透射電子顯微鏡生物制品制備技術(shù)

冷凍蝕刻法超薄切片冷凍蝕刻法冷凍割斷術(shù)細(xì)胞化學(xué)法電鏡放射自顯影術(shù)放射自顯影技術(shù)掃描電鏡技術(shù)被吞噬的紅細(xì)胞現(xiàn)有的透射電鏡生物制品制備技術(shù)分為兩類：一類是透射電鏡的基本制備技術(shù)，包括超薄切片和負(fù)染色法；另一類是生物制品的特殊技術(shù)，其中包括冷凍蝕刻法、冰凍割斷術(shù)、細(xì)胞化學(xué)法、免疫電鏡法、放射自顯影技術(shù)、X線微區(qū)分析技術(shù)等。取材的方法1）動(dòng)物材料：對(duì)神經(jīng)組織等要進(jìn)行原位固定或灌注固定，待組織適當(dāng)硬化后再取材。胚胎干細(xì)胞的研究2）培養(yǎng)細(xì)胞：生長(zhǎng)在瓶中的細(xì)胞到足夠的量，先倒去培養(yǎng)液，然后倒入適量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分鐘、彎頭吸管吹打或用軟器械輕輕地刮下貼壁的細(xì)胞，將這種混合液倒入離心管中，2000rpm低速離心15-20分鐘，使細(xì)胞呈團(tuán)，棄去上清液，換一次固定液，將其移入修塊臺(tái)，修快成標(biāo)準(zhǔn)塊4oC固定、待用。（2）固定固定的目地是把細(xì)胞在活體狀態(tài)時(shí)的結(jié)構(gòu)盡可能完整的保存下來，避免自身酶的分解而出現(xiàn)自溶，或外界微生物的侵入而產(chǎn)生腐敗，致細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)破壞。1）固定液的作用

A．阻止細(xì)胞自溶。B穩(wěn)定細(xì)胞物質(zhì)成分。C在一些組分的分子之間以化學(xué)反應(yīng)和物理反應(yīng)建立鉸鏈，提供一個(gè)骨架來穩(wěn)定各種細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)。D能提供一定的電子反差

理想的固定劑，應(yīng)具備以下條件：①能迅速而均勻地滲入組織細(xì)胞內(nèi)部，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)各種成分；②能即刻將細(xì)胞“殺死”，盡可能保持細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)，減少死后變化；③對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生收縮及膨脹作用，不產(chǎn)生人工假象及變形；④可保存酶的活性，以利于細(xì)胞化學(xué)測(cè)定工作的進(jìn)行。3）常用的幾種固定劑A四氧化鋨（osmiumtetroxide,OsO4）亦稱鋨酸：鋨酸實(shí)際上不是酸，它的水溶液是中性的，為一種強(qiáng)氧化劑。0.5-1g包裝，淡黃色晶體。具有揮發(fā)性和毒性，在室溫下易揮發(fā)，其蒸氣對(duì)粘膜有刺激作用，在通風(fēng)櫥內(nèi)徑相配制。

優(yōu)點(diǎn)①對(duì)蛋白質(zhì)和脂類固定較好。②對(duì)作為細(xì)胞骨架的磷酸脂蛋白的作用好，對(duì)核蛋白保護(hù)作用很好，因?yàn)樵谟袡C(jī)體內(nèi)核酸和碳水化合物與蛋白制成復(fù)合的形式，因此鋨酸幾乎和所有的細(xì)胞成分結(jié)合。③分子密度高，產(chǎn)生良好的反差，因此鋨酸固定本身也起到生物染色作用。缺點(diǎn)①不能固定糖元和核酸，對(duì)微管固定較差。②擴(kuò)散慢，穿透能力差。③具有揮發(fā)性和粘膜毒性。④不適于進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)工作。B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2）純的容易聚合，目前使用25%水溶液進(jìn)口分裝。存放時(shí)間久了容易變質(zhì)，影響固定。優(yōu)點(diǎn)(1)對(duì)組織穿透力強(qiáng)。(2)能保存某些酶的活性，對(duì)糖元、細(xì)胞膜、核基質(zhì)等有較好的作用。(3)而且組織塊在溶液中可保存較長(zhǎng)的時(shí)間，適用于進(jìn)行超微細(xì)胞化學(xué)研究。2）固定的方法A單固定法：對(duì)單細(xì)胞或固定液易于浸透的組織，一般單獨(dú)用1-2%四氧化鋨固定液固定1-2小時(shí)可達(dá)到固定的目地。B雙固定法：戊二醛（2.5%4oC2h）---鋨酸（1%4oC2h）。C原位固定和灌注固定：將動(dòng)物麻醉、解剖進(jìn)行原位固定。灌注固定：通過血液循環(huán)將醛類的固定液灌流到所需組織中。神經(jīng)組織、視網(wǎng)膜、腎臟。B固定液的配制鋨酸固定液的配制2%的鋨酸固定液的配制：清洗烘干器皿--1G鋨酸+50ml雙蒸水（棕色瓶）數(shù)日可用。0.1mol/L磷酸鹽緩沖液或二甲坤酸鹽緩沖液配制的1%鋨酸固定液。2%的鋨酸緩沖液10ml0.2mol/L緩沖液10ml調(diào)節(jié)PH應(yīng)為7.3-7.4戊二醛固定液的配制25%戊二醛（ml）0.411.6重蒸水（ml）4.643.40.2ml/L緩沖液（ml）555戊二醛最終濃度12.54調(diào)節(jié)固定液PH值到7.3-7.4（3）

