植物基因轉化系統(tǒng)載體轉化系統(tǒng)（Ti質粒轉化載體，Ri質粒轉化載體）原生質體DNA直接導入轉化系統(tǒng)基因槍DNA導入轉化系統(tǒng)花粉粒介導轉化系統(tǒng)1現(xiàn)在是1頁\一共有52頁\編輯于星期四一、植物基因工程載體命名規(guī)則及種類1、植物基因工程載體命名規(guī)則：(1)

pSC101plasmidStanleyCohen(人名)pTiT37/pAtT37根癌農(nóng)桿菌的質粒類型（Agrobacteriumtumefaciens）pRiT37/pArT37發(fā)根農(nóng)桿菌的質粒類型（Agrobacteriumrhizogenes）2現(xiàn)在是2頁\一共有52頁\編輯于星期四（2）每個基因位點均以三個斜體小寫字母表示，如：leu（亮氨酸基因位點）

基因表現(xiàn)型用正體表示，如Leu（3）基因中任何位點發(fā)生突變則在該基因符號后加該位點斜體大寫字母，如亮氨酸A、B位點分別為突變型或缺陷型，表示為：leuA、leuB(4)抗性和敏感性分別用R或r，S或s表示

3現(xiàn)在是3頁\一共有52頁\編輯于星期四2、植物基因工程載體的種類及特性植物基因工程載體克隆載體中間載體中間克隆載體中間表達載體卸甲載體onc-onc+轉化載體中間黏粒載體質粒/黏粒載體基因標記載體一元轉化載體（順式載體）雙元轉化載體（反式式載體）共整合載體SEV（拼接末端載體；split-endvector）4現(xiàn)在是4頁\一共有52頁\編輯于星期四二、根癌農(nóng)桿菌Ti質粒的結構與功能1、Ti質粒的遺傳特性、結構及功能2、T-DNA的基因結構與功能3、Vir區(qū)操縱子的基因結構與功能

5現(xiàn)在是5頁\一共有52頁\編輯于星期四一、Ti質粒的遺傳特性、結構及功能1.Ti質粒的遺傳特性及類型Ti質粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子。

根據(jù)其誘導的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型(octopine)胭脂堿型(nopaline)農(nóng)桿堿型（agropine）農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)6現(xiàn)在是6頁\一共有52頁\編輯于星期四圖3-1章魚堿型Ti質粒基因圖。章魚堿基因T-DNA區(qū)結合轉移區(qū)冠癭堿代謝復制起始區(qū)毒力區(qū)生長素基因細胞分裂素基因冠癭堿合成7現(xiàn)在是7頁\一共有52頁\編輯于星期四2.Ti質粒的功能區(qū)域Ti質粒可分為四個區(qū)：（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：

T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，稱為轉移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關。（2）Vir區(qū)（virulenceregion）該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質粒DNA的三分之一。8現(xiàn)在是8頁\一共有52頁\編輯于星期四（3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations）該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉移的有關基因（tra），調控Ti質粒在農(nóng)桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質粒轉移，因此稱之為接合轉移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）該區(qū)段基因調控Ti質粒的自我復制，故稱之為復制起始區(qū)。9現(xiàn)在是9頁\一共有52頁\編輯于星期四3.Ti質粒的生物學功能Ti質粒的功能可歸為以下7個方面:①參與寄主細胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些細胞分裂素的活動。②誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導的腫瘤的形態(tài)學特征和冠癭堿成分。③賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物的能力。④賦予寄主菌株對土壤桿菌所產(chǎn)生的細菌素的反應性。⑤為農(nóng)桿菌提供附著于植物細胞壁的能力。⑥決定寄主菌株的植物寄主范圍。⑦有的Ti質粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體生長與發(fā)育，即具有對噬菌體的“排外性”。10現(xiàn)在是10頁\一共有52頁\編輯于星期四表4-1Ti質粒放入部分基因及其功能基因縮寫表型及功能在基因圖上的位置（kb）pTiC58（211kb）pTiAch5（195kb）age排斥噬菌體API111-11310-12agr對PAT-K84質粒編碼的農(nóng)桿菌素敏感138-141—arc分解精氨酸4-59-10agc分解農(nóng)桿菌—54-57noc分解胭脂堿18-20—nos合成胭脂堿0-1—occ分解章魚堿—39-41ocs合成章魚堿—0-1ori復制起點33-3590-95roi（tmr）抑制長根206-207190-192shi（tms）抑制長芽202-203187-188traTi質粒轉移121-12321-30inc質粒不相容性33-3590-9511現(xiàn)在是11頁\一共有52頁\編輯于星期四二、T-DNA的基因結構與功能

