———利用熒光法檢測蛋白濃度的兩種方式

蛋白質(zhì)定量是許多蛋白質(zhì)生物學(xué)工作流程的重要組成部分，是蛋白質(zhì)電泳、蛋白質(zhì)印跡、質(zhì)譜和免疫分析等常用技術(shù)之前的必要步驟。與傳統(tǒng)的BCA、Bradford等比色法測蛋白的方式相比，熒光法測蛋白動態(tài)范圍更寬、準(zhǔn)確性更高。蛋白質(zhì)定量是許多蛋白質(zhì)生物學(xué)工作流程的重要組成部分，是蛋白質(zhì)電泳、蛋白質(zhì)印跡、質(zhì)譜和免疫分析等常用技術(shù)之前的必要步驟。與傳統(tǒng)的BCA、Bradford等比色法測蛋白的方式相比，熒光法測蛋白動態(tài)范圍更寬、準(zhǔn)確性更高。試劑及儀器

QubitProteinAssayKits（Thermo：Q33212）

Qubit4熒光計（Thermo）

Fluo-200熒光計（奧盛）

Feyond-A300多功能酶標(biāo)儀（奧盛）

方法

標(biāo)品配置

加樣體積10L標(biāo)品配制將試劑盒中最高濃度的400ng/uL蛋白標(biāo)品稀釋配制成300、200、100、50、25、12.5ng/uL共6個濃度，試劑盒濃度范圍在12.5g/mL到5mg/mL。

操作步驟

1.根據(jù)試劑說明書，制備染料Mix工作液及0、200及400ng/uL校準(zhǔn)點試劑，校準(zhǔn)曲線完成后，分別在Qubit4與Fluo-200上進(jìn)行檢測；

2.在96孔黑色平底微孔板的每孔中加入10uL標(biāo)品溶液后，每孔中再添加190uL的Mix工作液，混勻后避光5分鐘，開始儀器檢測，標(biāo)品與空白布局如圖1，儀器參數(shù)如表1。

表1Feyond-A300參數(shù)

試劑波長EX/EM：470/525PMT增益中低穩(wěn)定時間150ms積分時間40s

圖1.樣品布局界面結(jié)果

1.利用Feyond-A300的內(nèi)置數(shù)據(jù)處理軟件，將蛋白標(biāo)品濃度與熒光強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，采用四參數(shù)（4PL）擬合方式，得到曲線方程與曲線擬合度，R2接近為1（圖2）。

圖2.蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲2.濃度范圍在12.5ng/uL~400ng/uL時，F(xiàn)luo-200與Qubit4的檢測濃度偏差均在10%以內(nèi)，是Qubit的合理偏差。除接近極限濃度的最低點外，F(xiàn)eyond-A300的檢測濃度與Qubit4相比也在合理偏差內(nèi)，且與理論濃度更為接近（表2）。

表2三款儀器的檢測數(shù)據(jù)

理論濃度Qubit4Fluo-200Feyond-A30012.52023.118.0232533.230.5929.3195050.646.1650.62610095.292.94101.835202384192.39197.206300286299.71302.978400400401.22398.596

總結(jié)

Qubit熒光檢測蛋白試劑盒，不僅在Qubit儀器上可以適用，也可在Feyond-A300的熒光檢測功能上適用，并且準(zhǔn)確性基本無差異，熒光計檢測無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，僅需進(jìn)行標(biāo)品點的校準(zhǔn)，便可直接進(jìn)行濃度的測試，簡單便捷。Feyond