細(xì)胞工程第五章細(xì)胞融合與單克隆抗體詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日1（優(yōu)選）細(xì)胞工程第五章細(xì)胞融合與單克隆抗體現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日2細(xì)胞融合（cellfusion)，是指在離體條件下將不同種生物或同種生物不同類型的單細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞融合技術(shù)的出現(xiàn)標(biāo)志著細(xì)胞工程的誕生！一、細(xì)胞融合現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日3Muller于1838年觀察到脊椎動(dòng)的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。Lange于1875年第一個(gè)觀察到脊椎動(dòng)物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過(guò)程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無(wú)脊椎動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日4自發(fā)細(xì)胞融合（一）細(xì)胞膜融合

受精過(guò)程（二）體內(nèi)細(xì)胞的自發(fā)融合

1、肌管的形成2、胚胎著床3、巨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成4、腫瘤細(xì)胞的融合破骨細(xì)胞受精現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日5現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日6細(xì)胞融合的意義理論上說(shuō)任何細(xì)胞，都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對(duì)于種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過(guò)程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備?，F(xiàn)在是7頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日7二、人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合

誘導(dǎo)細(xì)胞融合的主要方法有：病毒誘導(dǎo)融合化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合物理方法（電融合）

現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日8二、人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合

（一）病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合

有許多種類的病毒能介導(dǎo)細(xì)胞融合，如皰疹病毒、副粘液病毒、雞新城疫病毒等。其中最常用的是滅活的仙臺(tái)病毒（HVJ）,為RNA病毒。

現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日9滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性）生物法：滅活的病毒（喪失感染性、保留抗原結(jié)構(gòu)）現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日10(二)化學(xué)方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合化學(xué)融合劑主要有高級(jí)脂肪酸衍生物（如甘油-醋酸酯、油酸、油胺等）、脂質(zhì)體（如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸等）、鈣離子、水溶性高分子化合物（如聚乙二醇）、水溶性蛋白質(zhì)和多肽（如牛血清白蛋白、多聚L-賴氨酸等），其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡(jiǎn)單，融合效果穩(wěn)定。現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日11（三）物理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開(kāi)始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害??；裝置精巧、方法簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過(guò)程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日12電融合的基本過(guò)程：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通電后，電流即通過(guò)原生質(zhì)體而不是通過(guò)溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。

電融合誘導(dǎo)法原理示意圖現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日13三、雜種細(xì)胞的篩選根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。同核細(xì)胞：兩個(gè)相同細(xì)胞的融合體。多核細(xì)胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體?，F(xiàn)在是14頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日14基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選常用的雜種細(xì)胞篩選方法現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日15四、細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日16

免疫器官：免疫細(xì)胞生成、成熟或集中分布的場(chǎng)所，包括骨髓、胸腺、脾、淋巴結(jié)等

免疫細(xì)胞（發(fā)揮免疫作用的細(xì)胞）：1．吞噬細(xì)胞2．淋巴細(xì)胞（起源骨髓中的造血干細(xì)胞）T細(xì)胞（在胸腺中成熟）B細(xì)胞（在骨髓中成熟）

免疫活性物質(zhì)：由免疫細(xì)胞或其他細(xì)胞產(chǎn)生的發(fā)揮免疫作用的物質(zhì)，包括抗體、淋巴因子、溶菌酶等現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日17現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日18基本概念抗原抗體抗原決定簇（抗原表位）細(xì)胞克隆多克隆抗體單克隆抗體現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日19抗原（antigen，Ag），是指一種能刺激人或動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。抗原的基本性質(zhì)具有異物性、大分子性和特異性。異物性是指進(jìn)入機(jī)體組織內(nèi)的抗原物質(zhì)，必須與該機(jī)體組織細(xì)胞的成分不相同。大分子性是指構(gòu)成抗原的物質(zhì)通常是相對(duì)分子質(zhì)量大于10000的大分子物質(zhì)，分子量越大，抗原性越強(qiáng)。特異性是指一種抗原只能與相應(yīng)的抗體或效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日20抗體（antibody,Ab)是機(jī)體免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分裂成漿細(xì)胞所產(chǎn)生的可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，具有免疫功能。現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日21現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日22抗原決定簇（Antigenicdeterminant）是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱表位(epitope).抗原以抗原決定簇與相應(yīng)淋巴細(xì)胞的抗原受體結(jié)合而激活淋巴細(xì)胞引起免疫應(yīng)答。淋巴細(xì)胞表面的抗原識(shí)別受體通過(guò)識(shí)別抗原決定簇而區(qū)分“自身”與“異己”。抗原也是以抗原決定簇與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合而發(fā)生反應(yīng)的?，F(xiàn)在是23頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日23細(xì)胞克隆：由一個(gè)細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞集團(tuán)現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日24現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日25多克隆抗體（Polyclonalantibody,PcAb）：針對(duì)多種抗原決定簇的混合抗體現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日26單克隆抗體（Monoclonalantibody,McAb）由單個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定簇的同源抗體現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日27

