常見的生化與分子生物學(xué)技術(shù)電泳電泳是指帶電的顆?；蛏锓肿釉谕饧与妶?chǎng)作用下，向帶相反電荷的電極作定向移動(dòng)的現(xiàn)象。顯然，帶電粒子或分子的大小、形狀、所帶的凈電荷多少等都會(huì)影響它們的電泳速度。待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等存在的差異，使得帶電分子的“泳動(dòng)”速度不同，因而可以利用電泳技術(shù)對(duì)生物分子進(jìn)行分離、鑒定或純化。電泳技術(shù)有多種方式，但一般根據(jù)有無支持物將其分為無支持物的自由電泳和有支持物的區(qū)帶電泳兩大類。區(qū)帶電泳包括以濾紙作為支持物的紙電泳、以醋酸纖維素等薄膜為支持物的薄層電泳，以及與凝膠（例如瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠）為支持物的凝膠電泳。等電聚焦凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、二維電泳、脈沖場(chǎng)凝膠電泳。電泳法分離三種不同的氨基酸透析方法示意圖超濾方法示意圖

層析層析法又被稱為色譜。所有的層析系統(tǒng)都由兩相組成：一個(gè)是固定相，它可以是固體物質(zhì)，也可以是固定在固體物質(zhì)上的成分；另一個(gè)是由可以流動(dòng)的物質(zhì)組成的流動(dòng)相，如水和各種溶劑。當(dāng)待分離樣品隨著流動(dòng)相通過固定相時(shí)，各組份在理化性質(zhì)上的差別使得各自與兩相發(fā)生相互作用（如吸附、溶解或結(jié)合等）的能力不同，最終導(dǎo)致它們?cè)趦上嘀械姆峙洳煌?，而且隨著流動(dòng)相向前移動(dòng)，各組份會(huì)不斷地在兩相中進(jìn)行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻力就越小，向前移動(dòng)的速度越快；反之，與固定相相互作用越強(qiáng)的組份，向前移動(dòng)速度越慢。經(jīng)過分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達(dá)到分離各組份的目的。表1主要的層析方法及其原理名稱分離原理吸附層析各組份在作為固定相的固體吸附劑表面的吸附能力不同分配層析各組份在流動(dòng)相和靜止液相（固定相）中的分配系數(shù)不同離子交換層析固定相是離子交換樹脂，各組份因所帶電荷狀況不同與離子交換樹脂的親和力不同凝膠層析固定相為多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在通過凝膠時(shí)受阻滯的程度不同疏水層析固定相為帶有強(qiáng)疏水基團(tuán)的樹脂，各組分的疏水性不同，導(dǎo)致其與樹脂的結(jié)合能力不同親和層析固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此達(dá)到和無親和力的其它組份分離的目的分子篩示意圖親和層析示意圖蛋白質(zhì)研究方法假定你發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)X1.如何得到這種蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)的分離、純化技術(shù)2.這種蛋白質(zhì)的大小？（SDS）3.它的pI是多少？（等電聚焦）4.其他細(xì)胞或其他生物體內(nèi)是否存在？

