轉(zhuǎn)基因與動物克隆

的概況與進展轉(zhuǎn)基因——概況轉(zhuǎn)基因——進展動物克隆——概況動物克隆——進展主要內(nèi)容轉(zhuǎn)基因與動物克隆人工轉(zhuǎn)基因：將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，使之穩(wěn)定遺傳與表達，同義詞有“遺傳工程”、“基因工程”、“遺傳轉(zhuǎn)化”等。經(jīng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾的生物體常被稱為“遺傳修飾過的生物體”（Geneticallymodifiedorganism，簡稱GMO）。自然轉(zhuǎn)基因：自然界自發(fā)的基因在不同動物或植物間的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因植物：含有并能穩(wěn)定遺傳和表達外源基因的植物。

轉(zhuǎn)基因動物：含有并能穩(wěn)定遺傳和表達外源基因的動物。動物克隆：“clone”源于希臘語的“klōn”（嫩枝）。通常是指以人工誘導(dǎo)或自然發(fā)生的無性生殖方式產(chǎn)生與原個體有完全相同基因組之后代的過程。動物克隆即是一種通過核移植過程進行無性繁殖的技術(shù)，即通過核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細胞核供體動物相同的動物個體的過程。

51983年，華盛頓大學(xué)Chilton等培育出抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因野生煙草；比利時的JeffSchell等培育出抗卡那霉素和氨甲喋呤的轉(zhuǎn)基因煙草；孟山都的RobertFraley等培育出抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因矮牽?；?；威斯康辛的JohnKemp

等將一大豆基因轉(zhuǎn)入向日葵中。1990年，首例轉(zhuǎn)基因酵母食品在英國被批準(zhǔn)上市；90年代初，由加利福尼亞Calgene公司研制的FlavrSavr轉(zhuǎn)基因番茄上市。TheWashingtonUniversitygroup,headedbyMary-DellChilton,hadproducedcellsof

Nicotianaplumbaginifolia,acloserelativeofordinarytobacco,thatwereresistanttotheantibiotickanamycin(Framondetal.,1983).JeffSchellandMarcVanMontagu,workinginBelgium,hadproducedtobaccoplantsthatwereresistanttokanamycinandtomethotrexate(氨甲蝶呤),adrugusedtotreatcancerandrheumatoidarthritis(Schelletal.,1983).RobertFraley,StephenRogers,andRobertHorschatMonsantohadproducedpetuniaplants（矮牽?；ǎ?/p>

thatwereresistanttokanamycin(Fraleyetal,1983a).TheWisconsingroup,headedbyJohnKempandTimothyHall,hadinsertedabeangeneintoasunflowerplant.轉(zhuǎn)基因植物發(fā)展簡史Calgene,Inc.,abiotechnologycompanywithheadquartersinDavis,California,hasdevelopedatomatowithagenethatslowsthenaturalsofteningprocessthataccompaniesripening.ThecompanysaysthattheirFlavrSavrtomatospendsmoredaysonthevinethanothertomatoes,resultinginmoreflavor,yetremainsfirmenoughtobeshipped.

Calgene‘sscientistsisolatedthePG（

polygalacturonase,聚半乳糖醛酸酶

）

geneintomatoplants.ThenextstepwastoconvertthetomatoPGgeneintoareverseimageofitselfcalledanantisenseorientation.Thescientistscalledthis“reversed”tomatogenetheFlavrSavrgeneandreintroduceditintotheplants.轉(zhuǎn)基因番茄FlavrSavr的研制Calgene公司培育延熟保鮮番茄過程：1）從番茄植株中分離聚半乳糖醛酸酶基因PG；2）將PG基因轉(zhuǎn)變成反義拷貝、稱之為FlavrSavr基因；3）將FlavrSavr基因重新導(dǎo)入番茄植株體內(nèi)；InordertotelliftheFlavrSavrgenewassuccessfullyreintroducedintotheplants,Calgenescientistsattachedagenethatmakesanaturallyoccurringproteinthatrendersplantsresistanttotheantibiotickanamycin.Byexposingtheplantstotheantibiotic,CalgenescientistscouldtellwhichplantshadacceptedtheFlavrSavrgene.TheonesunaffectedbykanamycingrowtohavethedesiredtraitsoftheFlavrSavr.轉(zhuǎn)基因番茄FlavrSavr的研制4）為了檢驗FS基因是否成功導(dǎo)入進植株，科學(xué)家在FS基因后面附加了一個抗卡那霉素的基因，然后將受體植株暴露于卡那霉素中，不受卡那霉素影響的受體植株同時也是整合了SF基因的植株。9Firstbiotechplantproduct–Flav’rSav’rtomato轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品與對照產(chǎn)品