現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日281975年科勒(Kohler)和米爾斯坦(Milstein)將小鼠免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，培養(yǎng)出既能迅速生長(zhǎng)無(wú)限繁殖又可分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。從而獲得針對(duì)某一特殊抗原決定簇的單克隆抗體?，F(xiàn)在是29頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日29一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無(wú)限增殖雜種細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)設(shè)計(jì)方案：動(dòng)物細(xì)胞融合創(chuàng)始人：米爾斯坦單克隆抗體既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量繁殖現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日30

單克隆和多克隆抗體的比較和用途特異性敏感性均一性McAbPcAb低差無(wú)高強(qiáng)有1、用于免疫學(xué)檢測(cè)，輔助臨床診斷2、McAb用于親和層析，分離微量可溶性抗原3、標(biāo)記的McAb用于基礎(chǔ)研究，了解細(xì)胞分化等4、制備生物導(dǎo)彈用于腫瘤、移植等的臨床治療。現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日31單克隆抗體在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑（1）病原微生物抗原抗體的檢測(cè)（2）腫瘤抗原的檢測(cè)（3）免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)（4）激素測(cè)定（5）細(xì)胞因子的測(cè)定蛋白質(zhì)的提純腫瘤的導(dǎo)向治療和放射免疫顯像技術(shù)酶標(biāo)儀現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日32動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細(xì)胞才能活動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過(guò)程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞篩選陽(yáng)性雜交細(xì)胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測(cè)現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日33動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細(xì)胞才能活動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過(guò)程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞篩選陽(yáng)性雜交細(xì)胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測(cè)現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日34B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有目的雜種細(xì)胞才能活HAT培養(yǎng)基現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日35HAT選擇培養(yǎng)基HAT選擇培養(yǎng)基組分

次黃嘌呤核苷酸（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A)（二氫葉酸還原酶抑制劑）胸腺嘧啶核苷酸（thymidine,T)現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日36細(xì)胞DNA合成途徑1.主要途徑：氨基酸谷氨酰胺尿核苷單磷酸

葉酸及其衍生物（必不可少的媒介）2.補(bǔ)救途徑：次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）

胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）原料：次黃嘌呤核苷酸（H）、胸腺嘧啶核苷酸（T）現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日37B、B×B、B×瘤

—、瘤—×瘤—、瘤—只有目的雜種細(xì)胞才能活HAT培養(yǎng)基××××HGPRT—/TK—√現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日388-雜氮鳥(niǎo)嘌呤Br-脫氧嘧啶核苷HGPRT—TK—現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日39篩選陽(yáng)性雜交細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日40現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日41免疫標(biāo)記技術(shù)放射物標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)技術(shù)免疫熒光技術(shù)其他標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法競(jìng)爭(zhēng)法雙抗原夾心法間接法雙位一點(diǎn)法現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日42現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日43ELISA原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日44ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過(guò)程包被：將已知抗原或抗體通過(guò)物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日45現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日46封閉現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日47現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日48現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日49現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日50現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日51現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日52現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日53現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日54現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日55動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細(xì)胞才能活動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過(guò)程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞篩選陽(yáng)性雜交細(xì)胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測(cè)現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日56現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日57現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日58現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日59現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日60現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日61現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日62現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日63視頻：?jiǎn)慰寺】贵w的制備現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日64動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細(xì)胞才能活動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過(guò)程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞篩選陽(yáng)性雜交細(xì)胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測(cè)現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日65單抗純化方法：鹽析凝膠過(guò)濾離子交換層析親和層析法現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日66用中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出。

血清50%飽和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%飽和度硫酸胺上清沉淀擬球蛋白r球蛋白（1）鹽析法現(xiàn)在是67頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日67（2）凝膠過(guò)濾法干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋白質(zhì)溶液加在凝膠柱上進(jìn)行洗脫時(shí)，大分子蛋白不能穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子蛋白可穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移動(dòng)較慢洗脫出來(lái)較慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質(zhì)分離出來(lái)。交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)瓊脂糖凝膠(Sepharose)現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日68（3）離子交換層析法DEAE纖維素：結(jié)合溶液中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，又稱陰離子交換劑CM纖維素：結(jié)合溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)，又稱陽(yáng)離子交換劑現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日69（4）親和層析法將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成抗原抗體復(fù)合物，然后改變條件，使抗原抗體復(fù)合物解離洗脫出純化的抗體（或抗原）現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日70單克隆抗體特性理化性狀高度均一，生物活性專一，只與一種抗原表位發(fā)生反應(yīng)，特異性強(qiáng)，純度高，易于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化和大量制備現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星期日71單抗鑒定方法：效價(jià)（凝集反應(yīng)、Elisa、放免）特異性（免疫熒光、Elisa、間接血凝、免疫印跡）現(xiàn)在是72頁(yè)\一共有81頁(yè)\編輯于星