第11章

單基因遺傳病

的分子診斷

單基因遺傳?。阂粚Φ任换蚩刂瞥Ｈ旧w遺傳X連鎖遺傳單基因遺傳病線粒體遺傳基因結(jié)構(gòu)異常表達異常第一節(jié)策略第二節(jié)遺傳病的分子診斷第三節(jié)產(chǎn)前診斷一、血紅蛋白病二、血友病三、肌營養(yǎng)不良癥四、苯丙酮尿癥五、囊性纖維化六、亨廷頓病七、脆性X綜合征一、血紅蛋白病珠蛋白基因簇16p13.33-p13.1111ｐ15.5珠蛋白基因簇:血紅蛋白的類型成人Hb：HbA2297～98%

HbA2

222～3%胎兒Hb：HbF22

α2Gγ2α2Aγ2胚胎Hb：HbGowerⅠ22

ζ2Gγ2ζ2Aγ2

HbGowerⅡ22

HbPortland22

血紅蛋白病hemoglobinopathy

結(jié)構(gòu)異常

鐮刀狀細胞貧血；不穩(wěn)定血紅蛋白病血紅蛋白M病氧親和力改變表達異常（地中海貧血）

珠蛋白的合成降低或消失1、鐮刀形紅細胞貧血正常細胞鐮刀形細胞

帶氧的功能只有正常紅細胞的一半，患者常因此缺氧窒息。N-val·his·leu·thr·pro·glu

·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)鐮刀狀細胞貧血分子機制

GTGCATCTGACTCCTGAGGAGGTGCATCTGACTCCTGTGGAG正常的（N）的ASO探針：5′-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3′突變的（M）的ASO探針：5′-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-3′1.鐮刀型貧血病--ASO雜交法斑點雜交結(jié)果N：正常；M突變鐮狀紅細胞貧血患者ASO雜交法檢測N-ASOM-ASO正常突變突變

純合子雜合子純合子5′3′正?；?.15kb(CCTGAGG)×5′3′突變基因1.35kb(CCTGTGG)MstⅡ酶切2.HBS的限制性內(nèi)切酶譜分析目錄0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶者患者鐮狀紅細胞貧血病的限制性內(nèi)切酶譜分析目錄3.HBS的PCR-RFLP分析

正常人的擴增產(chǎn)物經(jīng)MstⅡ消化可生成54bp和56bp兩個片段，而鐮狀細胞貧血癥患者的DNA片段不被酶切，仍為110bp，雜合子可見三條帶正常人雜合體患者MarkerPCR-SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性,single-strand

conformation

polymorphism)

當雙鏈DNA變性為兩條單鏈后，各自會在中性條件下形成各自特定的空間構(gòu)象，因而在電泳時將在不同的位置上出現(xiàn)各自電泳條帶。如果DNA序列發(fā)生變化，甚至只有一個堿基變化，空間構(gòu)象也有可能發(fā)生變化，電泳條帶也隨之變化。PCR-SSCPSβ肽鏈Aβ肽鏈ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(SouthernBlot)MstII

CCTNAGG

GGANTCC1.15kb0.2kb1.35kbASSASβ肽鏈Aβ肽鏈ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(PCR-RFLP)DdeI

CTNAG

GANTC268bpASSA175bp175268443

2.地中海貧血

由于珠蛋白鏈的合成不平衡所造成的一類常見的單基因遺傳性、溶血性疾病。α地中海貧血β地中海貧血γ地中海貧血δ地中海貧血α地中海貧血

16號染色體有兩個α基因（α－）為α+地貧，α鏈減少。（－－）為α0地貧，α鏈不合成。臨床類型類型癥狀正常人靜止型+地貧雜合子無癥狀輕型（標準型）0地貧雜合子輕度貧血+地貧純合子血紅蛋白H病0地貧和+地貧雙重雜合子溶血性貧血HbBart’s胎兒水腫綜合征0地貧純合子胎兒水腫胎兒水腫

HVRψξ13’5’ca2

HVRψξ1

ψ2

ψ113’5’abcNormal(a+b)=1050bpMutant(a+c)=740bpLocationofPrimersandDetectionofthe--SEADeletionbyGap-PCRM12345678910HeterozygoteHomozygoteNormalNormalMutantDirectGenotypingofthe--SEADeletionbyDHPLCAssay––SEA/––SEA

//––SEASEAtypeofdeletion2

HVRψξ1

ψ2

ψ113’5’cdabNormal(a+b)=885bpMutant(c+d)=813bpPCR

DHPLCDetection

DNASamples非缺失型（點突變）無義突變、移碼突變、終止密碼突變、剪接突變等結(jié)果1

生成無功能或穩(wěn)定性降低的mRNA

無義突變移碼突變終止密碼突變起始密碼突變

2

RNA加工突變

3

產(chǎn)生不穩(wěn)定Hbβ地中海貧血

β珠蛋白Gene突變或缺失→β珠蛋白鏈合成速率下降→溶血性貧血

β0

地貧：β鏈完全不能合成

β+地貧：β鏈可部分合成β-地中海貧血臨床分類臨床類型基因型基因產(chǎn)物臨床表現(xiàn)重型地貧+/+、0/00/0、+/0鏈幾乎不能合成鏈合成相對增加HbF和HbA2增高地中海貧血面容溶血性貧血（需輸血）輕型地貧+/A、0/A0/A能合成適量的鏈貧血不明顯或輕度貧血中間型地貧+/+