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉和普通棉對照轉(zhuǎn)基因耐貯藏番茄（左）和普通番茄（右）轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)傳統(tǒng)技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相同本質(zhì)都是通過獲得優(yōu)良基因進行遺傳改良區(qū)別在生物種內(nèi)個體間的基因轉(zhuǎn)移不受生物體間親緣關(guān)系的限制整個基因組的操作和轉(zhuǎn)移明確定義的基因的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展——全球概況農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國際服務(wù)組織（ISAAA）執(zhí)行綱要簡報

1996-2005年，生物技術(shù)作物全球累計種植面積為4.75億公頃，，10年間累計的全球市場價值約為293億美元。14自從1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來，至今已有120種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。1996年全球大面積種植，并不斷擴大。國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)局（ISAAA）統(tǒng)計結(jié)果轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀15轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品銷售情況：2010年轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品年銷售額達到200億美元，1500萬農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物。轉(zhuǎn)基因作物種植國家情況：美國（59%），阿根廷（20%），加拿大（6%）中國（5%），歐洲很少美國最早批準(zhǔn)種植轉(zhuǎn)基因作物2004年3月英國批準(zhǔn)大面積種植轉(zhuǎn)基因作物，但要求非常嚴(yán)格。2005年德國通過法案，嚴(yán)格限制（包括實驗室研究）。17轉(zhuǎn)基因作物種類：大豆、玉米、棉花和油菜等，大豆面積最大。

目標(biāo)性狀：抗除草劑大豆、玉米和棉花占轉(zhuǎn)基因作物74%?？瓜x和抗病毒?。築t玉米、Bt棉花占19%。耐除草劑+抗蟲性雙價的轉(zhuǎn)基因棉花和玉米占7%。18我國轉(zhuǎn)基因作物研究與利用概況

我國是世界上商品化種植轉(zhuǎn)基因作物最早的國家之一。自行培育的雙價轉(zhuǎn)基因煙草的抗病蟲性能達到60％，產(chǎn)量比對照增加15％，產(chǎn)值增加20％，1992年每畝增收200元，現(xiàn)已退出應(yīng)用。

至1999年我國已批準(zhǔn)中試的轉(zhuǎn)基因作物有48項：包括水稻、小麥、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、煙草、廣藿香等11種作物；主要目標(biāo)性狀是抗蟲、抗病、耐鹽、抗凍、耐儲藏和抗衰老等。已批準(zhǔn)環(huán)境釋放的有49個品種，涉及水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、甜椒、線辣椒、棉花、楊樹、煙草等10種作物。

轉(zhuǎn)基因操作流程示意圖基因工程示意圖21轉(zhuǎn)基因育種的程序基因分離體外重組轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體安全性評價結(jié)合常規(guī)育種轉(zhuǎn)基因品種遺傳穩(wěn)定性評價市場開發(fā)載體的構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因槍轟擊篩選22(一)目的基因的獲得

根據(jù)獲得基因的途徑分為兩大類：根據(jù)基因表達的產(chǎn)物—蛋白進行基因克隆；從基因組DNA或mRNA序列克隆基因。1.根據(jù)基因表達的產(chǎn)物—蛋白進行基因克隆主要步驟如下：利用這種方法人類首次人工合成了胰島素基因。雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。局限性：兼并密碼子、效率低、未知基因及產(chǎn)物。分離蛋白質(zhì)明確氨基酸序列推導(dǎo)核苷酸序列人工合成232.從基因組DNA或mRNA序列克隆基因

(1)同源序列法(HomologyBasedCandidateGeneMethod)根據(jù)基因家族成員所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有保守氨基酸序列的特點克隆基因家族未知成員。氨基酸序列比較設(shè)計簡并引物PCR擴增文庫篩選/RACE25（3）根據(jù)連鎖圖譜克隆目的基因的圖位克隆技術(shù)26(4)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法：轉(zhuǎn)座子是一段可復(fù)制、移動的DNA片段。當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個功能基因內(nèi)部時，就會引起該基因的失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型；當(dāng)轉(zhuǎn)座子再次轉(zhuǎn)座或切離這一位點時，失活基因的功能又可得到恢復(fù)。目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是Ac/Ds玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。插入突變體篩選突變DNA文庫鑒定性狀遺傳分析轉(zhuǎn)座子DNA探針基因部分DNA探針篩選野生型DNA文庫完整目的基因互補實驗29（二）目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