脫水1）

清洗:固定后均用和固定液相同的緩沖液沖洗3次，每次15分鐘2）

脫水：常用的脫水劑為乙醇和丙酮。乙醇引起組織中脂類物質(zhì)抽提較丙酮少，且不會(huì)使組織變硬、變脆，故為常用脫水劑，然乙醇不容易和用于包埋劑的環(huán)氧樹脂相混溶，因此在進(jìn)入包埋劑之前常用中間劑環(huán)氧丙烷置換。脫水程序如下表濃度50%70%90%100%時(shí)間10′-15′10′-15′10′-15′3次（每次10′-15′）溫度4oC4oC轉(zhuǎn)室溫室溫經(jīng)驗(yàn)：①脫水劑臨時(shí)配制。②濃度梯度上升。③脫水時(shí)間和濃度。④脫水時(shí)的連續(xù)性。⑤脫水劑的選擇。（4）浸透：其目的是通過脫水劑稀釋包埋劑，最終讓包埋劑取代脫水劑，使其滲透到組織中去。

脫水和包埋劑的比例2:11:2純包埋劑時(shí)間1-2h2-3h2h溫度室溫室溫37oC溫箱經(jīng)驗(yàn)：①浸透時(shí)間。②浸透溫度。（5）

包埋：目的:包埋的目的是讓包埋劑完全浸透到組織內(nèi)部，經(jīng)加溫逐漸聚合成堅(jiān)硬的固體，成為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的支架，能夠承受切片的各種力的作用，有利于切薄片。包埋劑的性質(zhì):①粘度適中，有良好的切割性能。②能耐受電子束的轟擊，高溫不易升華、不變形。③透明度好。④對(duì)人無害。包埋劑的種類①環(huán)氧樹脂類：目前國(guó)內(nèi)使用較多的環(huán)氧樹脂有進(jìn)口的Epon812和國(guó)產(chǎn)的618。原理:環(huán)氧樹脂具有環(huán)氧基和羥基兩個(gè)主要化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)，環(huán)氧基是線型聚合物的末端，易與其它含活性氫原子的化合物如胺類反應(yīng)，形成首尾相接的長(zhǎng)鏈狀聚合物。而單體中的羥基能與酸酐結(jié)合，形成分子間的橫橋連接。因此，將環(huán)氧樹脂、胺類和酸酐三者按比例混合，在一定溫度條件下，可形成具有三維空間結(jié)構(gòu)的交鏈狀聚合物。這種聚合物收縮率小、均勻，組織損傷小，耐電子束的轟擊。包埋后可保存細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)。其缺點(diǎn)是粘度較大，操作不便、切片較為困難，而且反差較弱。②低粘度包埋劑(Spurr)

為適應(yīng)臨床診斷電鏡的需要，目前低粘度包埋劑的應(yīng)用已日趨廣泛。這是一種低粘度的樹脂，能較好地滲入組織內(nèi)部，對(duì)組織結(jié)構(gòu)保存好，耐電子束轟擊，可廣泛應(yīng)用于各種生物材料，尤其適宜于較致密的組織。③水溶性包埋劑：

是進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)研究較理想的包埋劑。

原理:水溶性包埋劑可以在較低溫度的紫外線照射下進(jìn)行聚合，避免了一般包埋劑必須在高溫下聚合而給酶活性帶來的破壞，所以是酶活性定位和定量研究十分優(yōu)良的包埋劑。包埋劑:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(簡(jiǎn)稱GMA)、聚乙二醇、Aquon等④所加的固化劑，有十二烯基虎鉑酸酐（DDSA）和甲基內(nèi)次甲基四氫苯二甲酸酐（MNA）,增韌劑為鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速劑為2,4,6,一三苯酚（DMP—30）。1）

