分子克隆載體

周俊宜

基因工程的表達體系操縱子理論在基因工程中的應(yīng)用目的基因翻譯表達及其準確性常用基因載體基因載體是一類能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細胞。常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、病毒

基因工程的表達體系原核生物表達體系：

大腸桿菌、枯草桿菌、農(nóng)桿菌大腸桿菌表達體系的優(yōu)點：積累了充足經(jīng)驗，有數(shù)不清的載體可供應(yīng)用；可因不同載體而選擇不同菌種作宿主；操作安全，致病能力低；成本相對低得多；真核生物的基因先在原核體系上構(gòu)建克隆，稱為亞克?。╯ubclone），然后采用其它方式轉(zhuǎn)移至真核細胞上表達。

表達體系的發(fā)展

表達體載體宿主第一代原核生物表達體系質(zhì)粒、噬菌體細菌第二代酵母表達體系穿梭質(zhì)粒酵母第三代哺乳類細胞表達體系病毒、脂質(zhì)體培養(yǎng)細胞第四代基因直接導(dǎo)入DNA本身生殖細胞、體細胞、個體

基因工程的目的是使目的基因能高效表達?；虮磉_受DNA結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)因子與核酸相互辨認、結(jié)合等組成的表達體系的調(diào)控。

基因表達調(diào)控可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾等水平進行基因工程載體的構(gòu)建必需應(yīng)用表達調(diào)控的基本理論知識，應(yīng)用已知的調(diào)控序列進行重組、改造。

操縱子理論在基因工程的應(yīng)用操縱子P：啟動序列O：操縱序列I：調(diào)節(jié)序列

I

POCAP調(diào)控區(qū)

ZYX結(jié)構(gòu)基因以乳糖操縱子（lacoperon）為例：誘導(dǎo)物

ZYX

I

POCAP

ZYX

I

POCAP二、強啟動子的構(gòu)建RNA轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)-10區(qū)TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACATATAAT共有序列TATA盒CAAT盒GC盒

增強子

順式作用元件結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動子保守序列RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物是乳糖

乳糖類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更強的誘導(dǎo)作用。

IPTG配合使用在基因工程可作藍白斑篩選。LacZ基因編碼的乳糖苷酶

X-gal

藍色吲哚產(chǎn)物三、藍白斑試驗（IPTG-Xgal試驗）誘導(dǎo)物

ZYX

PO

ZYX

PO乳糖X-galLacZ藍色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶

五、增強子

轉(zhuǎn)錄起始前-30區(qū)為TATA盒，還有多種順式作用組件相互配搭成啟動子。

增強子遠距離地、不同方向地控制啟動子的活性。增強子的核心序列是TGTGGAATTAG。增強子的作用特點有：非特異性遠距離操縱、多方向性。

酵母結(jié)構(gòu)基因的上游還有上游活化序列（upstreamactivationsequence，UAS）。目的基因翻譯表達及其準確性核糖體結(jié)合位點（S-D序列）mRNA有與核糖體DNA結(jié)合的位點S-D序列(Shine-Dalgarno)，又稱為核糖體結(jié)合點。

3’…ACACUAGG…5’16sRNA

UCU-C-C-U5’……AGGAPuPuUUUPuPu…AUGmRNAAGGA后的的7個Pu是核糖體小亞基的辨認部位lF1、3met-GTP-lF230S50SGDP+PilF2,fmetfmet30S50SlF1、3mRNAGTP基因克隆時的定向插入

插入序列兩邊的酶切口不同,插入的組件不會倒裝，保證了在其下游目的基因插入后，沿5’→3’方向正確轉(zhuǎn)錄，這種構(gòu)建方式稱為定向插入。EcoRIHindIIIOri復(fù)制起點LacZAPRpUC19如果插入序列自身不含ATG起始密碼,或限制酶切點不能把讀碼框準確置于ATG之后,或插入片段編碼未清楚,可在目的基因之前設(shè)保險序列:

5’…ATGNATGNATG5’…ATGNATGNATG1234565’…ATGNATGNATGXY1234565’…ATGNATGNATGZ123456能正確讀出三聯(lián)體密碼的起始序列TAAATGIIIIIIIVVIVIIIVATGIIIIIIVIIIIIIOri轉(zhuǎn)錄起始翻譯起始信號肽成熟蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)CSCSCSCS--cloningsite常規(guī)質(zhì)粒載體質(zhì)粒(plasmid)

Plasmid獨立于細菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

Plasmidchromosome

基因載體應(yīng)具備的條件：（1）有多種限制性內(nèi)切酶切點，但每種切口最好只有1個；（2）有選擇標記，例如抗藥性標記，藍白斑試驗；（3）有一定容量；（4）有相當?shù)某緮?shù)，即每個宿主菌可能容納的最多數(shù)。多克隆位點ori復(fù)制起始點遺傳標記Amppolylinker基因載體1、質(zhì)粒是細菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。2、編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。3、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制。4、質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。質(zhì)粒的生物學(xué)特性5、根據(jù)每個寄主細胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-5個）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達10-200個拷貝）。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。6、質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。

發(fā)展概況

pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。

許多實用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成?？梢娖湓唾|(zhì)粒在使用上有優(yōu)點。

pBR322有過百個限制性內(nèi)切酶切點，一種限制性內(nèi)切酶只有單一切口的位點也多達數(shù)十個，幾乎具備了所有常用限制酶都能切開并插入目的基因的優(yōu)越條件。此外，pBR322DNA，被限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段大小均已知道，可以作為核酸電泳的分子質(zhì)量標準。普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖抗藥性標志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板pUC質(zhì)粒系列pUC質(zhì)粒系列也是在pBR322基礎(chǔ)上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復(fù)制起始點。去除了pBR322的tetr區(qū)段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ不得基因及其啟動子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker.

