細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)----腫瘤研究小組成員黃辰教授博士侯妮講師博士劉利英高級實驗師博士楊娟副教授

博士陳妍珂副教授博士趙凌宇講師博士劉穎勛講師博士秦棪楠講師博士郭波講師博士王魯敏講師博士王曉霏實驗室碩士第一頁，共68頁。細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)----腫瘤研究小組研究平臺實驗室建設(shè)模塊大型儀器檢測室普通功能實驗室動物飼養(yǎng)室形態(tài)學(xué)檢測細(xì)胞生物學(xué)分子生物學(xué)流式細(xì)胞儀激光共聚焦顯微鏡圖像分析系統(tǒng)定量PCR膜片鉗蛋白組學(xué)芯片點樣雜交系統(tǒng)激光捕獲顯微切割系統(tǒng)小動物活體成像系統(tǒng)動物行為學(xué)第二頁，共68頁。細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)----腫瘤研究小組實驗環(huán)境技術(shù)集成（開設(shè)高端生物醫(yī)學(xué)實驗課程）一站式的科研基地（實現(xiàn)功能實驗室與大型儀器聯(lián)動）嚴(yán)格管理與人性化統(tǒng)一寬松學(xué)術(shù)氛圍與嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)態(tài)度第三頁，共68頁。細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)----腫瘤研究小組研究方向心理應(yīng)激與疾病建立了恐懼聲音心理應(yīng)激模型

探索了心理應(yīng)激與腫瘤發(fā)生關(guān)系探索了心理應(yīng)激對學(xué)習(xí)記憶的生物學(xué)效應(yīng)探索了心理應(yīng)激對雄性生殖的生物學(xué)效應(yīng)第四頁，共68頁。細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)----腫瘤研究小組研究方向2.腫瘤發(fā)生發(fā)展機制非編碼RNA與腫瘤的關(guān)系

腫瘤的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制（MECP2）

RNA結(jié)合蛋白、mRNA與非編碼RNA的相互作用在腫瘤中

的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控第五頁，共68頁。細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)----腫瘤研究小組研究方向3.生物標(biāo)志物篩選腫瘤血清標(biāo)志物的篩選

自閉癥血清標(biāo)志物的篩選

高原習(xí)服標(biāo)志物的篩選第六頁，共68頁。細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)----腫瘤研究小組研究方向4.糖修飾組學(xué)在疾病中的作用腫瘤糖修飾組學(xué)

自閉癥糖修飾組學(xué)

高原習(xí)服糖修飾組學(xué)第七頁，共68頁。科學(xué)研究是科學(xué)工作者的幸福源泉幸福就在于人的感性生活，在于感性欲望的滿足與快樂。幸福的過程有神經(jīng)遞質(zhì)的釋放（多巴胺與內(nèi)啡肽）?？茖W(xué)研究的幸?？梢宰晕艺瓶?。第八頁，共68頁。為什么科學(xué)研究是一種痛苦？課題死了么？

1.結(jié)論已經(jīng)發(fā)表

2.推理已經(jīng)證實

3.技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用

4.實驗無法實現(xiàn)

5.時間不夠用發(fā)散思維第九頁，共68頁。從科學(xué)的痛苦到科學(xué)的幸福的基礎(chǔ)創(chuàng)新性可讀性信息量文獻(xiàn)內(nèi)容解決問題創(chuàng)新之處意義所在技術(shù)實現(xiàn)文章理念文獻(xiàn)內(nèi)容是否支持作者觀點自身研究研究方向最終目標(biāo)實驗技能課題技巧思考消化第十頁，共68頁。如何將科學(xué)研究的痛苦變成幸福？跟蹤性研究思路橫向移植的研究縱向連接的研究ABEACEADE…………AB源頭跟蹤模仿BC源頭跟蹤模仿ABC將科學(xué)研究變得簡單第十一頁，共68頁。研究思路——跟蹤性研究思路發(fā)現(xiàn)某基因在肝癌組織中表達(dá)增高，并有很多機制研究樣本差異查文獻(xiàn)后，確定在乳腺癌中尚無人涉及。SCI處女作出爐：某基因在乳腺癌組織中表達(dá)增高。

