干旱脅迫對水稻類囊體膜蛋白質(zhì)組的變化研究第1頁/共40頁目錄1、研究背景及意義2、研究內(nèi)容及研究目標(biāo)3、研究方案及可行性分析4、本研究的特色與創(chuàng)新之處5、研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果6、研究基礎(chǔ)第2頁/共40頁水稻是世界上最重要的三大糧食作物之一，養(yǎng)活了世界一半以上的人口。水稻也是我國的第一大農(nóng)作物，在糧食生產(chǎn)和國民經(jīng)濟(jì)中起著極其重要的作用。

1、研究背景及意義第3頁/共40頁影響水稻產(chǎn)量的因素產(chǎn)量增加培育高產(chǎn)新品適宜生長條件加強(qiáng)管理病蟲害惡劣環(huán)境疏于管理產(chǎn)量降低水稻第4頁/共40頁水分虧缺造成的植物生長減緩和作物減產(chǎn)的損失超過了其他逆境因素減產(chǎn)的總和。

第5頁/共40頁干旱脅迫對水稻生理生化的影響

當(dāng)干旱等逆境來臨時(shí)，植物可以主動感知環(huán)境刺激信號并激發(fā)各種抗旱反應(yīng)。干旱影響光合作用主要是通過氣孔限制和非氣孔限制兩個(gè)因素造成的。第6頁/共40頁葉片生長受抑制光合有效面積降低氣孔導(dǎo)度下降類囊體膜上光能的吸收、傳遞ATP合成的抑制。羧化效率降低干旱干旱對水稻光合作用的影響第7頁/共40頁類囊體－光合作用的光反應(yīng)場所

四種復(fù)合體（光合系統(tǒng)I－PSI，光合系統(tǒng)II－PSII，ATP合成酶系，細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體）至少含有70種蛋白質(zhì)用以完成光合反應(yīng)。蛋白質(zhì)在質(zhì)體基因組與核基因組的協(xié)同表達(dá)，蛋白質(zhì)積累和合成許多輔助蛋白的協(xié)同作用機(jī)制都是需要解決的問題。第8頁/共40頁本實(shí)驗(yàn)選用基因組測序完成的日本晴作為材料，將干旱脅迫對水稻葉片的光合特性的影響和對水稻類囊體膜蛋白質(zhì)組的影響相結(jié)合進(jìn)行研究，以期從微觀的蛋白質(zhì)組水平上闡明宏觀上干旱影響水稻光合生理的機(jī)制。為培育抗干旱的高產(chǎn)水稻新品種提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究意義第9頁/共40頁1、干旱脅迫對水稻生理活性的影響2、干旱脅迫對水稻類囊體膜蛋白質(zhì)組的影響

3、干旱脅迫對水稻光合生理變化的調(diào)控機(jī)理

2.1研究內(nèi)容2、研究內(nèi)容及目標(biāo)第10頁/共40頁

2.1.1干旱脅迫對水稻生理活性的影響干旱不但明顯降低了植株的凈光合速率，使葉綠體超微結(jié)構(gòu)損壞，葉綠素含量降低，而且降低了Rubisco酶和碳酸酐酶等酶的活性。干旱也影響了其他與光合作用有關(guān)的生理生化過程，如降低氣孔導(dǎo)度，使光合產(chǎn)物運(yùn)輸受阻等。當(dāng)干旱達(dá)到一定程度，植物的光合機(jī)構(gòu)就會遭到破壞，使光合能力出現(xiàn)大幅的下降。第11頁/共40頁收集處理和對照葉片處理移栽育秧選種日本晴測光合速率，熒光等生理指標(biāo)移栽于水培池中干旱處理第12頁/共40頁

類囊體膜有四種復(fù)合體（光合系統(tǒng)I－PSI，光合系統(tǒng)II－PSII，ATP合成酶系，細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體），它們各自又都有著輔助蛋白。這四種復(fù)合體至少含有70種蛋白質(zhì)用以完成光合反應(yīng)。干旱會引起類囊體膜上光能的吸收、傳遞和ATP合成的抑制。2.1.2干旱脅迫對水稻類囊體膜蛋白質(zhì)組的影響

