分子生物學研究方法2023/4/72本章將在回顧重組DNA技術史上主要事件的基礎上，討論DNA操作技術、基因克隆的常用載體系統(tǒng)以及基因的分離與鑒定等環(huán)節(jié)。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細胞轉化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點突變PCR擴增等核心技術2023/4/735.1重組DNA發(fā)展史-------三大成就

：1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae(肺炎鏈球菌)1957年，HeinzFraenkel-Conrat和B.Singre的雜合病毒實驗1952年Hershey和Chase證實噬菌體DNA侵染細菌實驗2023/4/75

1920年7月25日，羅莎琳生于倫敦的一個猶太家庭。1942年，她又到英國煤炭應用研究協(xié)會從事碳纖維研究。1951年，倫敦大學國王學院（KingsCollege）的約翰?伯納爾（JohnRandall）邀請羅莎琳到他那里工作。他的一位研究生對DNA分子作了初步的X衍射試驗，伯納爾希望她對實驗結果進行深入分析。

1952年，羅莎琳得到了B型DNA分子清晰的X衍射圖像（DNAPhotograph51），這是一張具有里程碑意義的圖像。1953年1月，威爾金斯把這張圖片展示給了沃森和克里克。

1962年，沃森、克里克和威爾金斯分享了諾貝爾生理學獎，然而他們在獲獎后的演講中也沒有提到羅莎琳。1958年4月，羅莎琳被病魔奪去了年僅38歲的生命。

2023/4/763.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。JacobandMonod2023/4/77兩大技術保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber發(fā)現限制性核酸內切酶，1967Gellert發(fā)現了DNA連接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’但是，如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術，科學家就無法對這類物質進行直接的生化分析。2023/4/79幾百堿基對長短的DNA片段適于進行精細的物理圖譜以及DNA序列分析等；因此常選用切點較多的識別位點為4個核苷酸序列的酶。這在建立基因組文庫常用的方法識別位點為6個核苷酸序列的限制性內切酶通常產生1一10kB長短的限制性寸段，適于進行較長的DNA分子的物理圖譜和包括內含子．結構基因以及調控序列在內的完整基因的克??；2023/4/710重組DNA實驗中常見的主要工具酶酶

類功

能限制性核酸內切酶識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，補平DNA雙鏈中的缺口反轉錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據堿基互補原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進行末端標記實驗或用來進行DNA的連接末端轉移酶在雙鏈核酸的3'末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3'末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5'末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5'或3'末端的磷酸基團

到目前為止，科學家已經幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳技術將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。2023/4/711DNA片段在體外不具備自我復制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上（載體上），并轉入寄主細胞中進行繁殖。這就是基因克隆，或分子克隆。2023/4/7131973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecoloniesBoyer-Cohen實驗：1973年斯坦福大學的S.Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質粒與含有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質粒pSC101連接成重組質粒，具有雙重抗藥性。后來又把非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質粒重組，轉化大腸桿菌，并在菌體內成功轉錄出相應的mRNA。這是第一次成功的基因克隆實驗。2023/4/714Generalprocessofgeneengineering(1).

從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。(2).

將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。(3).

將重組DNA分子轉移到適當的受體細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。(4).

從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經得到擴增的目的基因。2023/4/715(5).將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現功能表達，研究核酸序列與蛋白質功能之間的關系。生長分化刺激因子基因工程技術區(qū)別于其它技術的根本特征：具有跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于毫無親緣關系的新的寄主生物細胞之中的能力。2023/4/717Sanger雙脫氧鏈終止法(dideoxy-terminationsequencing)

原理：雙脫氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3’端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，故可根據不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列。不能和下一個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接起來2023/4/718AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’添加DNApolymerase所有4dNTPs其中一種標記的ddNTPddTTPddCTPddGTPddATP在四個不同的反應管中各只包含一種ddNTP.2023/4/719AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGATreactionCreactionGreactionAreaction每一管中的復制的序列都停留在ddNTPs處5’2023/4/721

過程：制備ss-DNA→與引物退火→分為4個反應系統(tǒng)→每個系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標記）和一種雙脫氧核苷酸→DNA聚合酶定序反應→反應產物變性后電泳→凝膠干燥→放射自顯影。`