已發(fā)表內(nèi)容自身研究內(nèi)容第十二頁，共68頁。研究思路——跟蹤性研究思路發(fā)現(xiàn)辛伐他汀有某種作用，能夠治療某種臨床疾病，且對其原理進(jìn)行了研究，找到了相關(guān)基因。

藥物處理差異聯(lián)想到了阿托伐他汀。SCI處女作出爐：阿托伐他汀對某疾病的治療效果及其作用機制。

已發(fā)表內(nèi)容自身研究內(nèi)容第十三頁，共68頁。研究思路——跟蹤性研究思路發(fā)現(xiàn)某基因具有抗氧化應(yīng)激的作用機制相似性聯(lián)想到氧化應(yīng)激在好多疾病的病理機制中都發(fā)揮作用，比如糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變等等。SCI處女作出爐：某基因在糖尿病腎病中的作用。

已發(fā)表內(nèi)容自身研究內(nèi)容第十四頁，共68頁。研究思路——跟蹤性研究思路發(fā)現(xiàn)A基因具有某種作用。信號通路聯(lián)想到A基因的上游或下游基因是B基因，是否也有這種作用？SCI處女作出爐：B基因具有某種作用。

已發(fā)表內(nèi)容自身研究內(nèi)容第十五頁，共68頁。研究思路——跟蹤性研究思路問題1：腫瘤的表觀調(diào)控第十六頁，共68頁。研究思路——跟蹤性研究思路問題2：MeCP2在胃癌中的作用如何？第十七頁，共68頁。研究思路——跟蹤性研究思路問題3：什么分子調(diào)控了MeCP2？第十八頁，共68頁。研究思路——跟蹤性研究思路問題4：MeCP2調(diào)控了什么分子？染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP-on-chip)第十九頁，共68頁。研究思路——跟蹤性研究思路假設(shè)與結(jié)果第二十頁，共68頁。研究思路——跟蹤性研究思路發(fā)現(xiàn)某種藥物能夠?qū)NF-α產(chǎn)生影響。家族基因拜讀大作后，聯(lián)想到IL-6以及CRP都是炎癥因子，有可能這種藥物對IL-6以及CRP也有影響。SCI處女作出爐：某種藥物對IL-6以及CRP的影響。

已發(fā)表內(nèi)容自身研究內(nèi)容第二十一頁，共68頁。研究思路——基于技術(shù)跟蹤的新探索各種組學(xué)不同樣本不同處理生物信息分析靶分子驗證問題的解釋第二十二頁，共68頁。研究思路——基于技術(shù)跟蹤的新探索收集臨床樣本RNADNAProteinmicroRNA芯片基因芯片組織芯片RT-PCR或Real-timePCRWestern-blot免疫組化基因表達(dá)差異確定目的基因參考文獻(xiàn)microRNA研究第二十三頁，共68頁。研究思路——基于技術(shù)跟蹤的新探索問題1：自閉癥診斷困難興趣范圍狹窄和刻板的行為模式語言交流障礙社會交往障礙第二十四頁，共68頁。研究思路——基于技術(shù)跟蹤的新探索問題2：自閉癥的遺傳因素復(fù)雜第二十五頁，共68頁。研究思路——基于技術(shù)跟蹤的新探索問題3：為什么自閉癥有共同的特征？第二十六頁，共68頁。研究思路——基于技術(shù)跟蹤的新探索問題4：如何尋找自閉癥的生物標(biāo)志物？生物芯片或磁珠化學(xué)芯片或磁珠疏水芯片

陽離子交換金屬芯片親水芯片

抗原-抗體受體-配體DNA-Protein陰離子交換PS10orPS20第二十七頁，共68頁。ChoosediseaseBothtumorpatientsandhealthcontrols

Collectingsamplesserum……SamplequalityisveryimportantBloodsampleswerecollectedbytrainedphlebotomist,andprocessedwithinafewhoursaccordingtoastandardprotocol.Aliquotsofseraformassspectrometricanalysiswerefrozenat-80℃immediatelyafterprocessing.SeparationproteinsbyTheliquidchipClinProtBeadsClinProtBeadsClinProtBeadshydrophobicityMB-HIC1

