生物制藥學(xué)基因治療與反義藥物第1頁/共76頁1971年9月21日，他出生在美國德克薩斯州休斯敦市的圣魯克醫(yī)院1983年底，新任主治醫(yī)生為“泡泡男孩”移植了姐姐凱瑟琳的骨髓干細(xì)胞手術(shù)后，凱瑟琳骨髓內(nèi)潛伏的致命病毒就侵入了他的身體醫(yī)生放棄了治療，把“泡泡男孩”從禁錮了他12年的泡泡里抱了出來

1984年2月22日，與病魔和孤獨(dú)斗爭了12年半的“泡泡男孩”享受著生命的尊嚴(yán)與自由，靜靜地離開了人世第2頁/共76頁嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病（severecombinedim-munodeficiemcy，簡稱SCID）是以各種獲得性免疫功能都明顯喪失為特征的先天性疾病，若不移植免疫活性組織以重建免疫，或無菌隔離，患者將均在1歲以內(nèi)天折2000年，法國最早開始嘗試用基因療法治療免疫缺陷。但由于接受治療的2名嬰兒先后患上了白血病，使基因療法的安全性受到質(zhì)疑。但有專家認(rèn)為，出現(xiàn)這種情況的原因是接受治療的患兒年齡太小，還不到3個月大第3頁/共76頁2004年12月27日，英國《柳葉刀》雜志報(bào)道，英國倫敦的醫(yī)生近日用基因療法為嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷兒童進(jìn)行治療獲得成功4位患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的兒童已被基因療法治愈，使利用基因療法治療嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的成功案例增加到了18例第4頁/共76頁

第九章基因治療與反義藥物

第5頁/共76頁第一節(jié)基因治療概論

第6頁/共76頁一、基因治療的概念凡是將新的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移得到某一個體的細(xì)胞內(nèi)，使功能不正常的基因、功能正常的基因但表達(dá)量很低的基因、機(jī)體本身不存在的外源基因得到正常表達(dá)，或者降低、抑制機(jī)體基因的表達(dá)，從而達(dá)到治療的目的，這種治療方法就稱為基因治療第7頁/共76頁基因治療的對象是人體，因此基因治療要求確保有效和安全，其難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的基因工程技術(shù)近些年來，基因治療取得了重大進(jìn)展，研究內(nèi)容也已經(jīng)從單基因的遺傳病擴(kuò)大到多基因的腫瘤、艾滋病、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等方面疾病第8頁/共76頁p532004年１月２０日重組人p５３腺病毒注射液已于獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的準(zhǔn)字號生產(chǎn)批文，從而標(biāo)志著我國也是世界上第一個獲得國家批準(zhǔn)的基因治療藥物業(yè)已正式上市“今又生”是由深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司研制成功的第9頁/共76頁二、基因治療的方法第10頁/共76頁1.基因增補(bǔ)基因增補(bǔ)就是將正常的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞，以補(bǔ)償缺陷基因的功能或調(diào)整細(xì)胞的某些功能基因增補(bǔ)是目前最常用的基因治療方式第11頁/共76頁基因治療實(shí)例

復(fù)合免疫缺陷綜合征的基因治療（人類Gene治療成功例子）ADA缺乏癥-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏。第12頁/共76頁ADA-Gene+vector（逆轉(zhuǎn)錄病毒）

重組分子患者TLyCIL-2刺激C分裂導(dǎo)入細(xì)胞生長分裂

10天

Gene表達(dá)

回輸患兒體內(nèi)

1~2月治療一次,10個月患兒體內(nèi)ADA水平達(dá)正常人的25%

第13頁/共76頁2.基因替換用同源重組或者基因打靶技術(shù)，用正常基因替換整個致病基因，使致病基因得到永久更正這種以正常基因替換致病基因的方法是最為理想的基因治療，但是目前技術(shù)手段，體內(nèi)重組的頻率還太低，只有百萬分之一左右第14頁/共76頁3.基因修復(fù)是指將致病基因的突變堿基在原位進(jìn)行糾正，而正常的部分予以保留這種方法是最理想的基因治療方法，但是目前還沒有成功的報(bào)道，只是一種理論上的理想的方式第15頁/共76頁4.基因失活利用反義技術(shù)將反義寡聚核苷酸或反義RNA導(dǎo)入細(xì)胞，特異性地封閉某些基因的表達(dá)，以達(dá)到抑制有害靶基因的表達(dá)作用，也就是人們通常意義上所說的反義療法引入的反義物質(zhì)，可以通過和基因組DNA結(jié)合，降低或阻止轉(zhuǎn)錄的發(fā)生，也可以通過和mRNA的結(jié)合，阻止或降低蛋白質(zhì)的翻譯，還可以通過核酶降解mRNA許多腫瘤的發(fā)生都涉及多重癌基因及相關(guān)基因的激活并過度表達(dá)，抑制這些基因的表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生逆轉(zhuǎn)第16頁/共76頁5.免疫基因的治療將抗體、抗原、細(xì)胞因子的基因?qū)牖颊叩捏w內(nèi)，改變免疫狀態(tài)，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的第17頁/共76頁黑色素瘤的基因治療腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞——TIL，它積聚腫瘤部位，并在該處持續(xù)存在而無副作用，利用此特點(diǎn)協(xié)助治療腫瘤。第18頁/共76頁細(xì)胞因子基因治療和腫瘤壞死因子基因治療