鏈部分合成介于重型和輕型之間（不需輸血）遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)增多癥缺失或突變鏈和鏈合成受抑制鏈合成明顯增加成人HbF持續(xù)增加，無癥狀患兒顱骨及面頰部骨骼增大，頭顱變大，額部隆起，顴高，鼻梁塌陷，兩眼距離增寬，眼瞼浮腫，形成地中海貧血的特殊面容。-地中海貧血的分子基礎(chǔ)

地中海貧血已發(fā)現(xiàn)100多種突變類型，包括點突變和基因缺失。絕大多數(shù)地中海貧血是由于基因發(fā)生點突變所致，突變涉及基因內(nèi)及側(cè)翼序列。（1）編碼區(qū)突變（2）非編碼區(qū)突變（3）啟動子區(qū)突變（4）RNA裂解信號突變（5）加帽位點單個堿基突變☆編碼區(qū)突變

——mRNA穩(wěn)定性降低或形成無功能mRNA（1）無義突變密碼子17：A→C

密碼子43：G→Tβ0地貧（2）移碼突變密碼子71/72：+A

密碼子41/42：－TCTTβ0地貧（3）起始密碼突變

ATG→AGGβ0地貧⑴內(nèi)含子IGT→AT喪失一個剪切信號。⑵新的切點產(chǎn)生同義突變→激活→I和Exon隱蔽裂解位點如：GGT→AGT產(chǎn)生新的剪切點☆非編碼區(qū)突變

——影響mRNA剪切、加工過程GT→ATGGT→AGT，激活隱蔽剪切位點☆啟動子區(qū)突變

——降低mRNA的轉(zhuǎn)錄效率-28位A→G突變破壞了TATABox。☆RNA裂解信號突變

——不能準確裂解和加polyAβ珠蛋白基因3’側(cè)翼序列中AATAAA→AACAAA☆加帽位點單個堿基突變

——不能準確裂解和加polyA加帽位點發(fā)生A→C顛換，影響轉(zhuǎn)錄效率。通常是mRNA的第一個核苷酸。分子診斷方法

PCR反向點雜交(PCR-RDB)法PCR—RFLP法基因芯片法等-地貧診斷--反向斑點雜交ReverseDotBlot（RDB）ReverseDotBlot（RDB）analysis:反向斑點雜交-29-28cd17cd261-11-5cd27/28cd41/42NormalMutant

NMNMNMcd43cd71/72654二、肌營養(yǎng)不良癥X連鎖性隱性遺傳，患者都為男孩。肌細胞膜上的抗肌萎縮蛋白(dystrophin)基因突變。細胞膜不穩(wěn)定，通透性增加而變性或壞死。

2．分子診斷

(1)多重PCR技術(shù)（2）短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat,STR)連鎖分析（3）定量PCR技術(shù)

三、血友病缺乏凝血第8因子(FⅧ)--甲型。缺乏凝血第9因子(FⅨ)--乙型。甲型血友病分子機制

（二）乙型血友病及其分子診斷FⅨ基因缺陷，導致FⅨ含量缺乏或結(jié)構(gòu)異常，從而凝血功能障礙。直接測序法、基因芯片法和毛細管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)；間接檢測方法有：RFLP法、SSCP法、DGGE法、雙脫氧指紋圖譜(dideoxyfingerprint,ddF)、變性高效液相色譜法(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC）四a1-抗胰蛋白酶缺乏癥是蛋白酶抑制劑,侵入組織,與中性粒細胞釋放的蛋白水解酶(主要彈性蛋白酶)結(jié)合抑制其活性,減少組織損傷.兒童缺乏引起肝病;成人引起肺氣腫.苯丙氨酸酪氨酸苯丙氨酸羥化酶苯丙酮酸（苯丙酮尿癥）

苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶五、苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)(二)分子診斷1．PCR－STR連鎖分析2．PCR-SSCP法3．PCR-RFLP4．多重ASPCR法

六、亨廷頓?。℉untington'sdisease,HD)4號染色體上IT15基因CAG重復(fù)序列異常。常染色體顯性遺傳。舞蹈運動為特征的神經(jīng)退行性疾病。

異常蛋白質(zhì)積聚成塊，形成包涵體，損壞部分腦細胞，特別是那些與肌肉控制有關(guān)的細胞，導致患者神經(jīng)系統(tǒng)逐漸退化，神經(jīng)沖動彌散，動作失調(diào)，出現(xiàn)不可控制的顫搐，并能發(fā)展成癡呆，甚至死亡。

正常：9～30個拷貝。HD患者：大于35-100個或更多。拷貝數(shù)目與HD的發(fā)病年齡負相關(guān)。突變率在單基因遺傳性疾病中最低。HD的分子診斷PCR擴增鑒定IT15基因（CAG)ｎ串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)。

七脆性X綜合征（fragileXsyndrome,FraX）1．FMR-15′端(CGG)n重復(fù)異常2．FMR-15′端CpG島的異常甲基化3．缺失4．點突變脆性X綜合征的分子診斷