修飾引物的介紹儲存條件

凍干引物和稀釋成儲液的引物建議儲存在-20°C.HEX,、TET和FAM對光敏感。應(yīng)儲存在黑暗處或用琥珀色管子儲存。推薦放入黑色盒子中。染料

暴露在光下半衰期(大約)HEX4.5hoursTET2.25hoursFAM1.125hoursHEX和TET標(biāo)記的寡核苷酸在PCR30個(gè)循環(huán)內(nèi)都是穩(wěn)定的；但是在不利的環(huán)境中（高PH，高溫），TET比HEX穩(wěn)定。稀釋方法對于非Cy類的熒光標(biāo)記引物，建議用TE稀釋，濃度高于10uM。Cy3和Cy5標(biāo)記的引物在堿性條件下易降解，用中性溶液溶解。修飾對OD值的影響

有些熒光基團(tuán)在260nm處也有吸收光:這些修飾包括：

FAM,Fluorescein,HEX,TAMRA,andTET。其它在260nm處可能也有吸收值，但是數(shù)據(jù)沒有公布，因此計(jì)算時(shí)不包括在里面。APandHRP偶聯(lián)的寡核苷酸:蛋白和核苷酸都有OD值，但是可能不會影響寡核苷酸的真實(shí)OD值。合成規(guī)模和純化方式ModSynthPurificationPurificationPurificationPurificationScaleDesaltedCartridgeHPLCGelPurified5'Biotin5'Phosphate5'PrimaryAmine25NYes(10-50bases)NONONO50NYes(10-50bases)NONONO200NYes(10-50bases)NOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)1UYes(10-50bases)NOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)25UYes(10-50bases)NOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)5'Rhodamine25NNONONONO50NYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)200NYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)1UYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)25UYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)5'HEX/TET/FAM5'Fluorescein5'GATEWAY25NYes(10-50bases)NONONO50NYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)200NNONOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)1UYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)25UYes(5-100bases)Yes(7–60bases)Yes(7–60bases)Yes(7-100bases)APConjugateHRPConjugate**25NNONONONO50NNONONONO200NNONONONO1UNONOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)25UNONOYes(7–60bases)Yes(7-100bases)Phosphorothioates25NNONONONO50NYes(5-100bases)Yes7–60bases)YES(7–60bases)YES(7-100bases)200NYes(5-100bases)Yes(7–60bases)YES(7–60bases)YES(7-100bases)1UYes(5-100bases)Yes(7–60bases)YES(7–60bases)YES(7-100bases)25UYesNOYES(7–60bases)YES(7-100bases)合成規(guī)模是25nnol時(shí)，合成的寡核苷酸不能小于10bp。問題：此表和網(wǎng)站上的不一致，是不是現(xiàn)在在中國不論合成規(guī)模大小，都能合成小于10bp的寡核苷酸呢？生物素

生物素修飾能夠耐受熱和pH（它能被加熱到100度并暴露在pH2-10）。其它極端的環(huán)境可能也能耐受，但是還沒有被檢測。還原劑可能不會影響生物素修飾，但是沒有精確的數(shù)據(jù)。生物素寡核苷酸通過OD260進(jìn)行定量（生物素在260沒有吸收光）。