該法亦適合mRNA的序列分析。

GC富集區(qū)常出現“隱影”或“停止”現象，如在反應中加入dITP（脫氧三磷酸次黃嘌呤）或脫氧三磷酸-7-脫氧鳥苷可解決GC富集區(qū)的測序。2023/4/722b．Maxam-Gilbert化學修飾法(哈佛大學)

該方法的基本原理是用化學試劑處理具有末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產生一組具有不同長度的DNA鏈降解產物，經凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。該反應的關鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異性的化學切割反應：

堿基的特異性修飾；

被修飾的堿基從核糖環(huán)上轉移；

失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。2023/4/7232023/4/7252023/4/726DNA序列測定的自動化

1.DNA測序步驟與自動化1）模板制備可自動化2）定序反應可自動化3）凝膠電泳自動化有一定困難：制膠，點樣，電泳，凝膠干燥，放射自顯影。4）核苷酸序列閱讀與計算機輸入可自動化2.自動測序儀

Conney等人于1987年設計了不同熒光染料標記引物，然后做鏈終止測序，用激光掃描閱讀序列。

紅色引物+T反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddTTP）

黃色引物+G反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddGTP）

綠色引物+A反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddATP）

蘭色引物+C反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddCTP）2023/4/729雜交測序自從70年代末期DNA測序技術問世以來，人們已經做了大量重要的改進，但從根本原理上創(chuàng)新的則只有雜交測序法（sequencingbyhybridization，SBH）一種。它利用一組已知序列的寡核苷酸短序列作探針，同某一特定的較長的靶DNA分子進行雜交，從而測定其核苷酸的序列。

DNA雜交測序實質上包括兩個主要的步驟首先是將待測定的靶DNA分子同一組已知其核苷酸順序的寡核苷酸探針進行雜交，然后與那些能夠同靶DNA形成完全的雙鏈雜合分子的寡核苷酸探針做比較分析，并據此推算出靶DNA的核苷酸序列。2023/4/730如果將一種核苷酸順序為5'-AGCCTAGCTGAA-3'的12-mer的靶DNA，與一組完全隨機的8-mer寡核苷酸探針混合雜交，在總數為48=65536種的8-mer探針群體中，僅有5種會與靶DNA形成完全互補的雙鏈體分子。根據這5種發(fā)生了完全雜交作用的8-mer寡核苷酸探針之間的重疊序列的線性關系，便可推算出這段12-mer的靶DNA分子的核苷酸順序。

當然，這只是一種理想化狀態(tài)，實際上此種雜交模式要復雜得多，因為那些沒有同靶DNA片段完全互補的寡核苷酸探針，也仍然會與之形成不穩(wěn)定的雙鏈分子。2023/4/731（基因芯片測序)2023/4/732上圖是兩條長度均為17-mer的靶DNA片段I和II的雜交測序結果，兩者僅在第8位堿基有不同，分別為C和T。靶DNA片段I可與1~8共8段彼此相互重疊的8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子，但不能與第9段8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子。根據相鄰的兩段8-mer寡核苷酸之間各自具有7個堿基的重疊情況，可以構建出互補的DNA序列。靶DNA片段II的雜交結果表明，橫跨其第8位堿基T的6段8-mer寡核苷酸的雙鏈體，由于含有內部的堿基錯配，因此其雜交效率明顯下降；但與第1和第8兩段8-mer寡聚體形成的具有末端G-T錯配的雙鏈分子，其穩(wěn)定性下降并不顯著。與第9段8-mer寡核苷酸能雜交形成完全的雙鏈體分子，證實與片段I相比，它在第8位發(fā)生了由C堿基到T堿基的變化。5.2

DNA操作技術

5.2.1核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現在通用的許多分子生物學研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術基礎，受到科學界的高度重視。