（Western印跡）5.其一級(jí)結(jié)構(gòu)如何？

（序列分析）6.其三維結(jié)構(gòu)又如何？

X-射線衍射和核磁共振蛋白質(zhì)和酶純化的

常見方法和方案設(shè)計(jì)分離純化蛋白質(zhì)的各種方法都是利用蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，例如溶解性、質(zhì)量和形狀、表面電荷、表面疏水性、與特定配體結(jié)合的性質(zhì)等。常用的方法有：沉淀（溶解性）；離子交換（電荷）；聚焦層析（電荷）；凝膠過濾（大小和形狀）；疏水作用層析（疏水性）；親和層析（與特定配體的特異性結(jié)合）。蛋白質(zhì)純化的準(zhǔn)備工作。在進(jìn)行蛋白質(zhì)純化之前首先要解決三個(gè)問題：（1）純化蛋白質(zhì)的目的；（2）目標(biāo)蛋白的測(cè)活方法；（3）純化蛋白質(zhì)的原料。一個(gè)典型的蛋白質(zhì)純化方案開始于完整的組織，一般經(jīng)過四個(gè)階段：（1）破碎細(xì)胞或組織（混合和勻漿）；（2）去除殘?jiān)x心）；（3）沉淀/濃縮（硫酸銨或聚乙二醇）；（4）純化（層析）；（4）鑒定，包括純度、大小或pI的測(cè)定。蛋白質(zhì)純度的鑒定（1）電泳法：如聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦和毛細(xì)管電泳等，純凈的蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果應(yīng)該是一條帶。如果使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，則應(yīng)該特別小心，因?yàn)镾DS能夠破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，如果一種蛋白質(zhì)由不同的亞基組成，則會(huì)出現(xiàn)幾條帶。此外，電泳法檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度時(shí)，應(yīng)取分布在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)兩側(cè)的兩個(gè)不同的pH值分別進(jìn)行檢測(cè)，這樣得出的結(jié)論才更可靠；（2）化學(xué)法：N-端測(cè)定，C-端測(cè)定。純品蛋白質(zhì)應(yīng)該具有恒定的N-端或C-端組成。如果一種蛋白質(zhì)只有一條鏈組成，則只會(huì)檢測(cè)到一種N-端或C-端氨基酸；（3）儀器法：HPLC或質(zhì)譜。如果一種蛋白質(zhì)樣品在HPLC上只表現(xiàn)單一的峰，則可視為其為純品；如果純化的是一種已知蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析測(cè)定出來的相對(duì)分子量與實(shí)際的值一致，那么也可認(rèn)為它是純品。等電聚焦需要在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，以在陽極和陰極之間建立遞增的pH梯度，處在其中的蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)的作用下遷移，最后各自移動(dòng)到并聚焦于與其pI相當(dāng)?shù)膒H位置上。于是通過等電聚焦，不僅可以實(shí)現(xiàn)pI不同的蛋白質(zhì)之間的分離，而且還可以測(cè)定出各種蛋白質(zhì)的pI蛋白質(zhì)的雙向電泳表2各種印跡技術(shù)印跡類型轉(zhuǎn)移到膜上的分子探針獲得的信息SouthernDNA片段放射性標(biāo)記的互補(bǔ)RNA或DNA基因結(jié)構(gòu)等NorthernRNA放射性標(biāo)記的互補(bǔ)RNA或DNA特定RNA的大小、分布和含量Western蛋白質(zhì)一級(jí)抗體和與酶偶聯(lián)的二級(jí)抗體特定蛋白質(zhì)的大小、分布和含量Western印跡RNA干擾（RNAi）RNA干擾是指通過雙鏈RNA使目的mRNA降解，從而特異性地抑制目的蛋白表達(dá)的現(xiàn)象。miRNA是指微RNA，其長度通常為21nt~25nt，由內(nèi)源基因編碼，前體含有不完善的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能夠識(shí)別多個(gè)目標(biāo)，通常與目標(biāo)mRNA的3′-UTR結(jié)合，從而阻止它們的翻譯，但并不導(dǎo)致目標(biāo)mRNA的水解。siRNA是指短干擾RNA，長度也在21nt~25nt之間，但多數(shù)來自外源的雙鏈RNA，作用方式通常為高度特異性的，與目標(biāo)mRNA結(jié)合后，導(dǎo)致它們的降解。RNAi的作用機(jī)制RNAi的生物學(xué)意義——目前普遍認(rèn)為，它在植物和昆蟲體內(nèi)相當(dāng)于一種免疫系統(tǒng)，起著保衛(wèi)基因組的作用，它能夠防止外來的有害基因或病毒基因整合到植物基因組中，此外，它還參與基因表達(dá)的調(diào)控。miRNA的產(chǎn)生和作用機(jī)制siRNA的產(chǎn)生和作用機(jī)制哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞內(nèi)