生物素化的DNA能夠成功的轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌，如DH5alpha。

5'-生物素沒有相鄰烴基，所以它比3'-生物素穩(wěn)定。

3'-生物素的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以預(yù)測3'-Biotin可能會在兩種情況下脫離或降解：1過期，2寡核苷酸暴露在堿性環(huán)境中如溶解在堿性緩沖液中。原因是3'-Biotin有類似于RNA結(jié)構(gòu)的相鄰的烴基。5’生物素3’生物素問題：生物素dT的分子式？5‘和3’生物素修飾的合成過程（合成后、合成前）？通過什么連接鍵連接到寡核苷酸上？連接到寡核苷酸的什么位置（戊糖、堿基）？最終連接到寡核酸上的形式生物素羅丹明羅丹明溶解在水或TE中的顏色為粉紅色，略成紫色。??羅丹明修飾不受合成規(guī)模的限制，它是合成后修飾。需要額外的純化。??注：這個(gè)數(shù)據(jù)時(shí)染料溶解在甲醇中測定得到的。溶解在水或TE中以及與寡核苷酸連接后的值是會變化的。羅丹明問題：現(xiàn)在中國地區(qū)能合成的羅丹明修飾有：5‘RhodamineGreen、5’RhodamineRed、5‘RhodamineRed、3’RhodamineRed。RhodamineRed、RhodamineGreen溶解在水中或TE中的顏色？5‘和3’修飾時(shí)RhodamineGreen、RhodamineRed的分子結(jié)構(gòu)式？5‘和3’修飾的方法：連接到戊糖還是堿基上？通過什么化學(xué)鍵連接？都是合成后修飾嗎？合成后修飾：引物從固體介質(zhì)上解離之后經(jīng)過純化再進(jìn)行修飾的？還是引物合成之后在固體介質(zhì)上直接進(jìn)行修飾？修飾之前需要純化嗎？修飾之后需要純化嗎？最終連接到寡核酸上的形式HEX,TETor6-FAM注：摩爾消光系數(shù)是在最大nm處的激發(fā)光下測得的。因?yàn)閜H或成分的微小變化可能會影響以上的數(shù)據(jù)，

染料的顏色取決于ABI儀器上的“濾光片設(shè)備”：DyesFilterAFilterBHEXGreen(560nm)Yellow(560nm)6-FAMBlue(531nm)Blue(531nm)TET-Green(545)問題:3’HEX,TETor6-FAM修飾的結(jié)構(gòu)式？3‘HEX,TETor6-FAM修飾時(shí)是連接到戊糖還是堿基上？連接鍵是什么？3‘HEX,TETor6-FAM是合成后修飾嗎？3‘HEX,TETor6-FAM能否進(jìn)行硫代磷酸化修飾？5‘和3‘修飾的區(qū)別，如穩(wěn)定性等？最終連接到寡核酸上的形式HEX,TETor6-FAM磷酸化5’磷酸化作用是通過B-氰乙基化學(xué)反應(yīng)添加到引

物5‘端的糖環(huán)上，而不是最后一個(gè)堿基上。？？3’磷酸鹽被連接到固體支持介質(zhì)上，所以在合成的第一個(gè)循環(huán)，堿基就與它偶聯(lián)。它能夠阻止聚合酶的延伸。穩(wěn)定性：假設(shè)是DNA：3'-PO4比3'-BIO穩(wěn)定。3'-BIO在堿性環(huán)境下會脫落，而3'-PO4不會。用膠純化磷酸化引物時(shí)，不能區(qū)分全長引物和n-1引物，因?yàn)榱姿峄鶊F(tuán)帶陰性電荷，會影響電泳。有些經(jīng)HPLC純化后的磷酸化寡核苷酸在真空離心蒸發(fā)濃縮后有些“臟”，或微黃。這可能是因?yàn)樵摦a(chǎn)物為綜合產(chǎn)物。在做QC時(shí)，通過乙醇沉淀可以去除。Aminolinker5‘Aminolinker(C6)是在合成循環(huán)的最后一步以亞磷酸胺的形式通過B-氰乙基化學(xué)反應(yīng)添加到引物5’糖環(huán)上的，而不是添加到最后一個(gè)堿基上。5‘氨基標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)效率是>95%,氨基基團(tuán)在260nm處是沒有吸光值的；它在210nm處有吸光值。不能通過電泳檢測它的存在（瓊脂糖或丙烯酰胺）。3'Aminolinker(C7)只與一些5’修飾兼容，如FAM,HEX,TET,Fluorescein,Biotin,Amine,andphosphate。其它的5’修飾(如Alexadyes)需要氨基才能與寡核苷酸相連，這就無法避免該染料與3‘氨基相連。阻止連接或聚合酶延伸的一般想法是末端雙脫氧法，但是這種方法昂貴或者不可用。因?yàn)橹灰鶕?jù)應(yīng)用去除3‘或者5‘，所以只需用3’或5‘氨基修飾即可滿足需要。另外氨基修飾是最簡單最便宜的方法。任意一種氨基修飾都可以。5’末端C6類型效果很好。用化學(xué)交聯(lián)劑可以把雙鏈DNA與肽連接?？梢試L試用5‘伯胺修飾的DNA與戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。問題：5‘Aminolinker(C12)、5’Aminolinker(C6)、3‘Aminolinker(C7)、dTC6-Aminolinker、3'Amino/Amine的分子式？3‘Aminolinker(C7)、3'Amino/Amine的修飾過程？連接在核苷酸的什么位置？dTC6-Aminolinker的修飾過程？是不是只能在5‘端用這種修飾？這幾種氨基修飾的區(qū)別？AminolinkerAlexa