①IL-2Gene②TNF-Gene

（白介2）

（腫瘤壞死因子）

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入

TIL（體外培養(yǎng)的自體細(xì)胞）回植患者體內(nèi)

TIL進(jìn)入自體腫瘤部位，提高細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。第19頁/共76頁6.自殺基因治療這是一種腫瘤的治療方法，是指向腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入一種基因，基因產(chǎn)物為一種酶，它可以將無細(xì)胞毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為毒性代謝產(chǎn)物，將腫瘤細(xì)胞殺死，又稱為活化前體藥物基因治療，這種基因也就被稱為“自殺基因”第20頁/共76頁“自殺基因”療法第21頁/共76頁“自殺基因”療法第22頁/共76頁“自殺基因”療法第23頁/共76頁“自殺基因”療法第24頁/共76頁7.耐藥基因治療耐藥基因的治療是指為了提高機(jī)體耐受腫瘤化療藥物的能力，將產(chǎn)生抗毒性的基因?qū)肴梭w細(xì)胞如向骨髓干細(xì)胞中導(dǎo)入多藥抗性基因mdr-1，使機(jī)體耐受更大劑量的化療第25頁/共76頁三、基因治療的途徑exvivo(體外途徑）invivo（體內(nèi)途徑）第26頁/共76頁1.exvivo是指將含外源基因的載體外導(dǎo)入到人體自身或異體細(xì)胞（異種細(xì)胞），經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后，輸回人體這種方法簡單，容易操作，而且外源物質(zhì)能被稀釋并清除。但是載體系統(tǒng)不易形成規(guī)模，而且需要專門的臨床基地第27頁/共76頁乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時間長，輕傷、小手術(shù)后常出血不止發(fā)病率為1/30000

我國學(xué)者薛京倫實(shí)施的FⅨ的基因治療第28頁/共76頁逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

+FⅨcDNA

重組體

5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①導(dǎo)入倉鼠細(xì)胞（CHO）→FⅨ表達(dá)；②導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→FⅨ表達(dá)；③91年，導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→回植病人皮下→FⅨ基因表達(dá)，F(xiàn)Ⅸ基表達(dá)水平達(dá)正常人的5%。是我國基因治療成功的例子。第29頁/共76頁2.invivo將外源基因裝配與特定的真核表達(dá)載體，直接導(dǎo)入體內(nèi)載體可以是病毒型的或者非病毒型的，甚至可以是裸露的DNA這種方式比較容易大規(guī)模生產(chǎn)。但是必須保證載體的安全性，而且進(jìn)入人體后，能導(dǎo)入靶細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)達(dá)到治療目的第30頁/共76頁

單純皰疹病毒

哺乳動物細(xì)胞

HSVGene-TK

（在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，正常細(xì)胞中不表達(dá)）Gene—TKGCV（胸苷類似物,丙氧鳥苷）

TdRPpGCV---p

抑制DNA合成脫氧胸苷酸

腫瘤細(xì)胞死亡鄰近細(xì)胞死亡/凋亡（旁觀者效應(yīng)）第31頁/共76頁第二節(jié)基因治療的步驟和問題

第32頁/共76頁一、基因治療的步驟第33頁/共76頁基因治療的步驟分離出具有特定功能的特異性基因獲得足夠量該基因的載體或細(xì)胞建立有效的途徑將外源基因?qū)霗C(jī)體內(nèi)進(jìn)入宿主細(xì)胞的外源基因必須產(chǎn)生足夠量的產(chǎn)物，維持適當(dāng)?shù)臅r間，且不產(chǎn)生有害的副作用第34頁/共76頁二、基因治療中的問題安全性高效的靶向性基因?qū)胪庠椿虮磉_(dá)的可控性治療基因過少倫理學(xué)問題第35頁/共76頁第三節(jié)

疾病的基因治療

第36頁/共76頁一、基因治療與腫瘤

腫瘤的基因治療，根據(jù)作用機(jī)制可以分成兩類調(diào)節(jié)機(jī)體免疫利用正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的差異第37頁/共76頁1.導(dǎo)入細(xì)胞因子基因進(jìn)行治療

