昆蟲病原細(xì)菌的利用第1頁/共63頁第八章昆蟲病原細(xì)菌的利用昆蟲病原細(xì)菌的主要類群金龜子乳狀病芽孢桿菌球性芽孢桿菌蘇云金桿菌第2頁/共63頁

在自然界中，細(xì)菌種類繁多，數(shù)量大，分布廣泛，其中能使昆蟲感染致病的蟲生細(xì)菌相當(dāng)多，昆蟲因細(xì)菌而引起的疾病稱為細(xì)菌病。細(xì)菌病有多種，不同的細(xì)菌引起的癥狀（Sympton）也各不相同，但細(xì)菌病有其共同的特征，即當(dāng)昆蟲感病后，不大活動(dòng)，食欲減退，口腔及肛門常有排泄物，病原菌侵入體腔后引起敗血癥。死后蟲體色加深，一般都有一股臭味。由于體都軟化腐爛，所以通稱為軟化病。但軟化病不完全是細(xì)菌病。第3頁/共63頁一、昆蟲病原細(xì)菌的主要類群

Bucher（1960）曾按昆蟲病原細(xì)菌的特性和致病所需條件如侵染劑量、侵染部位、對寄主的?；院妥饔玫奶囟ǚ绞椒譃椋簩Ｐ圆≡?xì)菌、產(chǎn)生晶體的芽孢桿菌、兼性病原細(xì)菌和潛勢病原細(xì)菌。似可突出產(chǎn)晶體的芽孢桿菌，但產(chǎn)晶體的蘇云金桿菌亦屬兼性，兼性病原中的球形芽孢桿菌中的有毒菌株也能產(chǎn)生晶體。因此大致可劃分為專性、兼性、潛勢病原細(xì)菌3類。

第4頁/共63頁（一）專性昆蟲病原細(xì)菌（Obligateentomopathogenicbacteria）

是一類專性寄生的芽孢桿菌。只能在寄主細(xì)胞中生長繁殖，不能腐生，不能在人工培養(yǎng)基上正常生長，對特定的寄主昆蟲有很強(qiáng)的致病力，經(jīng)口容易傳染。自然界中寄主范圍較窄。如日本金龜子芽孢桿菌（Bacilluspopilliae）和天幕毛蟲芽孢桿菌（Clostridiummalacosomae）。前者在另節(jié)介紹。第5頁/共63頁Bacilluspopilliae第6頁/共63頁（二）兼性病原細(xì)菌（Facultativeentomopathogenicbacteria）

是一類可在昆蟲體以外的生境中增殖，也能在人工培養(yǎng)基上正常生長發(fā)育的細(xì)菌。包括產(chǎn)孢和不產(chǎn)孢的桿菌。寄主范圍較廣。細(xì)菌在寄主消化道內(nèi)增殖，并侵入體腔內(nèi)，造成寄主染病死亡。有些種類能產(chǎn)生毒素，如果毒素進(jìn)入消化道內(nèi)，就能引起昆蟲中毒。這類細(xì)菌包括引起細(xì)菌性中毒病的蘇云金桿菌及其變種以及能引起靈菌敗血病的粘質(zhì)沙雷氏菌等。第7頁/共63頁第8頁/共63頁（三）潛在病原菌（Potentialentomopathogenicbacteria）多數(shù)為腐生菌，普遍存在于昆蟲的消化道中。由于毒素和酶的產(chǎn)生數(shù)量少，難以侵入體腔內(nèi)給宿主造成危害。作為寄主的昆蟲種類很多，不是特定昆蟲種的病原體。能引起家蠶細(xì)菌性敗血病和細(xì)菌性腸道病的一些細(xì)菌便屬于這一類。第9頁/共63頁（四）細(xì)菌殺蟲劑的特點(diǎn)自然界中廣泛存在能夠引起昆蟲疾病的病原細(xì)菌，以上介紹的僅是其中的一部分，還有許多有待進(jìn)一步探索。但作為一種微生物殺蟲劑，并不是所有病原細(xì)菌都可以入選，而應(yīng)該具備下列一些基本屬性：●（1）毒力高。菌劑毒力足以壓倒害蟲的抗病力，能夠穩(wěn)定可靠地使害蟲發(fā)病致死；第10頁/共63頁●（2）穩(wěn)定性。菌劑不致因受自然環(huán)境影響（如日光、干燥等）、人工處理、懸浮劑、載體、貯藏、不同施藥方式等而減低殺蟲效力；●（3）殘效期長，并有在害蟲種群中自然傳播的能力；●（4）作用迅速；●（5）有選擇性。即對防治對象劇毒，而對植物、益蟲以及哺乳動(dòng)物等無毒；●（6）可以大規(guī)模生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)安全。第11頁/共63頁二、金龜子乳狀病芽孢桿菌