目的基因體外重組到適當(dāng)?shù)囊迅脑斓馁|(zhì)粒中包括保存用中間載體（大腸桿菌寄主）：pBR322、pUC、pBluescriptK、pKS,pGEM-T

繁殖載體（大腸桿菌寄主）：JM109,TOP10

植物轉(zhuǎn)化載體（農(nóng)桿菌寄主）：pBI121,pCAM100130分離基因克隆到某中間載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒限制酶切/連接克隆到植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌基因槍轉(zhuǎn)化pKS,pBR332,pGEM-TJM109,TOP10…HindIII/EcroI…T4ligasepBI121,pCAM1001…LBA4404、EHA31農(nóng)桿菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti質(zhì)粒

Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),

可以轉(zhuǎn)移進入植物基因組。TumorinducedbyA.tumefaciens32TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori已知農(nóng)桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間隙中。T-DNA首先在細菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細胞。auxin33Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，約有200kb組成。根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型(octopine)胭脂堿型(nopaline)農(nóng)桿堿型（agropine）農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型34Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。（2）Vir區(qū)（virulenceregion）該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。（3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations）該區(qū)段上存在著與細菌接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。35野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：①Ti質(zhì)粒分子量過大，一般在160～240kb，比pBR322質(zhì)粒大50倍左右；②大型的野生Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個切點，不能通過體外DNA重組技術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因；③T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，其中Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細胞長成腫瘤，阻礙細胞的分化和植株的再生；④Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制,其重組質(zhì)粒也只能在農(nóng)桿菌中進行擴增；⑤Ti質(zhì)粒上還存在一些對于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。36雙元載體系統(tǒng):binaryTivectorsystem37選擇標(biāo)記必須具備以下四個條件：①編碼一種不存在于正常植物細胞中的酶；②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；③能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達；④檢測容易，并且能定量分析。細菌篩選標(biāo)記基因：產(chǎn)物給予細胞產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細胞不能生長、發(fā)育與分化。而轉(zhuǎn)化細胞對該標(biāo)記產(chǎn)生抗性，不影響其生長等，從而將轉(zhuǎn)化細胞選擇出來，例如，Cat（氯霉素抗性基因）。植物篩選標(biāo)記基因：強調(diào)給轉(zhuǎn)化細胞帶上一種標(biāo)記，起報告和識別作用，故稱報告基因。

38報告基因:Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因）在植物細胞中所產(chǎn)生的葡糖苷酸酶在檢測上具有以下特點：①在一定條件下與X-G1ucuionicacid（5-bromo-4-chioro-3-indoyl-β-D-glucuronicacid）底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍色沉淀，既可以用分光光度計法測定，又可以直接觀察到植物組織中形成的藍色斑點。②當(dāng)加入4-甲基傘形酮基和葡萄糖苷酸時生成4-甲基傘形酮，發(fā)熒光（λ=465nm）。因而可以用熒光光譜法測定。由于熒光強度高，本底低，故熒光檢測極為靈敏。③檢測容易，只需少量植物組織抽提液即可在短時間內(nèi)測定完畢。④價格便宜。3940GFP（綠色熒光蛋白基因）

LUC(螢火蟲熒光素酶基因)報告基因：41啟動子的選擇35S,cauliflowermosaicvirus35Spromoter

CaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.

42(三〕受體材料的選擇

受體是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：1、高效穩(wěn)定的再生能力；2、受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；3、外植體來源方便，如胚和其它器官等；4、對篩選劑敏感；5、轉(zhuǎn)化率高43常用的受體材料有以下幾大類型:1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點：外植體來源廣，繁殖快，易接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率高。缺點：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體，因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)。442.直接分化再生系統(tǒng)：外植體材料細胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點：周期短、操作簡單，體細胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)優(yōu)點：高效、廣泛地攝取外源DNA，獲得基因型一致的克隆細胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點：不易制備、再生困難和變異程度高。454.胚狀體再生系統(tǒng)：是指具有胚胎性質(zhì)的個體。優(yōu)點：個體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強，嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。5.生殖細胞受體系統(tǒng)：以生殖細胞如花粉粒、卵細胞等受體細胞進行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行小孢子和卵細胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。46（四）轉(zhuǎn)基因方法概括起來說主要有兩類：第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。第二類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。471.載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)最常見的轉(zhuǎn)基因方法。將外源基因重組進入適合的載體系統(tǒng)，通過載體將攜帶的外源基因?qū)胫参锛毎显诤巳旧w組中并隨核染色體復(fù)制和表達。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（tumor-inducingplasmid）或Ri質(zhì)粒(root-indcing