1.T-DNA的發(fā)現(xiàn)

Chilton等人于1982發(fā)現(xiàn)。(MD

CHILTON,DTEPFER,APETIT,DCHANTAL

,CDFRANCINE,TJACQUES.

Agrobacteriumrhizogenes

insertsT-DNAintothegenomesofthehostplantrootcells.Nature,1982(295):432-434）

研究證明，這部分DNA是從質粒DNA上切割后，轉移到腫瘤細胞，故稱之為轉移DNA（transferred-DNA）。12現(xiàn)在是12頁\一共有52頁\編輯于星期四GGCAGGATATATATTCAATTGTAATGGCAGGATATATATACCGGTTGTAATT圖3-2Ti質粒上幾個重要區(qū)域及其序列LB：左邊界序列；RB：右邊界序列13現(xiàn)在是13頁\一共有52頁\編輯于星期四2.T-DNA的結構特點l

Ti質粒T-DNA區(qū)的長度約為23kb；l

T-DNA僅存在于植物腫瘤細胞的核DNA中；l

在T-DNA的5′端和3′端都有真核表達信號。如TATAbox、AATAAbox及polyA等。14現(xiàn)在是14頁\一共有52頁\編輯于星期四T-DNA的兩端左右邊界各為25bp的重復序列，即邊界序列（bordersequence），分別稱之為左邊界（BL或TL）和右邊界（BR或TR）。該25bp邊界序列屬保守序列,但通常右邊界（TR）序列更為保守，左邊界(TL)序列在某些情況下有所變化。其核心部分是14bp，可分為10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)兩部分,是完全保守的。致瘤性：右邊界作用大于左邊界15現(xiàn)在是15頁\一共有52頁\編輯于星期四3.T-DNA上的編碼基因及功能

T-DNA的轉錄有下述共同點：①T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈,即都能被轉錄。②T-DNA上每個基因都有各自的啟動子。③基因的轉錄由植物細胞RNA聚合酶Ⅱ完成。④T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調節(jié)信號，T-DNA的轉錄機理可能與真核生物相同。⑤植物或農(nóng)桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調節(jié)基因活性。16現(xiàn)在是16頁\一共有52頁\編輯于星期四TLTRTCiaaHiaaMauxiptcytocsfrsmasags圖4-3章魚堿型Ti質粒的T-DNA編碼基因結構iaaH：吲哚乙酸胺水解酶；iaaM：色氨酸單加氧酶；aux：生長素；ipt:異戊烯基轉移酶；cyt：細胞分裂素；frs：琥珀堿合成酶；mas：甘露堿合成酶；ags：農(nóng)桿堿合成酶17現(xiàn)在是17頁\一共有52頁\編輯于星期四T-DNA區(qū)基因的功能

第一類是編碼冠癭堿合成酶及分解代謝基因，如:frs、mas、ags第二類是致瘤基因；包括生長素基因aux和細胞分裂素基因cyt

18現(xiàn)在是18頁\一共有52頁\編輯于星期四三、Vir區(qū)操縱子的基因結構與功能1、Vir區(qū)操縱子的基因結構：農(nóng)桿菌致瘤所必須的；Vir區(qū)僅位于T區(qū)DNA左側；兩者之間的距離常隨Ti質粒類型不同而有差異。HABGCDEFtzsABGCDE章魚堿胭脂堿圖4-5章魚堿型和胭脂堿型Ti質粒的Vir區(qū)編碼基因結構19現(xiàn)在是19頁\一共有52頁\編輯于星期四表4-4章魚堿型Ti質粒vir基因基本結構與功能遺傳座位分子量（kb）基因數(shù)表達方式功能virA2.81組成型幫助接受植物信號分子啟動毒性區(qū)表達virG1.01組成型轉錄活化virC1.52誘導型T-DNA加工virD4.54誘導型T-DNA加工virE2.22誘導型T-DNA加工virB9.511誘導型膜轉運蛋白virF1.01誘導型T-DNA轉運virH94.22誘導型細胞色素P-450單氧化酶20現(xiàn)在是20頁\一共有52頁\編輯于星期四三、農(nóng)桿菌Ti質?；蜣D化機理