Dutky（1940）報(bào)道日本金龜子芽孢桿菌（B.popilliae）和緩死芽孢桿菌（B.lentimorbus）能引起日本金龜子等幼蟲的乳狀?。∕ilkydisease）。二菌所致病情略異，分別稱為Ａ和Ｂ型。其后世界各國從不同金龜子幼蟲分離出乳狀病原細(xì)菌多種。用金龜子芽孢桿菌防治日本金龜子是生物防治最典型的例子之一。第一個(gè)日本金龜子芽孢桿菌制劑于1950年在美國登記，成為美國政府批準(zhǔn)的第一個(gè)生物防治制劑。第12頁/共63頁Grubinfectedwithmilkydisease(left)causedbyabacteriumcallBacilluspopilliae第13頁/共63頁Healthybeetlelarva(left);larvainfectedwithB.popilliae(right)第14頁/共63頁Bacilluspopilliae第15頁/共63頁1、侵染金龜子芽孢桿菌主要通過芽孢感染和傳播，芽孢經(jīng)口攝入。當(dāng)幼蟲吞食芽孢后，芽孢可以在腸道中萌發(fā)成桿狀的營養(yǎng)細(xì)胞，營養(yǎng)細(xì)胞能夠侵染中腸細(xì)胞，隨后穿過腸壁進(jìn)入體腔，并大量繁殖，使幼蟲的血淋巴呈乳狀，死亡幼蟲呈乳白色，故又稱為乳狀病。第16頁/共63頁2、增殖

金龜子芽孢桿菌在體腔中的增殖經(jīng)歷4個(gè)時(shí)期：●（1）芽孢萌發(fā)期，即所有細(xì)菌都是營養(yǎng)細(xì)胞；●（2）營養(yǎng)繁殖期，即90%是營養(yǎng)細(xì)胞，●（3）芽孢形成期，65-70%是營養(yǎng)細(xì)胞，17%-28%是含芽孢的細(xì)胞，●（4）芽孢成熟期，即95%的細(xì)菌含芽胞。感染約10-14d后，被感染的昆蟲幼蟲死亡。幼蟲的死亡原因還不是很清楚，一般認(rèn)為是營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，或是存在穩(wěn)定毒素，或是氧化酶代謝紊亂。第17頁/共63頁3、培養(yǎng)繁殖

金龜子芽孢桿菌的芽孢能在寄主體外存活，營養(yǎng)體也能在人工培養(yǎng)基上生長繁殖，但卻不能在人工培養(yǎng)基上正常地形成芽孢。因此，商品制劑Doom、Japidemic和MilkySpore都是采用幼蟲活體培養(yǎng)的方法制備的。一般每頭幼蟲可產(chǎn)生2-5×109芽孢。近年來，國外試圖克隆編碼金龜子芽孢桿菌的殺蟲活性蛋白的基因，并將其導(dǎo)入其它受體菌中進(jìn)行表達(dá)，這為進(jìn)一步開發(fā)利用此菌提供了新的途徑。第18頁/共63頁三、球性芽孢桿菌