plasmid)介導(dǎo)法是迄今為止植物基因工程中應(yīng)用最多、機理最清楚、最理想的載體轉(zhuǎn)移方法。48農(nóng)桿菌共培養(yǎng)侵染誘導(dǎo)愈傷組織分化生芽生根葉盤轉(zhuǎn)化法(1)葉盤法

雙子葉植物較為常用、簡單有效的方法。49

(2)真空滲入法將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。簡便、快速、可靠，不需要組織培養(yǎng)。(3)愈傷組織共培養(yǎng)(4)原生質(zhì)體共培養(yǎng)502.外源基因直接導(dǎo)入法（1）化學(xué)刺激法細胞融合劑：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）(2)基因槍轟擊法（微彈轟擊技術(shù)micro-projectilebombardment)將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，借助高壓動力射入受體細胞或組織，最后整合到植物基因組并得以表達。51Transformationisperformedbygenegunmethod5253(3)微注射法：利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式將受體細胞（原生質(zhì)體或生殖細胞）固定，然后將供體DNA或RNA直接注射進入受體細胞。子房注射法或花粉管通道法：具有較大子房或胚囊的植株可在田間進行活體操作。操作簡便、成本低。54（五）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定1.轉(zhuǎn)化體的篩選使用特異性選擇標(biāo)記基因進行標(biāo)記，有效地選擇出真正轉(zhuǎn)化細胞。常用選擇標(biāo)記基因：抗生素抗性基因除草劑抗性基因?qū)⑦x擇標(biāo)記基因與適當(dāng)啟動子構(gòu)成嵌合基因，克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時進行轉(zhuǎn)化。標(biāo)記基因在受體細胞表達，使轉(zhuǎn)化細胞具有抵抗相應(yīng)抗生素或除草劑的能力而存活下來。非轉(zhuǎn)化細胞則被抑制、殺死。552.轉(zhuǎn)化體的鑒定

通過篩選得到的再生植株初步證明標(biāo)記基因整合進入受體細胞。至于目的基因是否整合到受體核基因組、是否表達，還必須對抗性植株進一步檢測。DNA水平的鑒定檢測內(nèi)容：是否整合、拷貝數(shù)、整合位置。檢測方法：特異性PCR（以外源基因兩側(cè)序列設(shè)計引物）

Southern雜交（外源目的基因序列為探針）56特異性PCR檢測外源基因整合到受體57(2)轉(zhuǎn)錄水平的鑒定常用的方法Northern雜交（標(biāo)記的RNA為探針對總RNA雜交）RT-PCR檢測mRNAcDNAPCR（3）翻譯水平的鑒定為檢測外源基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA能否翻譯，還必須進行翻譯或者蛋白質(zhì)水平檢測。主要方法：Western雜交

58（六）轉(zhuǎn)化體的安全性評價和育種利用根據(jù)有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理規(guī)定、在可控制的條件下進行安全性評價和大田育種利用研究。通過轉(zhuǎn)基因方法往往難以直接獲得理想的品種（系）原因：外源基因失活、純合致死、花粉致死、其它性狀變化等。因此獲得轉(zhuǎn)化體后，應(yīng)結(jié)合雜交、回交、自交等常規(guī)轉(zhuǎn)育手段，最終選育綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因品種。59轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特點：少數(shù)外源基因整合到植株能穩(wěn)定遺傳，正常表達，符合孟德爾遺傳。大多失活或表現(xiàn)復(fù)雜的遺傳方式。原因：受宿主基因組排斥而發(fā)生片段丟失、重排；多拷貝；整合隨機性。整合機制：1、同源重組2、位點特異性重組3、轉(zhuǎn)座4、異常重組60整合后外源基因表現(xiàn)：不表達1、基因丟失2、基因沉默表達1、符合孟德爾遺傳2、獨立轉(zhuǎn)化體之間存在差異3、無規(guī)律61轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性62