2023/4/7345.2.1.1基本原理

長度不同的核酸分子也具有幾乎一致的電荷-質量比。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型。如果只在溶液中則不能分離，如果改在凝膠中，則分離得以實現。由于在電泳中往往使用無反應活性的穩(wěn)定的支持介質，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，故電泳的遷移率與分子的摩擦系數成反比。已知摩擦系數是分子大小、極性及介質粘度的函數，因此，根據分子大小的不同、構型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。2023/4/735聚丙烯酰胺凝膠電泳常用于蛋白質及小分子量核酸的分離。DNA的序列分析就采用聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于測定蛋白質的分子量。相鄰的SDS分子由于帶有相同的負電荷而相互排斥，使結合了SDS分子的蛋白質形成棒狀構型并且具有相同的荷質比，此時的蛋白質處于變性狀態(tài)。它們在凝膠中的遷移速度決定于它們的長度。脈沖場凝膠電泳技術(PFGE)是近年來發(fā)展起來的分離大分子量DNA的有效手段。在兩個不同方向的電場周期性交替進行的，DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間顯著地依賴于分子大小，DNA越大，這種構象改變需要的時間越長，重新定向的時間也越長，于是在每個脈沖時間內可用于新方向泳動的時間越少，因而在凝膠中移動越慢。反之，較小的DNA移動較快，于是不同大小的分子被成功分離。2023/4/7362023/4/737瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間2023/4/738聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間2023/4/739凝膠類型及濃度分離DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關，凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。2023/4/740在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠（ethidiumbromide，簡稱EtBr）染料對核酸分子進行染色，然后將電泳標本放置在紫外光下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。在紫外線的照射下結合溴化乙錠的DNA分子發(fā)出熒光2023/4/741稱樣溶解加熱制板倒膠電泳操作基本程序2023/4/742取樣點樣電泳檢測2023/4/7431.將快速生長中的大腸桿菌置于經低溫（0℃）預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質球）。

所謂細菌轉化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉化DNA的細菌菌株則被稱為受體菌株。處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞。5.2.2細菌轉化步驟：2023/4/7442.與轉化混合物中的外源DNA形成粘附在細胞表面的復合物。3.立即將該體系轉移到42℃下做短暫的熱刺激，復合物便會被細胞所吸收。4.在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉化基因實現表達、細胞活性恢復5.涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉化子。2023/4/745其原理是細菌處于0℃，CaCl2的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃短時間熱沖擊處理，促使細胞吸收DNA復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增值，被轉化的細菌中，重組子中基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉化子。Ca2+處理的感受態(tài)細胞，其轉化率一般能達到5×106~2×107轉化子/ug質粒DNA，可以滿足一般的基因克隆試驗。如在Ca2+的基礎上，聯合其它的二價金屬離子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或還原劑等物質處理細菌，則可使轉化率提高100~1000倍。2023/4/7465.2.3基因擴增聚合酶鏈式反應，即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。DNA聚合酶具有在核苷酸底物的存在下，以一條DNA鏈為模板催化新鏈的合成需要具有3’-OH的引物具有5’到3’方向聚合的能力通常具有3’到5’外切酶活性2023/4/747PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；2023/4/748PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；2023/4/749PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。2023/4/750Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。2023/4/751TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon2023/4/752PCR儀2023/4/7535.2.4實時定量PCR

SYBRGreenI與dsDNA結合熒光信號會增強800-1000倍，用SYBRGreenI染色的凝膠樣品熒光信號強，背景信號低?？蛇m用于多種電泳分析。

2023/4/754反向PCR(reversePCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究.

反向PCR(reversePCR)2023/4/755(1)、任一DNA序列在文庫中出現的概率：

N:該序列需要克隆的總數；p:待克隆DNA序列在文庫中設定的出現概率，一般為99％；I：待克隆DNA片段的長度，假定為17kb;G:基因組DNA的總長度，如人類為3×109bp5.2.5基因組文庫5.2.5.1文庫大小2023/4/756將數據代入上式

=8.1×105N的含義是克隆大小為17kb的人類DNA時，所構建的基因文庫數必須在8.1×105以上時，才能以99％的概率得到此克隆。2023/4/757(2)、建庫的目的：1）.從復雜的基因組中分離單拷貝的基因；2）.是從來源復雜的總mRNA的cDNA文庫中分離稀有的cDNA克隆。(3)、建庫的關鍵：如何產生足夠數量的重組DNA(4)、建庫應注意：

