單抗的特點(diǎn)：

①特異性強(qiáng)②重復(fù)性好③操作簡(jiǎn)便易行（臨床診斷快速檢測(cè)等）醫(yī)學(xué)、臨床、藥理、食品檢測(cè)、生化等多個(gè)領(lǐng)域。應(yīng)用：癌癥診斷、藥物測(cè)定、傳染病診斷、臨床治療(如蛇毒等）

骨髓瘤細(xì)胞

×B細(xì)胞（myelomacell）

體外生長(zhǎng)

無(wú)限增殖

雜交瘤細(xì)胞

單克隆抗體

B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)（又稱(chēng)單克隆抗體技術(shù)）德國(guó)

Kohler科勒爾

首次利用細(xì)胞融合技術(shù)→制備出單克隆抗體英國(guó)

Milstein米爾斯坦→并完善了極微量蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)丹麥

Jerne杰恩→1984年諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)1.雜交瘤細(xì)胞系的建立1.1.免疫B淋巴細(xì)胞的制備

B淋巴細(xì)胞即期望能分泌特定抗體的細(xì)胞。1.1.1抗原

種類(lèi)不受限制。純度要求不高，在篩選時(shí)采用均一的所期望的抗原來(lái)檢測(cè)。1.1.2.免疫（1）動(dòng)物BALB/C小鼠，→BALB/C系列，C57BL/6系列。Lou大鼠

免疫時(shí)盡量采用相同的品系動(dòng)物免疫，與骨髓瘤細(xì)胞在種子上盡量一致。（2）免疫方法

應(yīng)考慮抗原的性質(zhì)、純度、制劑的選擇，因抗原而異。通常方法：體內(nèi)免疫（皮下、肌內(nèi)、腹腔免疫，適用于顆粒性抗原）脾內(nèi)免疫（來(lái)源有限，昂貴的抗原免疫，效果不好）體外免疫（分離B淋巴細(xì)胞，用于人McAb，效力不高）從脾臟或外周血中。（3）免疫程度：

基礎(chǔ)免疫一般4～6周，加強(qiáng)免疫后于融合到3～4天，靜脈加強(qiáng)。

1.4雜交瘤細(xì)胞的篩選

HAT培養(yǎng)液1～2周培養(yǎng)選擇出雜交瘤細(xì)胞

選擇出特異性抗體(ELISA法）

1.5雜交瘤細(xì)胞的去除

①克隆化96孔板稀釋法軟瓊脂培養(yǎng)法

②選擇1.6單克隆抗體的制備：①動(dòng)物體內(nèi)法：

實(shí)驗(yàn)室用（簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)），腹水濃度高2～5mg/ml,比培養(yǎng)法高1000—10000倍，對(duì)一般用途的McAb的首選方法

②體外培養(yǎng)法(工業(yè)化生產(chǎn)法):

體外培養(yǎng)法主要有以下兩種：懸浮培養(yǎng)：國(guó)際上多用，國(guó)內(nèi)尚空白。固定化培養(yǎng)：貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，移入載體。

注意：

①與雜交瘤同品系的動(dòng)物或雜交一代②注意動(dòng)物的微生物感染③腹水內(nèi)尚含非特異性抗體，需進(jìn)行純化。

1.7單克隆抗體的進(jìn)一步鑒定：

①染色體鑒定：小鼠脾細(xì)胞染色體40，小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)變異較大，62-69株②特性鑒定：親和力，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法③類(lèi)別鑒定：抗血清/雙向免疫擴(kuò)散法④純度鑒定：

SDS電泳法

第四節(jié)抗HBsAg的單克隆抗體生產(chǎn)工藝

抗乙型肝炎表面抗原（HBsAg）單克隆抗體—專(zhuān)一性識(shí)別HBsAg的單一抗體。臨床上用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的感染并用于生產(chǎn)預(yù)防乙肝的免疫制劑。生產(chǎn)技術(shù)：基因工程、細(xì)胞工程

一、工藝流程二、工藝過(guò)程及控制要點(diǎn)

RPMI1640（1）培養(yǎng)基

瘤細(xì)胞IR983干細(xì)胞系

(DMEM)培養(yǎng)基改良的Dulbecco’sEagle:15種AA,濃度升高1倍，8種維生素,增加3倍。

即：（mg/L）:L-鹽酸Asg42，L-cys24，L-Asn584，L-鹽酸His19，L-zle52，

L-Leu52，L-鹽酸Lys72，L-Met15，L-Phe36，L-Thr48，L-色氨酸8，L-酪氨酸36，L-纈氨酸48，氯化膽堿，葉酸3，肌醇6，煙酸3，泛酸鈣3，鹽酸吡哆醛3，核黃素0.3，硫胺素3，生物素3，NaCl6800，KCl400，CaCl2200，MgSO4·7H2O200，NaH2PO4·2H2O150，NaHCO32000，Glucose1000。青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml，50mg/mL慶大霉素10%小牛血清，

1%非必需氨基酸,0.1mol/L丙酮酸鈉，1%谷氨酸胺，

改良的Dulbecco’sEagle雜交瘤細(xì)胞篩選