球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)是一種在自然界廣泛分布的芽孢桿菌，大多數(shù)菌株對昆蟲沒有毒性，但從中發(fā)掘出了一些對蚊幼蟲有高毒力的菌株。它的毒效成分在細(xì)胞內(nèi)，不分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)液中。因此，只有昆蟲吞食細(xì)胞后才顯示毒性。迄今已分離到各種球形芽孢桿菌的菌株近700株，僅有50多個(gè)菌株是有毒菌株。第19頁/共63頁1、球形芽孢桿菌的毒素球狀芽孢桿菌有兩類毒素，一種來自營養(yǎng)細(xì)胞，是一種在營養(yǎng)生長期產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，這種蛋白的基因已被克隆和作序列分析，另一種毒素來源于伴孢晶體，是分子量分別為42Ku和51Ku的蛋白質(zhì)，并且只有當(dāng)兩種蛋白質(zhì)在一起時(shí)才產(chǎn)生毒性，球形芽孢桿菌的伴孢晶體與蘇云金芽孢桿菌不同，它的伴孢晶體被部分地包在芽孢外壁之中，使得芽孢和伴孢晶體在離體的條件下仍是一個(gè)整體。第20頁/共63頁第21頁/共63頁2、球形芽孢桿菌的殺蟲范圍

球形芽孢桿菌的殺蟲范圍僅限于蚊蟲的幼蟲，它通過取食過程進(jìn)行感染，蚊子的幼蟲在取食8-12h后，即可發(fā)生死亡，幼蟲吞入球狀芽孢桿菌后，菌體在腸道中被消化，細(xì)胞壁破裂，菌體內(nèi)的毒素釋放出來，從而殺死蚊蟲的幼蟲。第22頁/共63頁第23頁/共63頁3、球狀芽孢桿菌的利用

球狀芽孢桿菌在昆蟲死后，可以在蟲尸中重新增殖，芽孢的數(shù)目增加。由此可見球狀芽孢桿菌的芽孢和伴孢晶體在環(huán)境中持效期較長，并有可能在環(huán)境中再循環(huán)。因此，從20世紀(jì)80年代中后期開始，球狀芽孢桿菌高毒菌株的篩選工作開始受到重視。迄今為止，美國、法國及我國等10個(gè)國家研制了不同劑型的產(chǎn)品十余種，但多是一些實(shí)驗(yàn)劑型，主要用于殺蚊幼蟲的效果評(píng)價(jià)。我國生產(chǎn)了Bs-10、C3-41等乳劑，曾在野外大面積用于蚊蟲的防治。第24頁/共63頁四、蘇云金桿菌

蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，簡稱B.t.）最早發(fā)現(xiàn)于1902年，1938年世界上第一個(gè)蘇云金芽孢桿菌制劑Sporeine在法國問世，從而掀開了蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑生產(chǎn)的序幕。特別是近10年來，蘇云金桿菌已經(jīng)成為加拿大控制樅色卷蛾（sprucebudworm）的主要手段。在其它國家，蘇云金桿菌運(yùn)用于控制毛蟲（caterpillar）、吉卜賽毒蛾（gypsymoths）等。目前全世界約有蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑100個(gè)多個(gè)品種，年銷售額近1億美元。第25頁/共63頁ThisleafrollercaterpillardiedafteringestingBacillusthuringiensis.Discolourationofthegut,asseenhere,istypicalofmortalityfromBacillusthuringiensis第26頁/共63頁第27頁/共63頁（一）基本特征1、營養(yǎng)體

蘇云金桿菌是G+的好氣性芽孢桿菌，營養(yǎng)體大小1.0-1.2×3.0-5.0μm，兩端鈍圓，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，少數(shù)無鞭毛，營養(yǎng)體單個(gè)存在或2~5個(gè)成鏈狀。內(nèi)生芽孢橢圓形或圓形，直徑小于菌體的寬度，孢囊不膨大。營養(yǎng)體為繁殖階段，橫裂生殖，對數(shù)生殖期往往2、4、8個(gè)或更多的營養(yǎng)體連在一起成串狀。此時(shí)繁殖快、代謝旺盛，適于用作接種材料。營養(yǎng)體在芽孢出現(xiàn)前先停止繁殖，細(xì)胞質(zhì)濃縮，出現(xiàn)液泡和微粒，并逐漸形成芽孢和伴孢晶體。第28頁/共63頁第29頁/共63頁2、芽孢囊