已知農(nóng)桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間隙中。T-DNA首先在細菌中被加工、剪切、復制，然后轉入植物細胞，并非整個Ti質粒都進入植物細胞。該基因轉化過程是一個復雜的遺傳工程。21現(xiàn)在是21頁\一共有52頁\編輯于星期四1、T-DNA的加工及轉移

22現(xiàn)在是22頁\一共有52頁\編輯于星期四四、T鏈整合植物基因組的分子機理

1、整合位點及其特性T-DNA在植物染色體中的插入是隨機的，可插入植物任何一條染色體插入位點常有以下特點：①T-DNA優(yōu)先整合到轉錄活躍的植物基因位點；②T-DNA與植物DNA連接處富含A，T堿基對；③植物DNA上的插入靶位點與T-DNA邊界序列有一定程度的同源性。23現(xiàn)在是23頁\一共有52頁\編輯于星期四2.T-DNA的整合機理

雙鏈斷裂修復模型（DSBRmodel）單鏈缺口修復模型（SSGRmodel）

24現(xiàn)在是24頁\一共有52頁\編輯于星期四Sci，IF：9.20525現(xiàn)在是25頁\一共有52頁\編輯于星期四26現(xiàn)在是26頁\一共有52頁\編輯于星期四Fig4-6IllegitimaterecombinationmodelsforT-DNAintegration.(a)Double-strandbreak-repair(DSBR)andsingle-strandgap-repair(SSGR)modelsequallyexplaintheintegrationeventsleadingtoT-DNAinsertion621-x34.AsoutlinedintheDiscussion,theDSBRmodelpredictsadouble-strandbreakinthetarget.UnwoundorexonucleaseprocessedendsoftheT-DNAandofthetargetannealbypartialhomologouspairing.Single-strandoverhangsareremovedbyendo-orexonucleasedigestion;theendsarerepairedandligated.TheSSGRmodelpredictsanickinthetargetthatisconvertedtoagapbya5'-3'exonuclease.TheT-strandinvadesthegapandasynapsisisformedbypartialpairingbetweenT-DNAendsandtarget.TheoverhangsoftheT-DNAareremovedandtheT-strandisligatedtothetarget.AnickintroducedintothesecondstrandofthetargetinitiatesrepairsynthesisofthesecondstrandoftheT-DNA.(b)ApplicationoftheSSGRmodelforT-DNAinsertion621-36.Asproposedinthemodelofinsertion621-x34,repairattheendsofinvadingT-strandmayoccurbeforeligation.AbsenceofaninternalCAGTT-DNAsequencefromtherightjunctionofinsert621-36suggeststhatcopyingofthetargetplantDNAledtoalterationoftherightT-DNAendduringintegration.Mismatchrepairmaysimilarlyexplaintheobserveddeletion.(c)AmodifiedversionofSSGRmodelexplainingpossibleinvolvementofVirD2proteininrecombinationeventsthatresultedinT-DNAinsertions621-37andN6H-cs4.T-DNAinvasiondepictedinthemodelinvolvesVirD2-mediatedrecognitionofanick(orgap)thatisfollowedbyligationofthe5'endoftheT-strandtothetargetDNA.The3'endoftheT-strandmovesalongthetarget,whiletheunwoundtargetDNAstrandisremovedbyexonucleolyticdigestion.Atthepositionwherethe3'endoftheT-strandisstabilizedbybase-pairing,theT-strandisligatedtothetarget.Atthesamepositionanickisintroducedinthesecondstrandofthetargetthatdefinestheleftbreak-pointoftargetdeletionandinitiatesthereplicationoftheT-strand.Symbolsusedforpresentationofputativerecombinationeventsareexplainedunderneaththemodels.27現(xiàn)在是27頁\一共有52頁\編輯于星期四3.T-DNA整合的遺傳效應T-DNA插入的遺傳特性：(1)T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多數(shù)插入會導致靶位點處小的缺失，缺失多至79個核苷酸。(2)另一個常見的結果是，在T-DNA／植物DNA連接處，會有幾個至33個核苷酸的“填充”DNA（FillerDNA）存在，這些“填充”DNA的序列與靠近連接處的植物DNA序列相似。(3)在植物靶位處不要求有特異的序列，但若在T-DNA兩端和植物靶位處之間有一段短序列（5～10b）同源，則可以在整合中起作用。28現(xiàn)在是28頁\一共有52頁\編輯于星期四五、農(nóng)桿菌Ti質粒的改造及載體構建1、Ti質粒的改造及卸甲載體構建