476bp片段含有E.coli的lacZ基因的5’-序列，表達半乳糖苷酶的α片段。LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動子Plac和操縱基因O。lacZ之內(nèi)是M13的多功能連接器。三個顯著特點：（1）分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個細胞含500-700個拷貝）。（2）含易于檢測是否有外源DNA插入的標記基因LacZα，可利用-互補原理進行藍白篩選。（3）多克隆位點區(qū)（MCS）由人工合成的多個單一酶切位點構(gòu)成。其MCS區(qū)與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到M13mp載體，進行DNA測序和體外突變等研究。pKO系列組成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的EcoRI-PvuII位點包括terr，.表達產(chǎn)物催化Gal+ATPGal-1-P+ADP以14C標記的半乳糖作底物,檢測生成的*Gal-1-P的放射性。在Galk基因上游插入目的基因，根據(jù)基因表達產(chǎn)物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算啟動子功能的強弱。如在Galk基因前插入目的基因，與無插入的空載pKO比較，并無放射活性的增強，則說明插入片段不存在有啟動子。λ噬菌體載體噬菌體是比細菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細胞一樣，噬菌體侵犯細菌，也可以認為它是細菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細菌內(nèi)。侵犯細菌時，只是DNA侵入，然后利用細菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原兩種生活方式生存和繁殖（圖1-5）。圖左示λ噬菌體在宿主內(nèi)進行獨立復(fù)制，在1個菌體內(nèi)生長出100個左右的新噬菌體，并沖破（殺死）細菌釋放出來，再度感染其它活菌，稱為裂解。λ噬菌體侵入菌體后，把自身DNA加進細菌DNA里（整合），作為細菌基因的一部分，隨菌的細胞分裂而增殖，這種生活狀態(tài)稱為溶原（lysogen）。λ噬菌體的生活周期：裂解λ侵入細菌-獨立復(fù)制-裂解（沖破細胞膜）-再感染其他細菌。λ噬菌體的結(jié)構(gòu)和用途λ噬菌體線性雙鏈DNA病毒，具有末端互補的12nt，感染細菌后粘端互補成雙鏈環(huán)狀。全長48531bp，含50多個基因。λ噬菌體基因大致分為4個區(qū)：

結(jié)構(gòu)區(qū)A～J19個基因，編碼頭、尾部蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū),重組區(qū)

att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），調(diào)控區(qū)啟動子、終止子和N、CI基因，O-R為裂解區(qū).

λ噬菌體及其組件的應(yīng)用

λ噬菌體可以容納較大的目的基因。例如用置換法可去掉長達20kb的λDNA，換入相應(yīng)長度的目的基因。

基因文庫構(gòu)建常使用λ載體；不少先進的質(zhì)粒應(yīng)用λ組件進行構(gòu)建。λ噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程。誘導(dǎo)的因素可能很多，實驗室常用的是熱誘導(dǎo):分離得到某些λ噬菌體，在低溫時（30℃）建立溶原，用高溫（420C）則出現(xiàn)裂解。這些λ噬菌體的cl基因是溫度敏感突變型的，稱為c1ts。λclts1857，可作為組件插入質(zhì)粒DNA內(nèi)。目的基因插在λclts857下游，重組體的目的基因在42℃表達，30℃不表達。這種方法稱為熱誘導(dǎo)表達，使用的是溫敏開關(guān)。λCIts857ori目的基因PL阻遏蛋白30℃下培養(yǎng)：目的基因阻遏蛋白42℃下培養(yǎng)：失活λPL和λPR

λPL和PR

是λ噬菌體上2個主要的啟動子，都是啟動能力相當強的轉(zhuǎn)錄構(gòu)件。把λ啟動子連同其附屬成分，置換了pBR322的tetr基因，成為以λ啟動子為組件的質(zhì)粒。（1）粘粒（cosmid）能容納大片段（45kb）的小分子（4kb～6kb）載體。組成：質(zhì)粒復(fù)制原點，抗藥基因，多克隆位點，已連接入的λcos位點。構(gòu)建基因文庫的λ載體（2）λDNA的體外包裝是提高λ噬菌體轉(zhuǎn)染效率的有效方法在A蛋白（有終止復(fù)制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉(zhuǎn)入頭部。高效表達質(zhì)粒組成特點:強啟動子,保證正確閱讀AUG的序列ATGNATGNATG，rrnB抗終止序列，多位點接頭。pBV系列質(zhì)粒

pBV221分子量小，易轉(zhuǎn)化，含有串聯(lián)的來自λ噬菌體的強啟動PL及PR，啟動子的串聯(lián)可能有相互增強作用。含有λCIts857組件，此組件可變溫誘導(dǎo)目的基因的表達。這一組件