在形成芽孢的同時(shí)，在菌體內(nèi)的一端或兩端能形成具蛋白質(zhì)性質(zhì)的一個(gè)、兩個(gè)乃至多個(gè)菱形、方形、長方形、橢圓形、鑲嵌形或不規(guī)則形的伴孢晶體，是其主要的活性成分。伴孢晶體由不同分子量的多肽——原毒素（protoxin）組成。伴孢晶體具多種形態(tài)，典型的為梭狀六面體，在顯微鏡下成菱形，也有四面體、圓形、方形和不規(guī)則形的。第30頁/共63頁Bacillusthuringiensissporeandproteincrystals第31頁/共63頁3、蘇云金芽孢桿菌的類群根據(jù)營養(yǎng)細(xì)胞鞭毛抗原的血清學(xué)反應(yīng)及其它特性，蘇云金芽孢桿菌可劃分為40個(gè)血清種和54個(gè)血清型亞種。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌的伴孢晶體蛋白至少對脊椎動(dòng)物中4個(gè)門和節(jié)肢動(dòng)物門中9個(gè)目的有害生物有活性。1977年從以色列分離到血清型H-14，對蚊、蚋、白蛉幼蟲有速效，無殘效，但對蠓類和家蠅幼蟲無作用；少數(shù)蘇云金桿菌產(chǎn)生外毒素（exotoxin）血清，對家蠅亦有毒性。第32頁/共63頁4、蘇云金桿菌不同變種或菌株對昆蟲的致病性和毒力的差異

蘇云金桿菌的不同變種對昆蟲的毒力差異很大。屬于不同血清型的變種或具有相同血清型的不同變種的寄主范圍是不同的。即使是蘇云金桿菌類群中的同一個(gè)變種，不同的菌株對昆蟲的毒力差異也可以很大。毒力的大小與產(chǎn)生的毒素有關(guān)，也與細(xì)菌的致病機(jī)制和寄主昆蟲的特異性有關(guān)。這對工業(yè)生產(chǎn)中有效菌株的選擇以及高毒力或其他特異性菌株的選育具有重要意義。第33頁/共63頁5、蘇云金桿菌的培養(yǎng)特征

蘇云金桿菌對營養(yǎng)的要求不嚴(yán)，能在常用的細(xì)菌培養(yǎng)基(如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)中生長快而旺盛、并形成芽孢和伴孢晶體。在以黃豆餅粉、棉子仁粉、玉米漿等農(nóng)副產(chǎn)品為主要養(yǎng)料的深層發(fā)酵中進(jìn)行大量培養(yǎng)，每ml發(fā)酵液活芽孢數(shù)可達(dá)20~150億(大致有同等數(shù)量的伴孢晶體)。發(fā)酵液加填充料經(jīng)板框壓濾濃縮后，用噴霧干燥法制成菌粉，或?qū)l(fā)酵液濃縮(離心或真空減壓濃縮)后，加助劑制成液劑、乳劑或油劑。蘇云金桿菌制劑亦可用半固體發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)。第34頁/共63頁（二）蘇云金桿菌的毒素和致病機(jī)理蘇云金桿菌對昆蟲的致病作用主要通過昆蟲食入菌劑而引起。菌劑包括芽孢和細(xì)菌所產(chǎn)生的毒素。菌體本身的繁殖可導(dǎo)致害蟲的死亡，而昆蟲能在短時(shí)間內(nèi)死亡往往是蘇云金桿菌產(chǎn)生的毒素所致。蘇云金桿菌對多種昆蟲能引起發(fā)病而死，但對另一些昆蟲則致病力很差，甚至沒有作用。該類細(xì)菌的殺蟲作用及其有效范圍與致病機(jī)制和昆蟲寄主密切相關(guān)。第35頁/共63頁1、蘇云金桿菌的毒素

蘇云金桿菌產(chǎn)生的毒素分為兩大類：一類是內(nèi)毒素，即伴孢晶體內(nèi)所含毒素；另一類是外毒素，是細(xì)菌在生長過程中分泌在菌體外的代謝產(chǎn)物。蘇云金桿菌所產(chǎn)生的毒素主要是β外毒素和δ內(nèi)毒素。（1）甲體外毒素（α-exotoxin）是一種能被熱破壞的（120℃，20min）蛋白質(zhì)，在菌體培養(yǎng)對數(shù)期的后期時(shí)，先于芽孢和晶體的形成產(chǎn)生?？诜苁鼓承┖οx中毒。蘇云金桿菌類中的不少變種能產(chǎn)生這種外毒素。