2、中間載體/表達載體的構建

3、植物基因轉化載體系統(tǒng)的構建29現(xiàn)在是29頁\一共有52頁\編輯于星期四1、Ti質粒的改造及卸甲載體構建

野生型Ti質粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：①Ti質粒分子量過大，一般在160～240kb，基因工程中難以操作；②大型的野生Ti質粒上分布著各種限制酶的多個切點，..難以找到可利用的單一限制性內切酶位點，不能通過體外DNA重組技術直接向野生型Ti質粒導入外源基因；③T-DNA區(qū)內含有許多編碼基因，其中onc基因產(chǎn)物干擾宿主植物中內源激素的平衡，轉化細胞長成腫瘤，阻礙細胞的分化和植株的再生；④Ti質粒不能在大腸桿菌中復制,即使得到重組質粒，也只能在農(nóng)桿菌中進行擴增；而農(nóng)桿菌的轉化率極低（10％左右）,因此，通過Ti質粒的體外操作，在常規(guī)分子克隆條件下幾乎不能構建在T-DNA中只有單一切點的載體；⑤Ti質粒上還存在一些對于T-DNA轉移不起任何作用的基因。

30現(xiàn)在是30頁\一共有52頁\編輯于星期四為了使Ti質粒成為有效的外源基因導入載體，必須對野生型Ti質粒進行一番科學的改造。十分幸運的是，大腸桿菌具有能與農(nóng)桿菌高效地接合轉移的特性。因此，科學家們可以先將T-DNA片段克隆到大腸桿菌的質粒中，并插入外源基因，最后通過接合轉移把外源基因引入到農(nóng)桿茵的Ti質粒上，這是一種把預先進行亞克隆、切除、插入或置換的T-DNA引入Ti質粒的有效方法。帶有重組T-DNA的大腸桿菌質粒衍生載體稱為”中間載體”（intermediatevector），而接受中間載體的Ti質粒則稱為受體Ti質粒（acceptorTip1asmid），一般是卸甲載體（disarmedvector）。31現(xiàn)在是31頁\一共有52頁\編輯于星期四2、onc-卸甲載體所謂卸甲載體就是無毒的（non-oncogenic）Ti質粒載體。因為利用野生型的Ti質粒作載體時，影響植株再生的直接原因是T-DNA中onc基因的致瘤作用。因此，為了使野生型的Ti質粒成為基因轉化的載體，必須切除T-DNA上的onc基因，即“解除”其“

武裝”,構建成所謂“卸甲”或稱“繳械”載體（disarmedvector）。在這種onc-載體中，已經(jīng)缺失的T-DNA部位被大腸桿菌的一種常用的質粒pBR322取代。這樣任何適合于克隆在

pBR322質粒中的外源DNA片段，都可以通過與

pBR322質粒DNA的同源重組，而被共整合到Onc-Ti質粒載體上。32現(xiàn)在是32頁\一共有52頁\編輯于星期四onc+卸甲載體

對于研究外源基因在轉基因植株中的表達，以及對于以改良農(nóng)作物為目的的植物基因工程而言，onc-體系是最有用的。不過，人們可能還要設計一些特殊的實驗來研究外源基因在冠癭瘤組織中的表達問題。在這種情況下，使用onc+菌株載體則比較合適。由于冠癭瘤組織具有不依賴于激素的表型特征，所以這種載體系統(tǒng)的優(yōu)點在于它可以快速地增生冠癭組織，比較快速而容易得到轉化體。33現(xiàn)在是33頁\一共有52頁\編輯于星期四2、中間載體的構建（1）中間載體的基本結構與特點