1）.保證載體DNA和靶DNA均不被外源DNA序列污染；2）.盡可能用“電話克隆”。2023/4/7582023/4/7595.2.5.2

DNA克隆片段的產生與分離（一）、基因組DNA的片段化

(1).用限制酶片段化:用限制酶消化DNA，不經凝膠電泳分部離,直接和載體連接的克隆方法叫鳥槍法(shot-ganapproach)存在的問題：

①所形成的重組體分子是一群帶有大小不同插入片段的混合群體。以每個載體可插入1～3kbDNA計算，基因庫至少含10～30萬個重組質粒。從中篩出目的基因工作量是很大的。②目的基因內部可能有一個以上的酶切位點，即一個基因分載在幾個重組質粒上，完整篩出更不容易。2023/4/760(2).隨機片段化：超聲波：可產生300bp的短片段。高速攪拌：1500轉/分×30分可切平均長度8kb的分子群體。(3).雙酶消化

雙酶切產生的DNA片段平均大小不超過1kb,但如采用雙酶部分消化，產物的分子量可達10～30kb,它們存在著隨機序重疊，用蔗糖梯度離心或凝膠電泳可將這些片段群體按大小分開，可得到的分子量大小約為20kb的隨機DNA片段群體。2023/4/7615.3RNA基本操作技術由于mRNA分子敏感脆弱，在自然狀態(tài)下難以被擴增。一般將其反轉錄成穩(wěn)定的DNA雙螺旋，再插入到可以自我復制的載體中。cDNA來自反轉錄的mRNA，不含冗余序列，通過特異性探針篩選cDNA文庫，可以較快地分離到相關基因，2023/4/7625.3.1總RNA的提取要獲得均一的RNA取決于能否有效去除RNA提取中DNA和蛋白質。采用高活性RNA酶抑制劑，可以防止RNA的降解，采用酚-氯仿抽提可以方便地去除RNA提取物中蛋白質。常用的異硫氰酸胍（Trizol試劑異硫氰酸胍和苯酚）和鹽酸胍是RNA抑制劑之一，它能在裂解細胞的同時使RNA酶失活，而且還能使RNA提取過程中的蛋白質變性。

2023/4/7632023/4/7642023/4/765

5.3.2.mRNA的純化

可應用PromegaPolyATtractmRNA分離系統(tǒng)分離多聚(A)mRNA。將用生物素標記的寡聚(dT)引物與細胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA。Promega公司mRNA磁珠法分離試劑盒(PolyATtractmRNAIsolationSystems)2023/4/7665.3.3反轉錄生成cDNA

可同時在反轉錄系統(tǒng)中加入寡聚（dT）及隨機引物R6，以保證得到全長cDNA，應選用活性較高的反轉錄酶及甲基化dCTP，保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。

因為絕大多數大腸桿菌細胞都會切除帶有5‘-methylC的外源DNA，所以實驗中常選用mcrA-mcrB-菌株。

由于cDNA第一鏈中含有5’甲基化的dCTP，使在以后的實驗步驟中可以避免被限制性內切酶所消化。

merA(Modifiedcytosinerestrictionproteina)這種酶能特異性地作用于外來DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，及C5mCGG特異序列。merB,C(Methylcytosine-specificrestriction)識別G5mC.2023/4/767

Oligo（dT）引物一般包含10～20個脫氧胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點的引物共同組成，隨機引物一般是包含6～10個堿基的寡核苷酸短片段。

在第一鏈cDNA合成后直接采用末端轉移酶（TdT）在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同時進行酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，與片段Ⅱ一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在RNA酶H、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA連接酶的作用下合成與載體聯系在一起的雙鏈cDNA。其主要特點是合成全長cDNA的比例較高，但操作比較復雜，形成的cDNA克隆中都帶有一段Poly（dC）/（dA），對重組子的復制和測序都不利。2023/4/768自身引導法（圖8-3）：

首先用氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的mRNA鏈，解離的第一鏈cDNA的3'-末端就會形成一個發(fā)夾環(huán)（發(fā)夾環(huán)的產生是第一鏈cDNA合成時的特性，原因至今未知，據推測可能是由帽子的特殊結構相關），并引導DNA聚合酶復制出第二鏈，此時形成的雙鏈之間是連接在一起的，再利用S1核酸酶將連接處（僅該位點處為單鏈結構）切斷形成平端結構可以進行連接。