第36頁/共63頁（2）乙體外毒素（β-exotoxin）又稱熱穩(wěn)定外毒素、蠅毒素，能忍耐121℃(15min)的高溫和對家蠅幼蟲有毒性。蘇云金素是廣譜毒素，對較多目的昆蟲有毒性。β外毒素是一種腺嘌呤核苷酸衍生物，相對分子量約為700，它是蘇云金芽孢桿菌在一定培養(yǎng)條件下所產(chǎn)生的細(xì)胞外毒素，可溶于水，熱穩(wěn)定性好，經(jīng)高溫高壓處理后仍能保持毒性。熱穩(wěn)定外毒素包含兩種核苷酸衍生物，為蘇云金素A(thuringiensinA)和蘇云金素B(thuringiensinB)。菌素B是菌素A的r-內(nèi)脂，菌素A加熱失水而成B，而菌素B可由堿水解而成A。對家蠅毒力A大于B約8倍。第37頁/共63頁（3）丙體外毒素（γ-exotoxin）是一種（或多種）未經(jīng)鑒定的酶，能使卵黃瓊脂變清（例如見于殺蟲變種）。（4）丁體內(nèi)毒素（δδ-endotoxin）通常又被稱為伴孢晶體（Parasporalcrystal）、伴孢晶體包含體（Parasporalcrystalinclusionbody）、晶體蛋白（Crystalprotein）、晶體毒素（Crystaltoxin）、殺蟲晶體蛋白（Insecticidalcrystalprotein，ICPs），是蘇云金桿菌具有殺蟲性能的主要毒素。但晶體蛋白須在昆蟲中腸堿性條件下經(jīng)蛋白酶的消化作用裂解為有作用部分和無作用部分，只有有作用的部分或核心才能算丁體內(nèi)毒素。第38頁/共63頁●①晶體毒素的形成和形態(tài)

晶體與芽孢同時(shí)形成，其主要成分是蛋白質(zhì)。晶體的形成與芽孢的形成有密切關(guān)系。如能抑制芽孢形成的化合物如醋酸氟也能抑制晶體的形成，但二者的形成又是相對獨(dú)立的。如在低溫（14~15℃）培養(yǎng)條件下不能形成芽孢，但晶體仍能產(chǎn)生。第39頁/共63頁●②伴孢晶體的成分

B.t.的伴孢晶體包涵體中含有一或多種殺蟲晶體蛋白（Insecticidalcrystalprotein,ICPs），按一定方式聚合成晶體結(jié)構(gòu)，包括二聚體亞單位的多肽，多肽鏈中的半胱氨巰基大多處于分子表面，與相鄰亞單位形成二硫鍵共價(jià)聚合的形式使原毒素（Protoxin）蛋白包容在伴孢包涵體中呈穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

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晶體不溶于水和有機(jī)溶劑，可溶于堿性溶液。雖屬熱敏感毒素，但具有一定的耐熱性，在65℃中可保持1h，80℃下20min也不致破壞，80~100℃下30min可被破壞。晶體由18種氨基酸組成，各變種在氨基酸的組成上是相同的，其含量也相近，可見不同變種對昆蟲表現(xiàn)出的不同毒力可能存在于高一級(jí)的結(jié)構(gòu)單位之中。第41頁/共63頁●③殺蟲晶體蛋白基因（ICPgenes）

Hofte等（1989）根據(jù)核苷酸序列的同源性和殺蟲范圍的不同將Cry基因分為CryⅠ（高抗鱗翅目昆蟲）、CryⅡ（抗鱗翅目和雙翅目昆蟲）、CryⅢ（高抗鞘翅目昆蟲）、CryⅣ（抗雙翅目昆蟲）、Cyt（Cytolytictoxin，溶細(xì)胞蛋白毒素基因）5類14個(gè)亞類。Feitelstein等（1992）將Cry基因分為7類（增加對鱗翅目和鞘翅目都有抗性的CryⅤ、對線蟲有效的CryⅥ）29亞類。Crickmore等（1995）將其修訂為Cry1（含22亞類），Cry2、Cry8、Cry9（各含3亞類），Cry3（含4亞類）、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry11（各含2亞類），Cry10、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cyt1、Cyt2（各含1類）。第42頁/共63頁CryIA第43頁/共63頁2、蘇云金桿菌致病機(jī)理