直至今天，轉(zhuǎn)基因作物的安全性在全球范圍內(nèi)引起了激烈的爭論。反對者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物具有極大的潛在危險，可能會對人類健康和人類生存環(huán)境造成威脅。在歐洲，轉(zhuǎn)基因作物被一些媒體稱之為“惡魔食品”。（frankensteinfood）。Frankenstein是英國科幻小說中由一個科學(xué)家創(chuàng)造、最終又毀滅了這個科學(xué)家的怪物。那么，人類研制與種植轉(zhuǎn)基因作物到底是毀滅自己，還是拯救自己呢？63國際上有關(guān)轉(zhuǎn)基因作物安全性爭論的幾個典型事件1Pusztai事件：英國Rowett研究所有位Pusztai博士，他用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英國電視臺發(fā)表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到了破壞。后果：綠色和平組織等反生物技術(shù)組織把這種土豆說成“殺手”，并策劃了破壞轉(zhuǎn)基因作物試驗地等行動，焚燒了印度的兩塊試驗田，甚至美國加州大學(xué)戴維斯分校的非轉(zhuǎn)基因試驗材料也遭破壞，以致研究生畢業(yè)論文都無法如期完成。英國皇家學(xué)會組織了同行評審，并于1999年５月發(fā)表評論，指出Pusztai的試驗有六方面的錯誤：不能確定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的化學(xué)成分有差異；對食用轉(zhuǎn)基因土豆的大鼠，未補充蛋白質(zhì)以防止饑餓；供試動物數(shù)量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標(biāo)準(zhǔn)食物，缺少統(tǒng)計學(xué)意義；試驗設(shè)計差；統(tǒng)計方法不當(dāng)；試驗結(jié)果無一致性等。64

2斑蝶事件：

1999年5月，康奈爾大學(xué)的一個研究組在《Nature》雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國大斑蝶，導(dǎo)致44％的幼蟲死亡。這一實驗結(jié)果在科學(xué)上沒有說服力：玉米的花粉非常重，擴散不遠，在玉米地以外５米，馬利筋葉片/CM2上只找到一個玉米花粉；2000年開始在美國三個州和加拿大進行的田間試驗都證明，抗蟲玉米花粉對斑蝶并不構(gòu)成威脅，實驗室試驗中用１０倍于田間的花粉量來喂大斑蝶的幼蟲，也沒有發(fā)現(xiàn)對其生長發(fā)育有影響。斑蝶減少的真正原因，一是農(nóng)藥的過度使用，二是墨西哥生態(tài)環(huán)境的破壞。653加拿大“超級雜草”事件：由于基因漂流，在加拿大油菜地里發(fā)現(xiàn)了個別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級雜草”，并怪罪于轉(zhuǎn)基因?；蚱鞑⒉皇菑霓D(zhuǎn)基因作物開始。如果沒有基因漂流，就不會有進化，世界上也就不會有這么多種的植物和現(xiàn)在的作物栽培品種。舉例來說，小麥由Ａ、Ｂ、Ｄ三個基因組組成，它是由分別帶有Ａ、Ｂ、Ｄ基因組的野生種經(jīng)過基因漂流合成的。所以，以此來禁止轉(zhuǎn)基因作物，也是沒有道理的。66關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物的潛在風(fēng)險:1.轉(zhuǎn)基因植物釋放引發(fā)“超級雜草”目前轉(zhuǎn)入植物的基因以抗除草劑的為多，其次以抗蟲和抗病毒，然后是抗逆。如果這些基因逐漸在野生種群中定居后，就具有選擇優(yōu)勢的潛在可能，成為難以控制的“超級雜草”。672.轉(zhuǎn)基因植物中35S啟動子的生物安全性最常用的啟動子是35S啟動子，該啟動子能夠在植物組織中高水平表達。因此已經(jīng)被引入許多轉(zhuǎn)基因植物中。潛在風(fēng)險問題:35S啟動子內(nèi)有一重組熱點。（1）如果35S啟動子插入到隱性病毒基因組旁，可能會重新活化病毒。（2）啟動子插入到某一編碼毒素蛋白的基因上游，可能會增強該毒素的合成。（3）當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物被動物或人類食用后，35S啟動子可能會插入到某一致癌基因上游，活化并且導(dǎo)致癌變。683.