為解決Ti質粒不能直接導入目的基因的困難，構建中間載體（intermediatevector）是有效方法之一。中間載體是一種在一個普通大腸桿菌的克隆載體（例如pBR322質粒）中插入了一段合適的T-DNA片段，而構成的小型質粒。中間載體通常是多拷貝的E.Coli小質粒，這一點對于通過體外遺傳操作導入外源基因是非常必要的。從結構特點看可分為兩類中間載體，即共整合系統(tǒng)中間載體和雙元載體系統(tǒng)中間載體。34現(xiàn)在是34頁\一共有52頁\編輯于星期四共整合系統(tǒng)中間載體的特征①中間載體必須含有與Ti質粒T-DNA區(qū)同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌農(nóng)桿菌后即可高頻地與Ti質粒的T-DNA的同源序列進行重組；②它應具有一個或幾個細菌選擇標記，這將有利于篩選共整合質粒；③它必須

有bom位點，在有誘導質粒存在的情況下，bom位點的存在可以使中間載體在不同細菌細胞內進行轉移；④它應該含有陽性植物選擇標記，以利于轉化植物細胞的篩選，例如新霉素磷酸轉移酶(neomycinphosphotransferase,Npt-Ⅱ)基因，其可賦予轉化植物細胞卡那霉素抗性；⑤它應該含有單一的限制性內切酶切點，以利于外源基因的插入；⑥無Ti質粒的邊界序列。35現(xiàn)在是35頁\一共有52頁\編輯于星期四雙元載體系統(tǒng)的中間載體與共整合系統(tǒng)中間載體不同之處是:①無同源序列；②具有LB和RB;③無Co1E1復制點

36現(xiàn)在是36頁\一共有52頁\編輯于星期四（2）中間表達載體啟動子及其它調控序列

轉錄的調控對真核生物基因表達起著關鍵性作用。就真核生物基因表達調控序列而言，大多數(shù)真核生物在轉錄起始點的5′端上游區(qū)第30至25bp處具有TATA盒，在70至80bp處還有CAAT盒。在大多數(shù)真核生物基因的3′端具有AATAA序列。這些5′和3′端的調控序列對真核生物的基因表達起著關鍵性作用。Ti質粒雖然來源于農(nóng)桿菌，但其Nos、Ocs、Tmr等基因具有與真核生物啟動子類似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物細胞中表達，并且無組織特異性。因此，它們成為早期構建嵌合基因的啟動子，其中以Nos啟動子（pNos）最常用。37現(xiàn)在是37頁\一共有52頁\編輯于星期四38現(xiàn)在是38頁\一共有52頁\編輯于星期四3、植物基因轉化載體系統(tǒng)的構建（1）一元載體系統(tǒng)（2）雙元載體系統(tǒng)39現(xiàn)在是39頁\一共有52頁\編輯于星期四1．一元載體系統(tǒng)的構建這一類載體是中間表達載體與改造后的受體Ti質粒之間，通過同源重組所產(chǎn)生的一種復合型載體，通常亦稱為共整合載體（co-intergratedvecter），又由于該載體的T-DNA區(qū)與Ti質粒Vir區(qū)連鎖，因此又稱之為順式載體（cis-vector）。一元載體的特點是:①由兩個質粒（E.coli質粒和Ti質粒）重組而成，分子量較大；②共合體的形成頻率與兩個質粒的重組頻率有關,相對較低；③必須用Southern雜交或PCR對大的共整合體質粒進行檢測；④構建時比較困難。一元載體系統(tǒng)目前主要有兩種載體：共整合載體和拼接未端載體（split-endvector,SEV）。