蘇云金芽孢殺死宿主昆蟲主要靠芽孢及毒素。在敏感昆蟲吞食蘇云金芽孢桿菌的芽孢后，芽孢在昆蟲腸道中迅速萌發(fā)并增殖，引起腸道麻痹，最后穿透腸壁進(jìn)入血液，引起昆蟲敗血癥而中毒死亡。第44頁/共63頁●（1）β–外毒素的致病機(jī)理：它是RNA聚合酶的竟?fàn)幰种苿筛蓴_有關(guān)激素的合成，從而導(dǎo)致幼蟲發(fā)育畸形或不能正?；肌ＬK云金芽孢桿菌雖然有較強(qiáng)的殺蟲能力，但它必須經(jīng)吞食過程進(jìn)入體內(nèi)才能殺死昆蟲。因此在實(shí)際應(yīng)用中，將其與吸引昆蟲的物質(zhì)一起噴灑，可以增加昆蟲吞食的可能性。第45頁/共63頁●（2）δ-內(nèi)毒素的致病機(jī)理：當(dāng)敏感昆蟲攝食蘇云金桿菌的伴孢晶體后，在中腸腸液堿性條件下打開二硫鍵溶解成原毒素，進(jìn)而在腸道胰蛋白酶的作用下激活成抗原蛋白酶的毒素核心片斷（toxiccorefragment），才能與刷狀緣（brushborder）上特異性受體高親和性地結(jié)合，快速而不可逆地插入細(xì)胞質(zhì)膜，形成孔或損傷（lesion），并破壞鉀、鈉離子梯度，引起膜的非極性化，最后通過膠體滲透裂解（Colloid-osmoticlysis），將細(xì)胞膨脹并裂解，昆蟲幼蟲停止取食，最終導(dǎo)致死亡。第46頁/共63頁（三）Bt.內(nèi)毒素的利用1、含Bt.內(nèi)毒素新菌株的利用從20世紀(jì)80年代中后期開始，隨著生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們利用DNA重組技術(shù)對毒素基因進(jìn)行改造，構(gòu)建綜合性能優(yōu)良的重組菌株并發(fā)展遺傳重組殺蟲劑已成為國外各大生物農(nóng)藥公司的目標(biāo)，至90年代初，已有10余種遺傳重組殺蟲劑被批準(zhǔn)進(jìn)行后期田間試驗(yàn)。通過構(gòu)建重組菌株可以實(shí)現(xiàn)以下目標(biāo)：●（1）擴(kuò)大殺蟲譜；●（2）延長殺蟲毒素的持效期及改進(jìn)釋放性能；●（3）提高毒力和殺蟲晶體蛋白的產(chǎn)量。第47頁/共63頁

例如，美國的Sandoz公司通過略加改進(jìn)Bt.wuhanensis基因毒蛋白的氨基酸組成，使之殺蟲毒性提高2～3倍，然后又將基因克隆并經(jīng)穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入Bt.kurstaki基因。這種具有雜合Bt毒素基因的工程菌已于1990年進(jìn)入放大試驗(yàn)，具優(yōu)異效果。利用抗生性標(biāo)記法檢測證實(shí)，該工程菌除毒力增強(qiáng)和殺蟲譜擴(kuò)大外，其它特性與原Bt菌無差異，未發(fā)現(xiàn)該工程菌對環(huán)境產(chǎn)生不良影響。不少國家在進(jìn)行類似的研究，以期獲得對多種害蟲高效的新型Bt工程菌。第48頁/共63頁2、含Bt.內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因作物的利用

1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一個(gè)編碼Bt.殺蟲晶體蛋白基因，揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。迄公為止，已先后分離出4萬多個(gè)Bt.菌株、68個(gè)亞種，對多個(gè)殺蟲晶體蛋白基因序列進(jìn)行了分離測定。第49頁/共63頁