抗生素抗性標(biāo)記基因的生物安全性抗生素抗性標(biāo)記基因是否導(dǎo)致的在環(huán)境中的傳播。目前，轉(zhuǎn)基因作物都使用細菌編碼的抗生素抗性基因作為選擇性標(biāo)記。在過去的幾年里，越來越多的報道指出:細菌可以獲得對多種抗生素的抗性。這導(dǎo)致人們開始懷疑：轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因是否會轉(zhuǎn)移到細菌中?？剐詷?biāo)記基因是否會通過食物在腸道中水平轉(zhuǎn)移至體內(nèi)微生物，從而影響抗生素治療的有效性?？剐詷?biāo)記基因產(chǎn)物是否使人體產(chǎn)生抗藥性（食品安全性）。694.轉(zhuǎn)基因食品的安全性1994年美國Caigene公司的轉(zhuǎn)基因延熟番茄經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市，成為第一例通過安全評價的轉(zhuǎn)基因植物食品。轉(zhuǎn)基因食品對人類的可能危害主要有3大類：（1）可能含有已知或未知的毒素，對人體產(chǎn)生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的過敏源，引起人體的過敏反應(yīng)。（3）食品某些營養(yǎng)成分或營養(yǎng)質(zhì)量可能產(chǎn)生變化，使人體出現(xiàn)某種病癥。動物克隆克隆技術(shù)發(fā)展簡史

核移植胚胎克隆體細胞克隆克隆羊——多利誕生記動物克隆存在的問題核移植技術(shù)：所謂核移植技術(shù)就是利用顯微操作技術(shù)將一個細胞的細胞核移植到另一個細胞中，或者將兩個細胞的細胞核（或細胞質(zhì)）進行交換，從而可能創(chuàng)造無性雜交生物新品種的一項技術(shù)。胚胎克?。菏褂玫暮斯w細胞如果來自多細胞階段的胚胎，叫做胚胎克隆。體細胞克?。菏褂玫暮斯w細胞來自動物體，叫做體細胞克隆。兩棲類細胞核移植1938年Spemann最先提出將多細胞胚胎的每一個細胞核移植到去掉核的卵母細胞中，使它們重新發(fā)育成胚胎的設(shè)想。1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和實驗技術(shù)，首次獲得兩棲動物美洲豹蛙胚胎細胞核移植的后代。核供體為囊胚期的胚胎細胞——實驗成功。核供體為原腸胚期的中胚層和內(nèi)胚層細胞——實驗失敗。1958-1962年，劍橋大學(xué)Gurdon和Machineer利用爪蟾原腸內(nèi)胚層細胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。1970Gurdon用青蛙腳蹼角質(zhì)化細胞進行移核試驗，蛙卵發(fā)育成了蝌蚪。魚類的核移植

從1961年開始，童第周等以金魚和鳑鮍魚為材料，進行魚類不同亞科間的細胞核移植獲得成功，用以研究雜交細胞核與純種細胞核在發(fā)育功能上的差異，以及細胞質(zhì)對細胞核的影響。

1979年，中國科學(xué)院武漢水生物研究所利用鯽魚做移核試驗。他們把鯽魚囊胚期細胞經(jīng)過385天59代連續(xù)傳代培養(yǎng)后，再將此種培養(yǎng)細胞的細胞核移植到同種鯽魚的未受精卵中。到1980年4月，他們成功地培育了兩尾無性繁殖的幼魚，其中一條發(fā)育正常。1989年，童第周、牛滿江又將鯽魚胚胎細胞核移入鯉魚去核的未受精卵中，實現(xiàn)了不同種間的核質(zhì)雜交，成功地?zé)o性繁殖了“鯉鯽核魚”新品種。哺乳類的細胞核移植

1977年，美國緬因州巴爾港的杰克遜實驗室用“亞無性繁殖”的方式，培育出7只單親小鼠。操作流程：將卵細胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后放入加有適量細胞松馳B的溶液中。經(jīng)此番處理的卵細胞的染色體復(fù)制后出現(xiàn)了兩個核，將此雙核細胞放入正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)。卵中的雙核細胞自動融合，并且細胞開始分裂。將此種胚胎移入母鼠子宮培育。生產(chǎn)出7只單親小鼠。