它們都是通過C6連接臂與寡核苷酸連接的。3‘端通過氨基把Alexa連接到引物的3‘端。Alexafluor染料是在合成后添加到寡核苷酸鏈上的。？？？TexasRed-X修飾基團(tuán)是怎樣被添加到寡核苷酸上的？首先在DNA的5‘末端的磷酸基團(tuán)上加一個(gè)氨基，然后在氨基上連接一個(gè)帶有羧基的基團(tuán)。5‘-COOH-NH2-PO3-DNA問題：5‘TexasRed-X、3’TexasRed-X的結(jié)構(gòu)式？合成過程？合成前修飾還是合成后修飾？5‘TexasRed-X、3’TexasRed-X通過什么鍵和寡核苷酸連接？連接到戊糖還是堿基上？水溶液的顏色？5‘TexasRed-X、3’TexasRed-X的區(qū)別Phospothioate(S-oligos)S-oligos是寡核苷酸中的單核苷酸之間的磷酸二酯鍵中的一個(gè)氧被硫代替后形成的。這種修飾是在連接的時(shí)候進(jìn)行的（不是在合成后進(jìn)行的）。堿基被添加上后，再進(jìn)行連接修飾。在兩個(gè)堿基之間的磷酸可以轉(zhuǎn)換成雙鍵“S”（用Beaucage試劑）代替普通的雙鍵“O”（用碘溶液）。最終合成的寡核苷酸不是立體結(jié)構(gòu)單一的形式，它們是R和S立體異構(gòu)體的混合物。

和磷酸二酯鍵相連的堿基都可以進(jìn)行這種修飾。因?yàn)閺墓腆w支持物上解離下來時(shí)，3‘末端堿基是OH，不能進(jìn)行硫代磷酸化。

我們可以提供對S-oligo進(jìn)行5‘修飾，如客戶可以定制S-oligo的熒光素標(biāo)記。我們不能提供在保存其它堿基“正?！钡那闆r下使某些位置的堿基硫代磷酸化。這是由于法定原因而不是化學(xué)合成的問題。S-oligo和普通的寡核苷酸在膠上的位置是一樣的。用HPLC純化方法純化硫代磷酸化修飾的寡核苷酸時(shí)，帶形雙峰或者帶形很寬。Phospothioate(S-oligos)Phospothioate的特性：化學(xué)穩(wěn)定、在水溶液中穩(wěn)定、能夠抵抗核酸酶應(yīng)用：磷酸硫代的反義引物在體內(nèi)通過很多不同的機(jī)制起作用。它們可以通過RNA水平抑制逆轉(zhuǎn)錄活性（抑制RNA病毒復(fù)制）。形成激活RNaseH活性的底物[S-ODNs和RNA形成雙鏈，使RNA更容易被RNaseH切斷]。反義寡核苷酸還能夠直接干擾轉(zhuǎn)錄或抑制翻譯。存在于胞內(nèi)和血液/培養(yǎng)基中的核酸酶對S-Oligos的影響不大。因?yàn)镾-ODNs保持了寡核苷酸的帶電狀態(tài)，它們能夠通過和陽離子脂類形成復(fù)合體而進(jìn)入細(xì)胞。它們也存在轉(zhuǎn)染率低的問題。反義引物在mRNA中的作用位點(diǎn)不同時(shí)，反義引物起的作用也不同（如寡核苷酸和mRNA上的轉(zhuǎn)錄起始密碼子互補(bǔ)，敲降效果就很好）。

問題：Phosphorthioate(A/C/G/T)Phospothioate(S-oligos)5‘Aldehyde5‘醛修飾用的化學(xué)試劑屬于芳香族。它包含苯環(huán)。分子量是245。問題：合成過程？合成