1987年，比利時(shí)Vacek等人報(bào)道了首例有關(guān)轉(zhuǎn)Bt基因煙草和番茄的研究結(jié)果。經(jīng)過密碼子優(yōu)化的B.t.基因已被成功地導(dǎo)入煙草、水稻、玉米、棉花、油菜、大豆等多種植物，以抗鱗翅目昆蟲為主要目標(biāo)，獲得了一大批具良好抗蟲性的轉(zhuǎn)基因植物品種和種質(zhì)資源，產(chǎn)生了顯著的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。目前B.t.基因己成為植物基因工程及轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用最廣泛，最具潛力和應(yīng)用前景的抗蟲基因。目前全世界總共已獲得了50多種轉(zhuǎn)B.t.殺蟲晶體蛋白基因植物。其中以雙子葉植物居多，而單子葉植物由于其遺傳轉(zhuǎn)化較困難，所以獲得的轉(zhuǎn)Bt基因的植物就相對較少。在已獲得的轉(zhuǎn)B.t.殺蟲晶體蛋白基因植物中，絕大多數(shù)植物對靶標(biāo)昆蟲產(chǎn)生了強(qiáng)烈的毒殺作用，有效地減少了害蟲損失。第50頁/共63頁第51頁/共63頁

2004年全球轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花和其它作物播種面積達(dá)到了2億英畝，比2003年的1.67億英畝增長了20%。

第52頁/共63頁第53頁/共63頁第54頁/共63頁第55頁/共63頁轉(zhuǎn)基因作物的優(yōu)點(diǎn)：

●（1）己發(fā)現(xiàn)的高水平的Bt抗性基因都是隱性基因，在植物體內(nèi)可穩(wěn)定地遺傳與表達(dá)；●（2）殺蟲蛋白對昆蟲的幼蟲特別有效，可實(shí)現(xiàn)蟲害的早期防治；●（3）可實(shí)現(xiàn)植物的整株保護(hù)，尤其是化學(xué)藥劑噴施不到的部位的防治（如鉆心蟲）●（4）對人、畜及非靶標(biāo)動(dòng)物群休無害，不會(huì)破壞生態(tài)平衡。由于毒蛋白存留在植物組織中，不會(huì)污染環(huán)境；●（5）抗性持久，不易被環(huán)境因素所破壞。第56頁/共63頁

轉(zhuǎn)基因Bt作物開始商業(yè)應(yīng)用后，人們對Bt作物和目標(biāo)害蟲之間的互作關(guān)系(即Bt作物的抗蟲性及害蟲對Bt作物的抗性)進(jìn)行了一系列的研究，其中害蟲的抗性問題受到了特別的關(guān)注。近年來，轉(zhuǎn)基因Bt作物環(huán)境釋放的安全性成為國際上關(guān)注的另一個(gè)焦點(diǎn)，其中之一就是轉(zhuǎn)基因Bt作物對不同營養(yǎng)層次上的非目標(biāo)生物將會(huì)發(fā)生怎樣的影響。目前比較關(guān)注的Bt作物和天敵的關(guān)系包括以下幾方面，（1）Bt作物對天敵存活和發(fā)育的直接(Bt毒素)或間接(通過害蟲)影響；（2）天敵對Bt作物上的目標(biāo)害蟲的行為反應(yīng)、天敵和Bt作物對目標(biāo)害蟲的聯(lián)合控制作用及其與害蟲抗性治理之間的關(guān)系；（3）Bt作物田中天敵的群落結(jié)構(gòu)和種群動(dòng)態(tài)，既包括有個(gè)體水平(生理、行為)上的效應(yīng)，也可能有種群及群落水平上的影響。第57頁/共63頁3、害蟲對B.t.內(nèi)毒素的抗性自20世紀(jì)90年代以來，在美國、泰國、馬來西亞、日本、中國等先后發(fā)現(xiàn)小菜蛾田間種群對B.t.產(chǎn)生抗性以來，至少已有10種蛾類、2種甲蟲、4種蚊蠅類經(jīng)50次以上反復(fù)B.t.處理而表現(xiàn)有選擇抗性。在16種蟲種中經(jīng)3~