分解纖維素的微生物的分離.第1頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三纖維素：棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物；纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70億噸；分布植物的根、莖、葉中；第2頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三1、在草食性動(dòng)物等的消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。2、農(nóng)作物秸稈：米秸、麥秸、稻草、草、木屑等富含大量的纖維素，被利用的機(jī)會(huì)很少、效率低；

纖維素生物燃料：

最有希望替代石油能源

科學(xué)家正致力于研究，怎樣將農(nóng)業(yè)廢棄物、木材及生長(zhǎng)更為迅速的草本植物，轉(zhuǎn)化為種類繁多的生物燃料（甚至是航空燃油）。第3頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三課題3分解纖維素的微生物的分離第4頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三1.纖維素：是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。有些微生物能分解利用纖維素，因?yàn)樗鼈兡軌虍a(chǎn)生纖維素酶。2.纖維素酶：是一種復(fù)合酶，一般包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。前兩種酶能使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶能將纖維二糖分解成葡萄糖。3．篩選纖維素分解菌的方法是剛果紅染色法。該方法可以通過顏色反應(yīng)直接篩選。其原理是：剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，我們可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。4．纖維素分解菌大多分布在富含纖維素的環(huán)境中，也可以將富含纖維素的物質(zhì)埋在土壤中，經(jīng)過30天左右，再從已腐爛的物質(zhì)埋藏處篩選纖維素分解菌。自主學(xué)習(xí)答案第5頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三5．在將樣品稀釋涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上之前，可以用選擇培養(yǎng)基增加纖維索分解菌的濃度。培養(yǎng)時(shí)要在搖床上振蕩培養(yǎng)。6．常用的剛果紅染色法有兩種：一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅染色；另一種是在倒平板時(shí)就加入剛果紅。7．經(jīng)過剛果紅鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)后，在產(chǎn)纖維素酶的菌落周圍會(huì)出現(xiàn)透明圈?？梢杂脝渭?xì)胞挑取法挑取纖維素分解菌。8．為確定得到的是纖維素分解菌，尚需進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實(shí)驗(yàn)，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測(cè)定方法一般采用對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定理測(cè)定。第6頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三一、基礎(chǔ)知識(shí)1.纖維素

纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質(zhì)。第7頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三

土壤中某些微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶,把纖維素分解為葡萄糖，后再利用。第8頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三2.纖維素酶

纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶(外切酶)、CX酶(內(nèi)切酶)和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素一、基礎(chǔ)知識(shí)第9頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三

在2支20mL的試管中，分別放入1×6cm的濾紙條，再分別加入pH為4.8、物質(zhì)的量濃度為0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液10mL、11mL。在加入10mL緩沖液的試管中加入1mL纖維素酶（70~80U/mL）。將二支試管固定在50mL的錐形瓶中，在搖床上以140r/min的轉(zhuǎn)速振蕩反應(yīng)1h，觀察結(jié)果。1U表示1個(gè)酶活力單位，是指在溫度為25℃，其他反應(yīng)條件，如pH等，均為最適的情況下，在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1mmol的底物所需的酶量。底物：酶所作用和催化的化合物。

第10頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三在一支試管中添加纖維素酶，另一支試管不添加纖維素酶；〖思考1〗實(shí)驗(yàn)分析：P27的小實(shí)驗(yàn)是如何構(gòu)成對(duì)照的？濾紙崩潰法第11頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三（2）纖維素分解菌的篩選1、篩選纖維素分解菌的方法______________。該方法可以通過________反應(yīng)直接篩選。剛果紅染色法顏色2、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成____________，當(dāng)纖維素被_________分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以_____________為中心的________，可以通過___________________________來篩選纖維素分解菌。紅色復(fù)合物纖維素酶纖維素分解菌

透明圈是否產(chǎn)生透明圈第12頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三可根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌第13頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三練一練：1.下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯(cuò)誤的是A.纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種B.纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖C.纖維素酶可用于去掉植物的細(xì)胞壁D.葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖第14頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說法錯(cuò)誤的是A.剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物B.剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物C.剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D.若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩

選出了纖維素分解菌第15頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三(三)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別培養(yǎng)基挑選菌落什么樣的環(huán)境取樣?①培養(yǎng)的目的?②選擇培養(yǎng)基的特點(diǎn)?挑選什么樣的菌落?①鑒別培養(yǎng)基的特點(diǎn)?②如何鑒別?根據(jù)：微生物對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)環(huán)境中去找；目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物；剛果紅染色法第16頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三【思考3】實(shí)驗(yàn)流程中“選擇培養(yǎng)”的培養(yǎng)基類型是什么？該培養(yǎng)的目的是什么？【思考4】本實(shí)驗(yàn)流程與尿素分解菌的分離實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？答：液體選擇培養(yǎng)基。其目的是使纖維素分解菌增殖，含量增多。答：不同點(diǎn)：尿素分解菌的分離實(shí)驗(yàn)流程是將土樣制成的菌懸液直接涂布在選擇培養(yǎng)基上；本課題通過選擇培養(yǎng)使細(xì)菌增殖后，再涂布在鑒別培養(yǎng)基上。相同點(diǎn)：其它操作基本共同。第17頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三活動(dòng)探究4：閱讀資料一“土壤取樣”，回答下列問題：思考5：為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？答：生物適應(yīng)一定環(huán)境，環(huán)境對(duì)生物具有選擇作用，只有在纖維素含量豐富的環(huán)境中纖維素分解菌的含量才會(huì)高于其它普通環(huán)境，從而提高獲得目的微生物的幾率。思考6：將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？答：人工設(shè)置適宜環(huán)境，使纖維素分解菌相對(duì)聚集。將紙埋于深約10cm的腐殖土壤中。第18頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三1、纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基屬于______（固體、液體）培養(yǎng)基，原因是__________活動(dòng)探究5：閱讀選擇培養(yǎng)基閱讀資料二“選擇培養(yǎng)基”，回答以下幾問題：液體沒有添加瓊脂2、該培養(yǎng)基對(duì)微生物_____（具有，不具有）選擇作用。如果具有，其選擇機(jī)制是____________________________________________________________________________

具有以纖維素粉為唯一碳源，能分解纖維素的微生物可以大量繁殖；第19頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三若設(shè)置一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)說明選擇培養(yǎng)的作用，應(yīng)控制的變量是將__________改為_________。3、你能否設(shè)計(jì)一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，說明選擇培養(yǎng)基的作用？葡萄糖纖維素粉第20頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生長(zhǎng)因子KH2PO40.25g無機(jī)鹽土豆汁100mL碳源、生長(zhǎng)因子瓊脂15g凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至1000mL氫元素、氧元素鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉)第21頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三【資料三】剛果紅染色法方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)方法二：在倒平板時(shí)就加入剛果紅第22頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三方法一中NaCl溶液的作用？思考：

漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個(gè)多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能就強(qiáng)！第23頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三染色法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)方法一

方法二

顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用

操作繁瑣，剛果紅會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜操作簡(jiǎn)便，不存在菌落混雜問題

產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。思考：這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足第24頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三比較項(xiàng)目分解尿素的細(xì)菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)原理培養(yǎng)基類型目的鑒定培養(yǎng)基原理現(xiàn)象方法在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果pH升高指示劑會(huì)變紅剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶催化分解后紅色復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基上就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈觀察菌落周圍是否有著色的環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌脲酶檢測(cè)法剛果紅染色法第25頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三

在產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C－370C培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。第26頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三挑選產(chǎn)生透明圈的菌落

挑取產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C－370C培養(yǎng)，可獲得純培養(yǎng)。純化培養(yǎng)第27頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長(zhǎng)則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。

2.分離的結(jié)果是否一致

由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。第28頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三如何判斷生物為自養(yǎng)型還是異養(yǎng)型？碳源：凡是能夠?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)繁殖提供碳源的營養(yǎng)物質(zhì)叫作碳源。自養(yǎng)型生物：碳源為無機(jī)態(tài)的碳源，如：CO2、碳酸氫鈉等為無機(jī)碳源。（1）光能自養(yǎng):綠色植物、光合細(xì)菌(2)化能自養(yǎng):硝化細(xì)菌、硫細(xì)菌、鐵細(xì)菌異養(yǎng)型生物：碳源為有機(jī)碳源。如：糖類（葡萄糖、蔗糖等）、蛋白胨、脂肪酸、石油等。異養(yǎng)型:人、動(dòng)物、大多數(shù)真菌、大多數(shù)細(xì)菌注：看微生物的同化類型是看碳源類型，與氮源無關(guān)。有些異養(yǎng)型微生物也可以利用無機(jī)態(tài)氮源，如根瘤菌和圓褐固氮菌。第29頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三

為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行_____________實(shí)驗(yàn)，纖維素酶的發(fā)酵方法有______發(fā)酵和______發(fā)酵。纖維素酶測(cè)定方法是對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的________含量進(jìn)行定量測(cè)定。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

液體

固體

葡萄糖

五、課題延伸第30頁，共32頁，2023年，2月20日，星期三分解纖維素的微生物的分離纖維素酶種類、作用、催化剛果紅染色篩選原理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)土壤取樣選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)純化培養(yǎng)前置染色法后置染色法富含纖維素土壤增大分解菌含量染色鑒別分離出分解菌課堂總結(jié)第