第13頁/共40頁2.1.3干旱脅迫對水稻光合生理變化的調(diào)控機(jī)理

干旱是導(dǎo)致水稻光合潛能不能充分發(fā)揮、進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)量降低的最重要的環(huán)境因素。從蛋白質(zhì)組水平可以更好地闡明干旱脅迫影響水稻光合生理的機(jī)制，如對光合作用光能利用效率和碳同化作用調(diào)節(jié)機(jī)理的認(rèn)識等。第14頁/共40頁2.2研究目標(biāo)（1）干旱處理?xiàng)l件下水稻生理生化特性（2）建立或完善一套符合本實(shí)驗(yàn)室的葉綠體（及其亞組分）膜蛋白的提取和鑒定方法（3）建立干旱處理的類囊體膜蛋白質(zhì)組的變化圖譜（4）初步闡明干旱脅迫影響水稻光合生理的機(jī)制第15頁/共40頁2.3擬解決的關(guān)鍵問題（1）如何簡單有效分離高純度的類囊體膜蛋白

（比如尋找適合水稻類囊體膜蛋白質(zhì)組研究的裂解液配方等）（2）水稻類囊體膜蛋白質(zhì)組圖譜的建立（3）推斷水稻光合作用受干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)理以及植物對干旱環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制第16頁/共40頁3.主要的實(shí)驗(yàn)方法3.1生理指標(biāo)的測定方法（1）土壤含水量的測定土壤含水量（％）＝（土壤濕重－土壤干重）/土壤濕重×100（2）葉片水勢的測定葉片水勢用壓力室法（Soilmoisture）測定。（3）葉片光合速率、氣孔導(dǎo)度和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定用LI-6400P光合儀測水稻倒二葉的光合速率和氣孔導(dǎo)度。用葉綠素?zé)晒鈨x測水稻倒二葉葉綠素?zé)晒鈪?shù)。第17頁/共40頁完整葉綠體沉淀破碎葉綠體1.2mol/L蔗糖梯度液1.5mol/L蔗糖梯度液圖2蔗糖密度梯度離心后各梯度的組分示意第18頁/共40頁加入10倍體積的含0.07％β－巰基乙醇的丙酮類囊體膜-20℃沉淀45min4℃，35000×g離心15min10倍體積的含10％TCA的丙酮溶液加入4℃，35000×g離心15min沉淀物適量LysisSolutionI加入37℃，水浴1hr同時(shí)充分?jǐn)嚢枨页暡ㄕ鹗?次20℃，19000×g離心15min取上清液沉淀物10倍體積的含0.07％β－巰基乙醇的丙酮-20℃沉淀1hr加入4℃，35000×g離心15min重復(fù)2—3次真空凍干圖2蛋白質(zhì)提取流程圖3.2類囊體膜蛋白質(zhì)的提取第19頁/共40頁3.3Westernblotting法鑒定類囊體膜

第20頁/共40頁類囊體膜蛋白質(zhì)組的Westernblotting結(jié)果A、B分別是用抗PSI抗體、抗LHCII抗體檢測的結(jié)果；泳道1、2的上樣量分別為50μg、100μg；AB1212118kDa90kDa49kDa35kDa26kDa19kDaPSILHCII圖3水平半干式電泳印跡示意水平半干式電泳印跡示意第21頁/共40頁蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法樣品全息制備雙向凝膠電泳圖像分析質(zhì)譜和蛋白質(zhì)鑒定第22頁/共40頁TheCompleteProteomicsSolutionSamplePrepImageacquisitionImageanalysisSamplelabelling2DSeparationAutomatedspotpickingAutomatedspotdigestionAutomatedMALDIspottingMSLaboratoryworkflowsystem第23頁/共40頁樣品制備固相pH梯度膠條的水化第一向等電聚焦第二向SDS檢測染色3.4雙向電泳第24頁/共40頁硝酸銀染色電泳后的凝膠固定液固定，脫色搖床振蕩1h敏化液增敏30min銀染液搖床振蕩20min顯色液顯色，大約3min終止液停顯10min水洗5min,重復(fù)3次水洗5min,重復(fù)3次染色后的凝膠第25頁/共40頁3.5圖像分析凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫的建立：第26頁/共40頁3.6數(shù)據(jù)庫比對差異蛋白質(zhì)MascotWizard軟件（MatrixScienceLtd.），設(shè)置適當(dāng)?shù)膮?shù)和數(shù)據(jù)庫，對目的蛋白質(zhì)的PMF進(jìn)行網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫匹配。根據(jù)實(shí)際等電點(diǎn)和分子量以及匹配的結(jié)果確定與目的蛋白質(zhì)的PMF最相符的蛋白質(zhì)。第27頁/共40頁3.7可行性分析（1）本實(shí)驗(yàn)所提出的技術(shù)路線和實(shí)驗(yàn)方案是切實(shí)可行的；（2）本研究所涉及的一些關(guān)鍵技術(shù)和研究方法