40現(xiàn)在是40頁\一共有52頁\編輯于星期四（1）共整合載體的構建共整合載體的特點是：①中間表達載體與受體Ti卸甲載體，通過同源重組共整合而構建；②中間表達載體與受體Ti質粒之間同源序列是pBR322。共整合載體的構建過程

l）中間載體pLGV1103導入農(nóng)桿菌:目前通常采用兩種方法，即接合轉移法（conjugativetransfer）和三親雜交轉移法。

2）中間載體與受體Ti質粒的同源重組。

3）共整合載體的選擇。

41現(xiàn)在是41頁\一共有52頁\編輯于星期四共整合轉化程序現(xiàn)在是42頁\一共有52頁\編輯于星期四（2）

SEV的構建SEV系統(tǒng)即T-DNA邊界拼接系統(tǒng)，亦稱拼接末端載體（sp1it-endvecter,SEV）。它是由Freley等人于1985年建立的另一種共整合載體，也因為它的兩個LIH序列在同源重組前分別處于不同質粒上而得名。SEV與pGV3850的差異及構建過程如下述：1）SEV的受體Ti質粒的T-DNA上的致瘤基因（onc）及TR都已被缺失，T-DNA的保留部分被稱為“左邊界內部同源區(qū)”（1eftinsidehomcology，LIH）。該受體Ti質粒還保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同時還攜有用于細菌篩選的抗性基因。2）SEV中間載體具有一個細菌的抗性基因，一個植物抗性基因及與受體Ti質粒同源的LIH序列及TR。3）通過三親雜交將中間載體導入農(nóng)桿菌后，由于它們之間都具有LIH同源序列，即可發(fā)生同源重組，形成SEV的共整合載體。

43現(xiàn)在是43頁\一共有52頁\編輯于星期四（3）

SEV與pGV3850比較

兩者都是通過受體Ti質粒與中間載體同源重組而形成，故同屬于共整合的一元載體系統(tǒng)，但它們之間有著一定的差異：1）它們的受體Ti質粒與中間載體的結構不同。pGV3850的左右邊界在一個受體Ti質粒上，而SEV來自二個質粒，即TR來自中間載體。2）同源序列不同。pGV3850重組的同源序列是pBR322，而SEV是LIH。3）SEV是更有效的共整合載體。由于pGV3850共整合載體，帶有大腸桿菌pBR322序列，外源基因嵌合在該序列中，因而轉化的植物中也帶有重復的pBR322序列。此重復序列可能對轉化植物中的外源基因的穩(wěn)定性有影響，而SEV系統(tǒng)則排除了這種可能。44現(xiàn)在是44頁\一共有52頁\編輯于星期四2．雙元載體系統(tǒng)

雙元載體（binaryvecter）系統(tǒng)是指由兩個分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質粒構成的雙質粒系統(tǒng),又因為其T-DNA與Vir基因在兩個獨立的質粒上，通過反式激活T-DNA轉移,故稱之為反式載體（transvecter）.45現(xiàn)在是45頁\一共有52頁\編輯于星期四（1）雙元載體系統(tǒng)的構建原理

雙元載體主要包括兩個Ti質粒，即微型Ti質粒和輔助Ti質粒。

Ti質粒上的Vir基因與T-DNA具有反式互補作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的轉移。其次，中間載體含有廣泛寄主范圍質粒的復制起始點（oriV），而代替了共整合載體中用以重組的同源區(qū)，能夠在任何農(nóng)桿菌寄主里自發(fā)復制。46現(xiàn)在是46頁\一共有52頁\編輯于星期四（4）雙元載體的構建

將MiniTi質粒轉入含有He1perTi質粒根癌農(nóng)桿菌的途徑有兩條，一條是直接用純化的MiniTi質粒轉化速凍的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞；另一條是與共整合載體構建一樣，采用三親接合的方式。MiniTi質粒均能以E.coli的pRK2013為輔助質粒，通過三親雜交而接合轉移到含有輔助Ti質粒的農(nóng)桿菌細胞內。由于E.coli的pRK2013不能在農(nóng)桿菌中復制最后消失，含有MiniTi質粒和He1perTi質粒的根癌農(nóng)桿菌可直接用于植物細胞的轉化。

47現(xiàn)在是47頁\一共有52頁\編輯于星期四48現(xiàn)在是48頁\一共有52頁\編輯于星期四（5）一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較雙元載體系統(tǒng)與一元載體系統(tǒng)之間有著較大的差異：