2023/4/769OligodT或隨機引物

合成cDNA第一鏈合成cDNA第二鏈補平cDNA鏈末端強堿2023/4/770從表中看出低豐度mRNA，每個細胞僅有14個拷貝左右，其總量約占總mRNA的30%，其中約有11,000個左右的不同種類的mRNA。因此，為了獲得一個能夠代表全部低豐度mRNA序列的cDNA基因文庫，必須的最低克隆數（理論值）應是11,000/0.30=~37000。但由于在實驗中存在著取樣上的差異，有些序列容易被克隆，有些序列卻不容易被克隆，為了保證基因文庫中能夠包含所有的序列，就必須增加克隆的數目。為了使上述低豐度mRNA的cDNA克隆達到99%的期望率，大約需要篩選170,000個克隆。豐

度

等

級相應豐度等級的mRNA群體占總mRNA的百分數（%）在相應豐度等級中所含的不同種類mRNA序列的數量（個）每個細胞所含的相應豐度mRNA序列的拷貝數（個）高豐度22303,500中豐度491,090230低豐度2910,670142023/4/7715.3.4cDNA文庫概況:cDNA文庫是通過反轉錄mRNA，并制備雙鏈cDNA(doublestrandedcDNA)來構建的。構建cDNA文庫的策略是取決于：(1)目的mRNA的相對豐度；(2)篩選方法：除簡單的分子雜交法外還可對表達產物用各種方法進行鑒定。2023/4/772

CDNA文庫的優(yōu)點(1).使遺傳物質為RNA病毒可建立文庫；(2).因克隆數比基因組文庫少得多，易于篩選；(3).從分化特異的細胞的cDNA文庫中可分離到特異表達的基因。(4).建庫時已排除了其它的RNA，使假陽性率減低。(5).

cDNA文庫可在細菌中表達，可用多種策略進行篩選。2023/4/773但應注意：1).細胞中不同mRNA的豐度不同，低豐度的mRNA要求很高的克隆數(要用公式來計算)。2).有的基因表達具有嚴格的時空性，要獲得其mRNA并非易事。用不同發(fā)育階段，或不同組織細胞中的mRNA制備的cDNA文庫會包含一些共同和特異序列。這可用于分離差異表達的基因。3).cDNA文庫的DNA無內含子、調節(jié)元件和基因間DNA。不能用于基因結構和調節(jié)的研究。一個基因經不同的剪接可產生不同的部分重疊的cDNA克隆。2023/4/774第三節(jié)RNA操作技術5.基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選方法有很多種，常用的有：核酸雜交法PCR篩選法免疫篩選法2023/4/775原位雜交技術兩種意義的原位雜交;一種是指在構建基因組文庫或cDNA文庫時，長在培養(yǎng)皿上的菌落或噬菌斑經轉移到硝酸纖維膜上后進行分子雜交。另一種原位雜交技術則是指在細胞、組織切片上直接進行分子雜交。通過檢測細胞內特異mRNA的存在與否，它能夠告訴我們，在哪些細胞中有特異基因的表達。2023/4/7762023/4/777InsituhybridizationLocalizationofDNALocalizationofRNA

2023/4/778底物堿性磷酸酶鏈霉抗生物素硝酸纖維濾膜2023/4/7795.4SNP的理論與應用SNPs的定義：單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。2023/4/780位于染色體上某一區(qū)域的一組相關聯的SNP等位位點被稱作單倍型，相鄰SNPs的等位位點傾向于以一個整體遺傳給后代。2023/4/781SNPs的研究意義（1）.SNPs作為第三代遺傳標記（已知性、可遺傳性、可檢測性），用于疾病基因的定位、克隆和鑒定。___路標的作用傳統(tǒng)研究策略（表征、蛋白、基因）逆向遺傳學（表型、基因、蛋白），（2）.基因多態(tài)性研究研究SNPs本身對機體的影響（生理特征、病理條件下的千差萬別）

第1代標記限制性片段長度多態(tài)性（RFLP），第2代標記

1985年，小衛(wèi)星中心、可變串聯重復VNTR可提供不同長度的片段，其重復單位長度為6至12個核苷酸，1989年微衛(wèi)星標記系統(tǒng)2023/4/782SNPs研究進展和方向（1）.SNPs數據庫的構建發(fā)現（2）.SNPs功能的研究（在1的基礎上）2023/4/783SNPs檢測方法（1）.理想的檢測SNPs的方法