1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)和美國杰克遜實驗室合作，首次對小鼠卵進行移核試驗獲得成功。他們將囊胚內(nèi)細胞團細胞的核移入去核的受精卵中，經(jīng)培養(yǎng)移核卵發(fā)育至囊胚期，再將此胚胎移入同步孕鼠子宮內(nèi)，最后產(chǎn)下兩雌一雄仔鼠，并發(fā)育成了可育的個體。核移植技術(shù)的一般操作程序

核移植克隆哺乳動物的技術(shù)操作過程主要包括核受體和核供體的處理和制備、核移植、重組胚的體外或體內(nèi)培養(yǎng)、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步驟。1．核受體細胞的準(zhǔn)備

去核卵母細胞常常作為核移植的受體細胞。這是因為在卵母細胞的細胞質(zhì)含有某種特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表達程序發(fā)生重新排列，使已經(jīng)分化了的細胞重新回到發(fā)育過程的原點，同受精卵一樣開始個體發(fā)育過程。卵母細胞的來源有兩種方式：一是用激素對雌體進行超排處理，從輸卵管沖出體內(nèi)成熟的MⅡ卵母細胞。二是從屠宰場收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘—卵母細胞復(fù)合體(COCs)，在體外培養(yǎng)成熟后作為受體。2．核供體細胞的準(zhǔn)備

在核移植操作中，細胞核供體細胞首先必須是完整的二倍體，該細胞必須保持有供體動物完整的基因組；其次，供體細胞核必須能夠在受體細胞質(zhì)的作用下，產(chǎn)生細胞分化過程的倒轉(zhuǎn)，變得如同剛剛受精的合子一樣，能重新完成從受精到發(fā)育成一個正常動物個體的全過程。供體細胞主要有兩大類：胚胎卵裂球和體細胞。另外，核供體細胞的來源還有胚胎干細胞和胎兒成纖維細胞。

3．細胞核移植常用的核移植方法有兩種，即胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射。胞質(zhì)內(nèi)注射是用一個外徑5～8μm的注核針吸取供體核后直接注射進卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)的方法。透明帶下注射則是把供體細胞核注射在透明帶與卵母細胞之間的卵周隙中，核移植后用電刺激進行細胞融合。4．激活

卵母細胞的激活涉及的因素很多，無論是受精引起的卵母細胞激活還是人工的激活，都會引起卵母細胞發(fā)生一系列的反應(yīng)，這些反應(yīng)是胚胎發(fā)育所必需的。其激活原理是通過電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細胞從MII期中解放出來，并轉(zhuǎn)到“受精”的狀態(tài)。5．重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng)

經(jīng)融合和激活的重組胚移入中間受體作體內(nèi)或體外培養(yǎng)，觀察重組胚的發(fā)育率。羊、牛、豬的核移植胚常采用體內(nèi)培養(yǎng)方法獲得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重組胚用瓊脂包埋后移入休情期的母羊結(jié)扎的輸卵管中體內(nèi)培養(yǎng)4-7d，發(fā)育至桑椹胚和囊胚。豬的核移植重組胚移入同期化受體母豬輸卵管內(nèi)作體內(nèi)培養(yǎng)7d，發(fā)育為囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作體外培養(yǎng)，發(fā)育至桑椹胚或囊胚。6．胚胎移植

重組克隆胚胎移植的受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強、體格稍大的當(dāng)?shù)仄贩N，進行同期發(fā)情處理，按常規(guī)方法移植代孕母畜（寄母）的子宮中，待其發(fā)育到產(chǎn)仔。核移植技術(shù)的應(yīng)用1．制備轉(zhuǎn)基因克隆動物，

進行生物藥物生產(chǎn)；2．培育優(yōu)良畜種，擴大良種種群；3．開展異種動物克隆，拯救瀕危動物；4．與干細胞技術(shù)結(jié)合，開展治療性克隆5．利用核移植技術(shù)，研究生物學(xué)的基本問題?？寺⊙蚺c體細胞核移植多利羊誕生記第一步：取妊娠期的6歲母綿羊（FinnDorset白品種母羊）的乳腺細胞作核供體細胞，用饑餓法使其進入休眠狀態(tài)而使全部基因具有活性。第二步：注射促性腺激素，促使母羊（SottishBlackface黑面母綿羊）排卵，28~33小時取其未受精卵，快速去核，放入10%FCS、1%FCS和0