還有哪些代謝途徑？哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞已經(jīng)喪失了各種細(xì)胞器，因此，那些發(fā)生在特定細(xì)胞器內(nèi)的或部分反應(yīng)發(fā)生在特定細(xì)胞器內(nèi)的代謝途徑也就不復(fù)存在。例如，發(fā)生在線粒體內(nèi)的TCA循環(huán)、氧化磷酸化和脂肪酸氧化，發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)的DNA復(fù)制、DNA轉(zhuǎn)錄及其后加工，部分反應(yīng)發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖異生、發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的磷脂合成。被保留的代謝途徑主要是對(duì)紅細(xì)胞的功能所必需的兩條代謝途徑：一條是糖酵解，另外一條是PPP。糖酵解是它獲取ATP的唯一手段，通過乳酸發(fā)酵維持NAD+的再生，而產(chǎn)生的乳酸通過乳酸循環(huán)在肝細(xì)胞內(nèi)重新轉(zhuǎn)變成葡萄糖。PPP是維持其細(xì)胞膜的完整性和血紅蛋白的血紅素鐵處于二價(jià)態(tài)所必需的。如何計(jì)算ATP的得失？細(xì)胞內(nèi)許多代謝途徑伴隨著ATP的消耗或合成。計(jì)算一種物質(zhì)在特殊的條件下的合成或分解能產(chǎn)生或消耗多少ATP已成為許多考試的焦點(diǎn)（例如1分子葡萄糖在破傷風(fēng)桿菌氧化最多能產(chǎn)生多少ATP或1分子葡萄糖在含有大量的砷酸的紅細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多少ATP？）。遇到這樣的問題，實(shí)際上只要全面考慮就行了，需要考慮以下幾點(diǎn)：（1）有沒有或有多少消耗ATP或其他能量貨幣的反應(yīng)？注意其他能量貨幣與ATP是等價(jià)的，另外還要注意ATP是怎樣被消耗的，即ATP變成ADP，還是變成AMP？如果是后者，要當(dāng)成消耗2個(gè)ATP才行；（2）有多少產(chǎn)生ATP或其他能量貨幣的反應(yīng)？注意ATP合成有底物水平的磷酸化和氧化磷酸化。在考慮氧化磷酸化的時(shí)候，要記住線粒體內(nèi)的1分子NADH或FADH2進(jìn)入呼吸鏈分別產(chǎn)生2.5個(gè)和1.5個(gè)ATP。至于細(xì)胞液內(nèi)產(chǎn)生的NADH如何進(jìn)入呼吸鏈取決于它通過何種穿梭系統(tǒng)進(jìn)入？如果是甘油-3-磷酸脫氫酶穿梭系統(tǒng)，是產(chǎn)生1.5個(gè)ATP，否則是產(chǎn)生2.5個(gè)ATP；（3）反應(yīng)系統(tǒng)之中有無干擾ATP產(chǎn)生的化學(xué)試劑，例如有無解偶聯(lián)劑（砷酸或DNP）或呼吸鏈的抑制劑；（4）反應(yīng)系統(tǒng)有氧還是無氧？如果有氧要考慮氧化磷酸化，無氧只要考慮底物水平的磷酸化。對(duì)于1分子葡萄糖在破傷風(fēng)桿菌氧化最多能產(chǎn)生多少ATP的問題，首先需要想到破傷風(fēng)桿菌是一種厭氧菌，它只能通過糖酵解產(chǎn)生ATP，因此產(chǎn)生的ATP數(shù)目是2個(gè)。至于1分子葡萄糖在含有大量的砷酸的紅細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多少ATP的問題要考慮到紅細(xì)胞沒有線粒體，故只能通過糖酵解產(chǎn)生ATP，其次要考慮到砷酸在糖酵解那一步由甘油醛-3-磷酸脫氫酶催化的反應(yīng)中代替無機(jī)磷酸以后，形成的甘油酸-1-砷酸-3-磷酸很容易自發(fā)水解，而導(dǎo)致后面的底物水平磷酸化不能進(jìn)行，因此最后產(chǎn)生的ATP數(shù)目是為0。實(shí)例生物大分子生物合成的極性DNA、RNA、蛋白質(zhì)、多糖和脂肪酸的生物合成都有一定的方向性，這就是所謂的極性問題。為方便記憶，可以放在一起比較。DNA和RNA合成的方向都是從5′→3′，而蛋白質(zhì)生物合成的方向總是從N端→C端，閱讀mRNA模板的方向也總是從5′→3′，多糖的合成以糖原為例，總是從還原端向非還原端，而脂肪酸的合成從甲基端向羧基端。在書寫DNA、RNA和蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的時(shí)候，正好按照它們生物合成的方向來寫。然而，人工合成核酸和蛋白質(zhì)的方向正好與生物合成的方向相反，這一點(diǎn)需要注意。DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的校對(duì)機(jī)制校對(duì)的目的是維持各自的忠實(shí)性。DNA復(fù)制是通過DNA聚合酶內(nèi)在的3′-外切酶活性來校對(duì)；RNA聚合酶本身無任何外切酶活性，但通過特殊的蛋白質(zhì)也可以進(jìn)行校對(duì)；氨酰-tRNA合成酶具有校對(duì)中心，將誤載的氨基酸切除。如何理解“信號(hào)學(xué)說”？“信號(hào)學(xué)說”是用來解釋細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)如何各得其所、各就各位的。其基本內(nèi)容是：各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的最終定位由多肽鏈本身所具有的特定氨基酸序列決定。這些特殊的氨基酸序列起著一種信號(hào)向?qū)У淖饔?，因此被稱為信號(hào)序列。在某種意義上，一個(gè)蛋白質(zhì)分子上的信號(hào)序列相當(dāng)于它特有的“分子郵政編碼”。如果一個(gè)蛋白質(zhì)缺乏任何一種信號(hào)序列，則會(huì)留在其“默認(rèn)”的位置——細(xì)胞液，如參與糖酵解和磷酸戊糖途徑的酶。注意有兩類指導(dǎo)蛋白質(zhì)分撿的信號(hào)，需要將它們區(qū)分開來：一類稱為信號(hào)肽，其本質(zhì)是一段在一級(jí)結(jié)構(gòu)上連續(xù)的氨基酸序列，通常有15~60個(gè)氨基酸殘基，它們有的在N端，有的在C端，有的在多肽鏈的內(nèi)部。還有的蛋白質(zhì)不止一種信號(hào)序列。這