MB-HIC3MB-HIC8

MB-HIC18weakanionandweakcationMB-WCX

MB-WAXmetalions

MB-IMAC-Fe

MB-IMAC-Cu第二十八頁，共68頁。Massspectrumanalysis第二十九頁，共68頁。峰質(zhì)量變化倍數(shù)基因名稱鑒定序列43881.971.78SERPINA5SARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP64089.211.61FGAGDSTFESKSYKMADEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV84208.051.73ASLFVAEFLFWASLCM*THLSRM*AEDLILYCTKEFSFVQ表1串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的可能的ASD相關(guān)蛋白

l研究結(jié)果第三十頁，共68頁。新的問題或未解決的問題所有技術(shù)為我所用研究思路——基于新現(xiàn)象觀察下的新探索第三十一頁，共68頁。

基因功能的分析基因功能研究目的基因表達(dá)調(diào)控細(xì)胞水平動物水平活性周期運動分化衰老凋亡……….模式動物藥物處理臨床樣本收集組織水平動物組織穩(wěn)定細(xì)胞系藥物處理成瘤實驗……….免疫組化qPCRWB……….第三十二頁，共68頁。按照論文結(jié)構(gòu)的實驗設(shè)計分子準(zhǔn)備工作、前期初步實驗結(jié)果引入細(xì)胞/組織水平現(xiàn)象作用機制切入作用機制深入可選：模式細(xì)胞/動物驗證旁通機制臨床樣本驗證模式圖Diagram123456qPCRWBWBWBRNAiIFFCMIHCDrugsMorphology第三十三頁，共68頁。基因突變與沉默技術(shù)——RNAi1990年，Jorgensen將色素的基因?qū)氚珷颗?petunias)，發(fā)現(xiàn)了共抑制現(xiàn)象(cosuppression)。1995年，Guo等應(yīng)用parI基因的反義RNA處理線蟲產(chǎn)生了parI基因功能缺失型或基因敲除型的表型。1998年，F(xiàn)ire和Mello證實Guo發(fā)現(xiàn)的正義RNA或反義RNA誘導(dǎo)基因表達(dá)抑制是由微量dsRNA而引起。提出RNA干涉(RNAinterference,RNAi)的概念。第三十四頁，共68頁。基因突變與沉默技術(shù)——RNAiDouble-strandedRNAinjectC.elegansNeg.controlUninjectedAntisenseRNAdsRNAsenseantisenseNature1998391:806-811Mex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridizationAndrewZ.Fire(StanfordUniversityphoto)

CraigC.Mello(UniversityofMassachusettsMedicalSchool)第三十五頁，共68頁?；蛲蛔兣c沉默技術(shù)——RNAidsRNA~22ntsiRNAstargetmRNAsecondarysiRNAsamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreading第三十六頁，共68頁?；蛲蛔兣c沉默技術(shù)——RNAiC.elegansDrosophilaArabidopsisamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreadingDICERDCR-1CAFAGO2RDE-1AGO1RISCSID-1RRF-1SDE-1/SGS-2RDE-4VIGCG1800Fmr1第三十七頁，共68頁。基因突變與沉默技術(shù)——RNAiC.elegansDrosophilaArabidopsisamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreadingDICERDCR-1CAFAGO2RDE-1AGO1RISCSID-1RRF-1SDE-1/SGS-2RDE-4VIGCG1800Fmr1第三十八頁，共68頁。InitiationStepATPATPADP+ppiADP+ppiDICERKINASERdRP第三十九頁，共68頁。Dicer第四十頁，共68頁。siRNA5’3’5’3’RISC第四十一頁，共68頁。EffectorStepsiRNAbindingsiRNAunwindingRISCactivation第四十二頁，共68頁?；蛲蛔兣c沉默技術(shù)——RNAi研究案例小英家系小英的心電圖顯性負(fù)效應(yīng)第四十三頁，共68頁。基因突變與沉默技術(shù)——RNAi研究案例第四十四頁，共68頁。基因突變與沉默技術(shù)——RNAi研究案例第四十五頁，共68頁。基因突變與沉默技術(shù)——RNAi研究案例第四十六頁，共68頁?；蛲蛔兣c沉默技術(shù)——RNAi研究案例HeartRhythm.2013,10（1）：128–136第四十七頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——ZFNs技術(shù)