都是本實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法；

（3）本實(shí)驗(yàn)是由工作多年的青年教師完成，長期從事蛋白質(zhì)化學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究工作，積累了比較豐富的經(jīng)驗(yàn)。第28頁/共40頁4、本研究的特色與創(chuàng)新建立水稻蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)平臺建立了一套分離純化水稻葉綠體和類囊體膜蛋白并對其鑒定的系統(tǒng)方法。建立研究水稻（日本晴）響應(yīng)干旱后類囊體膜蛋白質(zhì)組的變化以及闡明干旱脅迫影響水稻光合生理的機(jī)制的系統(tǒng)方案第29頁/共40頁第一階段：栽培獲取材料和生理數(shù)據(jù)的測定。第二階段：類囊體膜的分離、提取蛋白第三階段：雙向電泳和圖像分析第四階段：差異點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，網(wǎng)上搜庫比對第五階段：整理數(shù)據(jù)，完成論文5.1研究計(jì)劃5、研究計(jì)劃及預(yù)期結(jié)果第30頁/共40頁5.2預(yù)期研究結(jié)果（1）測定干旱處理?xiàng)l件下水稻生理生化特性（2）建立或完善一套符合本實(shí)驗(yàn)室的葉綠體（及其亞組分）膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法（3）建立干旱處理的水稻類囊體膜蛋白質(zhì)組的雙向電泳圖譜，初步闡明干旱脅迫影響水稻光合生理的機(jī)制第31頁/共40頁6.1工作基礎(chǔ)土壤干旱處理水稻樣品培育技術(shù)土壤含水量的測定技術(shù)水稻蛋白質(zhì)的提取和定量技術(shù)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)雙向電泳技術(shù)銀染和考染技術(shù)圖象分析技術(shù)水稻蛋白質(zhì)的原位酶解技術(shù)質(zhì)譜分析技術(shù)

6、研究基礎(chǔ)第32頁/共40頁6.2前期研究工作的積累

隨著干旱進(jìn)行，土壤含水量迅速下降，但兩品種的土壤含水量下降的速度和程度存在比較大的差異。9311的土壤含水量的下降速度和程度大于日本晴的土壤含水量。圖3停止灌水后土壤含水量的變化（1）土壤干旱對土壤含水量(SWC)的影響第33頁/共40頁（2）土壤干旱對水稻葉片水勢的影響

隨著停止灌溉時(shí)間的延長，9311和日本晴葉片水勢均呈現(xiàn)明顯下降趨勢，品種間差異與土壤含水量的變化相似。圖4土壤干旱對水稻葉片水勢的影響第34頁/共40頁（3）土壤干旱和強(qiáng)光處理對葉片光合速率的影響圖5土壤干旱和強(qiáng)光對水稻葉片光合速率的影響上圖為日本晴，下圖為9311。箭頭表示重新灌水時(shí)間葉片的光合速率隨著土壤干旱程度的不斷加劇而下降，兩水稻品種表現(xiàn)出類似的變化趨勢。復(fù)水后葉片的光合速率又恢復(fù)到干旱前的水平。強(qiáng)光對兩品種葉片光合速率有顯著的抑制作用（即光抑制），且抑制的程度隨干旱程度的加劇而加重。第35頁/共40頁（4）干旱和強(qiáng)光對葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊戨S著干旱程度的加深，日本晴的Fv/Fm迅速下降，復(fù)水以后重新回升。光抑制的情況下，F(xiàn)v/Fm下降更為顯著。Fv’/Fm’呈現(xiàn)相似的變化趨勢，但是強(qiáng)光處理對Fv’/Fm’的變化影響不大圖6土壤干旱和強(qiáng)光對水稻日本晴葉片PSII光化學(xué)量子產(chǎn)量的影響第36頁/共40頁（5）水稻葉片葉綠體提取和完整率的鑒定

采用差速離心和蔗糖密度梯度離心等方法所獲得的葉綠體經(jīng)過熒光顯微鏡和光學(xué)顯微鏡檢測，完整率和純度高。

AB圖7分離獲得的水稻葉片葉綠體熒光照片（A）和光學(xué)顯微鏡照片