環(huán)氧樹脂的性能和配制：618樹脂5ml十二烯基丁二酸酐DSA（固化劑）5ml苯二甲酸二丁酯DBP（增塑劑）0.3ml2,4.6三苯酚稱DMP30（加速劑）0.1ml60oC烘箱內(nèi)加溫使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化劑、增塑劑、加速劑，邊加邊攪拌，最后充分?jǐn)嚢?0分鐘，至37oC溫箱中使氣泡逸出。

Epon812的配制A液：Epon81262mlDDSA(固化劑)100mlB液：Epon812100mlMNA(固化劑)89mlA液和B液分別配制，使用時(shí)用不同比例將二者混合后再加1.5%DMP-30(加速劑)即可。A液和B液的比例：冬季2：8。夏季1：9。B液可以增加包埋塊的硬度。1）

包埋的方法常規(guī)包埋①

將浸透在包埋劑的組織塊，轉(zhuǎn)移到包埋囊中，使之位于囊的中央，然后加包埋劑。②

把寫好標(biāo)本塊編號(hào)的小紙條卷成環(huán)狀，放入囊中，插入包埋劑中。③

不加蓋，37oC過夜，這也就是純包埋劑浸透。④

次日，升溫到60oC48小時(shí)固化。⑤

固化完畢，關(guān)溫箱，自然冷卻。⑥

去掉外殼，取出組織包埋塊將組織包埋塊，存放在干燥器中。

定向包埋：注意事項(xiàng)①防潮、干燥。②包埋劑要充分混勻。③防氣泡。④包埋后立即清洗器皿。⑤自身保護(hù)。⑥干燥器中存放包埋塊。

（6）切片1）選擇和清洗載網(wǎng)。常用的載網(wǎng)有圓形的銅網(wǎng)，細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)常用鎳網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)和銀絲網(wǎng)。直徑為3mm，目數(shù)為200-300

2）

支持膜的制備：①

福爾莫瓦膜：常用氯仿配制的0.2%-1.5%的聚乙烯醇縮甲醛液（formrar）。注：制膜時(shí)室內(nèi)的溫度小于60%，否則會(huì)出現(xiàn)白點(diǎn)。②

火棉膠膜：特點(diǎn)，火棉膠膜的機(jī)械強(qiáng)度比福爾莫瓦膜弱，但制作容易。常用1-2%醋酸異戊酯溶液采用漏斗法和貼附法制膜。③

帕羅丁支持膜：目前國(guó)外比較常用，一般配制30%左右的帕羅丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉膠同。④

碳膜：炭膜的機(jī)械程度和穩(wěn)定性較好，適用于高分辨率的觀察，用真空噴鍍儀采用碳升華噴鍍法制備。⑤

復(fù)合膜：有機(jī)膜上噴鍍5-10nm的碳膜。⑥

微孔支持膜：高分辨率觀察使用。2）

包埋塊修整：修成四面錐體（45oC角）5）超薄切片機(jī)的構(gòu)造

6）切片操作

7）

切片厚度:灰色40-50nm

銀灰色50-70nm

金黃色70-90nm

紫色90nm以上(7)染色1）

常用的電子染色劑醋酸鈾(UO2(CH3COO)2.2H2O：特性：具有放射性和毒性，對(duì)光不穩(wěn)定，儲(chǔ)存、染色最好閉光，變混則失效。廣泛使用，能產(chǎn)生較高的反差。主要是提高核酸、核蛋白和結(jié)締組織纖維成分的反差；對(duì)糖分、分泌顆粒、溶酶體等也能染色，但對(duì)膜的結(jié)構(gòu)染色較差。常用濃度：50%-70%的乙醇或丙酮配制的2%-3%的溶液。染的時(shí)間：組織塊染色時(shí)間為1-2h或過夜。片染30min即可。

枸櫞酸鉛（leadacetate）：特點(diǎn)：①毒性大。②與空氣中的二氧化碳結(jié)合形成白色的碳酸鉛沉淀。③高PH（11-12）染色效果好。也是目前最廣泛使用的染色液。它具有很高的電子密度，對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均有廣泛的親和性，能提高細(xì)胞膜系統(tǒng)及酯類的反差。枸櫞酸鉛（leadcitrate）溶液的配制硝酸鉛〔Pb(NO3)2〕1.33g枸櫞酸鈉〔Na3(C6H6O7).2H2O〕1.76g雙蒸水30ml混合后振蕩30min呈乳白色，加1.0mol/L新鮮配制的NaOH8ml雙蒸水加至50ml調(diào)PH到122）