鋅指核酸酶是鋅指蛋白和FokI核酸內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域組成的嵌合融合蛋白,其鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)識別靶位點,依賴FokI的作用打斷DNA雙鏈,從而造成雙鏈斷裂，斷開的雙鏈DNA在修復(fù)過程中會發(fā)生堿基的缺失、插入、同源交換等突變。第四十八頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——ZFNs技術(shù)鋅指核酸酶：鋅指蛋白Fokl+識別區(qū)域酶切區(qū)域靶點選擇受限?！吧舷挛男?yīng)”。Off-targeting現(xiàn)象嚴(yán)重。ZFNs的合成組裝技術(shù)難度大。第四十九頁，共68頁?；蛲蛔儭⑶贸c沉默技術(shù)——TALENs技術(shù)2009年，Boch等和Moscou等破解黃單胞菌效應(yīng)子蛋白TALE（transcriptionactivator-likeeffectors）與寄主靶基因DNA特異性識別分子密碼。2011年SangamoBioSciences公司和哈佛大學(xué)的兩個研究小組分別利用TALENs技術(shù)進(jìn)行了基因組靶向修飾相關(guān)研究。第五十頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——TALENs技術(shù)TALEnuclease結(jié)構(gòu)DNA識別區(qū)（TALE蛋白）：TALE蛋白是由植物病原體黃單胞菌屬分泌的一種蛋白,能特異性的識別并結(jié)合DNA序列。剪切結(jié)構(gòu)域（Fokl）：Fokl則可通過二聚化產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性,在該序列附近造成DNA的雙鏈斷裂(Double-standbreak,DSB)。第五十一頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——TALENs技術(shù)TALE蛋白TALE蛋白是由12個或以上特異性識別DNA的串聯(lián)“蛋白模塊”和兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成。每個“蛋白模塊”包含34個氨基酸，第12和13位殘基是靶向識別的關(guān)鍵位點，被稱作重復(fù)可變的雙連氨基酸殘基位點（RepeatVariantDi-residue,RVD）。每個蛋白模塊上RVDs對應(yīng)識別一個堿基。第五十二頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——TALENs技術(shù)Fokl核酸內(nèi)切酶TALENsZFNsFokl酶只有形成二聚體時才具有酶切活性，所以每次必須設(shè)計一對TALENs，在實際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（一般十幾個堿基）分別進(jìn)行TALE識別模塊構(gòu)建。TALENs和ZFNs使用相同的Fokl酶。第五十三頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——TALENs技術(shù)基因敲除步驟--

TALE靶點識別模塊構(gòu)建Fourbasicsingle-unitvectors第五十四頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——TALENs技術(shù)基因敲除步驟--

TALE靶點識別模塊構(gòu)建第五十五頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——TALENs技術(shù)基因敲除步驟TALENs質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，其表達(dá)的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點并與靶位點特異結(jié)合。此時，兩個TALENs融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個靶位點之間打斷目標(biāo)基因。誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機制，主要有非同源末端連接（NHEJ）和同源直接修復(fù)（HDR）。在此修過程中形成一定的插入或缺失突變，即形成目標(biāo)基因敲除突變體。第五十六頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——TALENs技術(shù)TALENs的優(yōu)勢TALE的核酸識別單元與A、G、C、T有恒定的對應(yīng)關(guān)系。靶序列識別模塊不受上下游影響，特異識別并打斷基因組中的任意靶序列。無基因序列、細(xì)胞、物種限制。毒性低、脫靶情況少。成對的TALE識別模塊保證了基因敲除靶點的準(zhǔn)確性。第五十七頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——TALENs技術(shù)TALENs的應(yīng)用領(lǐng)域第五十八頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——CRISPR-Cas技術(shù)CRISPR-Cas：由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。第五十九頁，共68頁?；蛲蛔儭⑶贸c沉默技術(shù)——CRISPR-Cas技術(shù)CRISPR結(jié)構(gòu)CRISPR：clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats

是一個特殊的DNA重復(fù)序列家族,廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR位點通常由短的高度保守的重復(fù)序列組成,重復(fù)序列的長度通常21～48bp,重復(fù)序列之間被26～72bp間隔序列隔開。CRISPR就是通過這些間隔序列與靶基因進(jìn)行識別。第六十頁，共68頁?；蛲蛔?、敲除與沉默技術(shù)——CRIS