——發(fā)現未知的SNPs，或檢測已知的SNPs1)靈敏度和準確度的要求（反應原理嚴緊）2)快速、簡便、高通量(操作和分析的自動化程度高）3)費用相對低廉（2）.現狀：到現在還沒有一個符合以上條件的理想方法出現,但根據實際情況,可以選擇出較合適方法。2023/4/784SNPs檢測方法的分類一、區(qū)分SNPs位點的方法

1.基于雜交的方法2.基于酶的方法3.以構象為基礎的方法4.直接測序的方法二、檢測分析技術

1.凝膠分析技術2.熒光檢測技術3.DNA芯片4.質譜檢測技術2023/4/785SNP的檢測技術（1）.基因芯片技術通過優(yōu)化芯片雜交程序，使探針只與完全互補的序列雜交而不與含有單個錯配堿基的序列雜交。優(yōu)點是高通量，缺點是成本高。（2）Taqman技術2023/4/786Taqman法該技術的基本原理是利用Taq酶的5′核酸外切酶活性,在這個PCR反應中除了兩個傳統(tǒng)的PCR引物P1、P2外,還有第三個引物P3即等位特異性Taqman探針,含有待檢測的SNP位點,特異結合在P1結合位點的下游。Taq酶以P1為引物合成新的DNA鏈,隨著反應的進行Taq酶接觸到P3并激發(fā)其5′→3′外切酶活性,使P3從5′端開始降解,最后DNA鏈得以延伸而P3探針上的熒光基團和猝滅基團由于不再在一個分子上了,熒光基團釋放熒光信號。熒光信號的強弱與PCR產物的數量成比例。這種檢測方法的優(yōu)點是閉管進行,因而減少了PCR污染的風險,但探針標記的成本較高,且因其采用熒光猝滅及雙末端標記技術,猝滅難以徹底,本底較高。

2023/4/787分子信標（Molecularbeacons）分子信標是一種新型的發(fā)卡結構的寡核苷酸探針,是在樣品PCR過程中因和樣品DNA雜交后而使自身熒光構象改變從而實現對SNP的檢測(原理見圖1)。分子信標由稱為“莖”(stem)和“環(huán)”(loop)的兩部分構成,環(huán)的序列和待擴增的目的片段互補并含有要檢測的SNP位點。當分子信標和其完全互補的目的片段雜交時,其發(fā)卡結構被拉開而使熒光分子和熒光猝滅基團在空間上分開從而發(fā)射出熒光,其信號可提高900倍。2023/4/7881.

1個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結合，然后加入酶混合物（包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase腺苷三磷酸雙磷酸酶）和底物混合物（包括5’-磷酰硫酸APS和Luciferin）。2.四種dNTP（dATPS脫氧腺苷硫代三磷酸

，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反應體系，如與模板配對，與引物的末端形成共價鍵，dNTP的焦磷酸基團（PPi）釋放出來。3.在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光。通過CCD光學系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數成正比。4.反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。5.加入另一種dNTP,使第2-4步反應重復進行，根據獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。dATPS不是熒光素的底物焦磷酸測序法(Pyrosequencing)2023/4/789DNA聚合酶、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)、2023/4/7905.5基因克隆技術5.5.1RACE技術（rapidamplificationofcDNAends）5.5.2.應用cDNA差示分析法克隆基因5.5.3.Gateway大規(guī)?？寺〖夹g5.5.4基因的圖位克隆法2023/4/7915.5.1RACE技術（rapidamplificationofcDNAends）

是用于從已知cDNA片段擴增全長基因的方法，它根據已知序列設計基因片段內部特異引物，由該片段向外側進行PCR擴增得到目的序列。用于擴增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴增3’端的稱為3’RACE。已知序列cDNA的來源序列表達標簽減法cDNA庫差式顯示基因文庫篩選獲得高質量總RNA去磷酸化去掉mRNA5′帽子結構加特異性RNA寡聚接頭合成第一條cDNA鏈5′RACE3′RACE將純化后的PCR產物克隆到載體DNA中，進行序列分析RACE主要操作方法2023/4/7935’RACE在反轉錄酶的作用下，以已知基因片段內部。特異性引物啟始cDNA第一條鏈的合成RNase混合物降解模板mRNA，純化cDNA第一條鏈。

用末端轉移酶在cDNA鏈3‘端加入連續(xù)的dCTP

以連有oligo(dG)的錨定引物和基因片段內部特異的nested引物進行PCR擴增，以期得到目的片段，并可用nestPCR進行檢測。套式引物（NestedPrimer）PCR用第一套引物擴增15～30個循環(huán)，再用擴增DNA片段內設定的第二套引物擴增15～30個循環(huán)，這樣可使待擴增序列得到高效擴增，而次級結構卻很少擴增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子濾過器離心，在第二套引物加入前去除第一引物。（universaladaptorprimer，UAP）2023/4/7943’RACE是在反轉錄酶的作用下，以連有可以和polyA配對的oligo(dT)的錨定引物啟始cDNA第一條鏈的合成。用RNaseH降解模板mRNA。用通用錨定引物和基因片段內部特異引物進行PCR擴增得到目的3‘片段，并可用nestPCR的方法繼續(xù)進行檢測和擴增。2023/4/7955.5.2.

應用cDNA差示分析法克隆基因

(1)應用mRNA差別顯示技術分離克隆目的基因根據表達特性的差異可將高等真核生物的基因分為兩大類：一類叫做看家基因（house-keepinggene），另一類叫做發(fā)育調控基因（developmentalregulatedgene。我們將不同基因在生物個體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細胞中發(fā)生的按時間、空間進行有序表達的方式稱為基因的差別表達（differentialexpression）。1992年，美國波士頓Dena-Farber癌癥研究所的兩位科學家P.Liang和A.D.Pardee發(fā)明了一種叫做mRNA差別顯示PCR（mRNAdifferentialdisplay）技術，簡稱DDRT-PCR。2023/4/796DDRT-PCR的主要操作步驟如下：（1）從不同發(fā)育階段或不同基因型的細胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉錄的引物，合成第一鍵cDNA；

（2）用5'隨機引物和某個3'端錨定引物對擴增第一鏈(摻入32P-dNTP)；LiangP和PardeeA根據PolyA序列起點前2個堿基除AA外只有12種可能性的特征，設計合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物，其通式為5'-T11MN；同時為擴增出polyA上游500bp以內所有可能性的mRNA序列，在5′端又設計了20種10bp長的隨機引物。這樣構成的引物對進行PCR擴增能產生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種2023/4/797（3）用DNA變性測序膠分離擴增產物，X光片曝光后檢測差別條帶；

（4）回收特異性差別條帶；

（5）用同一引物對擴增已回收的DNA條帶；

（6）用Northern，Southern及測序法分析所得的條帶；

（7）以該DNA片段做探針，篩選全長cDNA或核基因。2023/4/798(2)應用cDNA差示分析法（RDA）克隆基因l）cDNA文庫差示篩選法，這是一種直接分離組織或發(fā)育特異表達基因的方法，例如對于兩種不同的組織細胞，先提取它們的poly(A)+mRNA，分別構建這兩種組織的cDNA文庫，然后以這些mRNA為模板，合成放射性標記的cDNA探針，再用這兩種探針分別與一類cDNA文庫的兩套重復考貝雜交，跟兩種探針都雜交的克隆是兩種組織細胞中都表達的基因，而僅與一種探針雜交的克隆則是在一種組織細胞中特異表達的mRNA，再對這樣的克隆進行測序比較和鑒定，就可分離到這種組織特異表達的基因。用這種方法已分離到許多根莖葉和生殖器官等特異表達的基因。2023/4/799A.差式雜交或扣除雜交克隆技術2023/4/7100

RDA法充分發(fā)揮了PCR以指數形式擴增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴增了目的基因片段。因為試驗對象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差示分析前均經一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群（representation），保證絕大部分遺傳信息能被擴增。每次T減D反應后僅設置72℃復性與延伸，94℃變性這兩個參數共20個PCR循環(huán)，PCR產物的特異性和所得探針的純度非常高。試驗對象（Tester）供試探針（Driver）4堿基切割酶處理平均長度256bp的代