許多細(xì)胞因子，如干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子等，都有提高人體免疫力，抑制腫瘤的作用

第38頁/共76頁2.導(dǎo)入MHC的基因治療

主要組織相容性抗原是具有個體特性的抗原系統(tǒng)

每種生物的個體都有復(fù)雜的的組織相容性抗原，一整套這樣的抗原系統(tǒng)就稱為組織相容性系統(tǒng)能引起快速而且強(qiáng)烈的應(yīng)答的抗原系統(tǒng)，就成為主要組織相容性系統(tǒng)（MHS）編碼MHS基因的編碼群就稱為主要組織相容性復(fù)合物第39頁/共76頁MHC表達(dá)的抗原分為I類和II類I類抗原分子的正常功能是提供遞呈抗原腫瘤細(xì)胞上I類抗原的MHC表達(dá)很弱或者不表達(dá)，使機(jī)體免疫應(yīng)答不能發(fā)生

導(dǎo)入MHC的I類抗原基因，可以誘導(dǎo)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的第40頁/共76頁3.導(dǎo)入抑癌基因的基因治療

很多腫瘤細(xì)胞的某些基因異常表達(dá)，被稱為癌基因，當(dāng)他們處于正常狀態(tài)時，就稱為原癌基因機(jī)體正常細(xì)胞存在抑制細(xì)胞異常增殖的基因，即抑癌基因，它們在細(xì)胞周期的調(diào)控和細(xì)胞凋亡中，起著非常重要的作用腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因往往會產(chǎn)生突變、重排或缺失或者表達(dá)異常第41頁/共76頁p53基因P53是1979年被發(fā)現(xiàn)的核內(nèi)蛋白質(zhì)，相對分子量為5.3X104在正常的細(xì)胞中，P53水平很低，當(dāng)射線或其他因素引起DNA損傷時，P53就大量增加，P53可誘發(fā)兩種不同的細(xì)胞結(jié)局，即停止生長或細(xì)胞凋亡第42頁/共76頁p53基因的突變以點(diǎn)突變?yōu)橹?，基因重排和缺失很少見結(jié)腸、肺、膀胱、乳腺、干、食管、卵巢、皮膚等組織中p53基因的突變率非常高p53基因產(chǎn)物是393個P53蛋白將野生型的p53基因?qū)爰?xì)胞進(jìn)行表達(dá)，從而達(dá)到基因治療的目的第43頁/共76頁RB基因RB基因是在1986年分離得到的第一個抑癌基因成視網(wǎng)膜母細(xì)胞（RB）瘤是小而最常見的眼內(nèi)腫瘤之一RB基因位于第13號染色體上，其產(chǎn)物是928個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，為P105RB第44頁/共76頁RB蛋白是一種DNA結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)多種與細(xì)胞周期增值有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，并最終影響細(xì)胞周期的進(jìn)程RB蛋白有磷酸化和非磷酸化兩種形式，非磷酸化狀態(tài)的RB蛋白為活性形式蛋白，具有抑制細(xì)胞增殖的功能成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，30％是缺失了該基因，而有些病變的基因是發(fā)生了點(diǎn)突變第45頁/共76頁乳腺癌、膀胱癌、肺癌等惡性腫瘤中往往也能發(fā)現(xiàn)RB基因的失活可以將野生型的RB基因?qū)氲讲∽兊哪[瘤細(xì)胞中，可以逆轉(zhuǎn)由于RB基因失活引起的癌變第46頁/共76頁除了p53基因、RB基因外，還有WT基因、NF-1、p16基因等抑癌基因第47頁/共76頁4.自殺基因的治療

自殺基因療法的基本思想就是將編碼某種特殊酶的基因?qū)爰?xì)胞，使無毒的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘亩疚铮鸢屑?xì)胞的死亡

對消化系統(tǒng)的腫瘤包括肝、結(jié)直腸、胃、胰癌的治療，都證明了確切的療效第48頁/共76頁自殺基因+病毒載體

轉(zhuǎn)染重組載體

藥物前體無毒Gene→酶→↓

藥物復(fù)合物有毒

細(xì)胞死亡第49頁/共76頁自殺基因的作用機(jī)制尚不完全清楚，有可能是直接細(xì)胞毒性效應(yīng)、旁觀者效應(yīng)、促進(jìn)免疫反應(yīng)等的綜合結(jié)果直接細(xì)胞毒性是指高毒性的藥物直接將腫瘤細(xì)胞殺死在前體藥物存在的情況下，基因改造的腫瘤細(xì)胞能引起未經(jīng)改造細(xì)胞的細(xì)胞毒性和死亡自殺基因／前體藥物促發(fā)的免疫反應(yīng)的原理目前也不分清楚第50頁/共76頁二、基因治療與艾滋病

艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合癥，是由于人免疫缺陷病毒HIV感染，特異性地破壞了免疫細(xì)胞CD4＋，使機(jī)體發(fā)生免疫缺陷，造成機(jī)體發(fā)生腫瘤、機(jī)會性感染的一種致死性疾病HIV病毒是單鏈的RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，其外殼糖蛋白Gp120可以和CD4特異性高親和力結(jié)合，使CD4＋T細(xì)胞減少，并使細(xì)胞因子的分泌功能受阻，引起機(jī)體的免疫缺陷

第51頁/共76頁1.反義核酸

用互補(bǔ)于mRNA的DNA或RNA，在細(xì)胞內(nèi)形成雙鏈分子，阻礙mRNA的剪接、運(yùn)送、翻譯，降低mRNA的穩(wěn)定性，從而影響病毒基因的表達(dá)與復(fù)制。目前需要解決的問題是反義核酸的專一性轉(zhuǎn)移和進(jìn)入靶細(xì)胞之前的降解

第52頁/共76頁2.核酶

核酶是具有催化RNA自我剪切反應(yīng)的核酸，目前報(bào)道的核酶是在培養(yǎng)細(xì)胞上干預(yù)HIV基因的表達(dá)核酶的穩(wěn)定性比較低，生理?xiàng)l件下反應(yīng)緩慢是其用于抗HIV的不足之處，同時針對它在機(jī)體內(nèi)是怎樣被轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后抗RnaseH的能力還需進(jìn)一步研究

第53頁/共76頁3.可溶性CD4分子的表達(dá)

編碼CD4的基因已經(jīng)得到了克隆，并已經(jīng)在真核系統(tǒng)中表達(dá)。將CD4分子的編碼基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入到外周淋巴細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞中得到表達(dá)，表達(dá)出來的CD4分子可以與入侵的HIV病毒包膜蛋白Gp120結(jié)合，競爭性地保護(hù)CD4＋T淋巴細(xì)胞不受或少受感染

第54頁/共76頁4.特異性抗體的誘導(dǎo)

誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗HIV的特異性抗體也是抗HIV治療的一個重要方法，將gp120的基因?qū)肴梭w中表達(dá)，誘導(dǎo)抗包膜蛋白Gp120的體異性抗體，不僅可以誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG，而且可以引發(fā)特異性的細(xì)胞免疫

第55頁/共76頁5.Tat蛋白突變體表達(dá)Tat蛋白在HIV病毒基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中有著極為重要的反式調(diào)控作用，將突變體形式的tat基因?qū)肴梭w后，突變體的大量表達(dá)，競爭性地結(jié)合Tat受體位點(diǎn)，抑制或干擾HIV病毒基因組的正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能

第56頁/共76頁6.艾滋病疫苗第57頁/共76頁第六節(jié)

反義技術(shù)概論

第58頁/共76頁一、反義技術(shù)與反義核酸

反義技術(shù)是指用人工合成或生物合成的核酸分子,抑制、封閉、破壞靶基因的技術(shù)。反義技術(shù)中的核酸分子可以是DNA，RNA或者肽核酸反義技術(shù)中所用的核酸，一般又稱為反義核酸，就是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原理，結(jié)合并調(diào)節(jié)靶基因活性的核酸分子通過反義技術(shù)制備的藥物，就是人們常說的反義藥物

第59頁/共76頁由于反義技術(shù)也是針對基因進(jìn)行的治療，所以反義藥物從某種意義上講，也是屬于基因治療的范疇狹義的基因治療側(cè)重于基因表達(dá)的上調(diào)性，而反義技術(shù)則側(cè)重于基因表達(dá)的下調(diào)性第60頁/共76頁二、反義核酸藥物特點(diǎn)

1）高度特異性反義藥物通過特異的堿基互補(bǔ)配對作用于把RNA或DNA，可以區(qū)分基因結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差異2）高效性反義藥物是直接作用于與核酸或調(diào)控因子，可以在基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上發(fā)揮藥物作用第61頁/共76頁3）最優(yōu)化的藥物設(shè)計(jì)針對靶基因的序列進(jìn)行簡單的、理性化設(shè)計(jì)4）低毒、安全反義藥物還沒有發(fā)現(xiàn)有顯著的毒性，最終都會被代謝掉5）制備簡單核酸的合成容易，可以大規(guī)模生產(chǎn)，成本比較低第62頁/共76頁三、反義技術(shù)的分類1.反義脫氧核苷酸（ODN）又稱反義DNA，通過與mRNA的結(jié)合形成DNA-RNA雜合體，從而影響基因的表達(dá)調(diào)控。由于DNA序列合成儀的廣泛使用，所以O(shè)DN很容易獲得2.反義RNA

反義RNA是與能mRNA序列互補(bǔ)配對形成雙鏈復(fù)合物的RNA片段，影響基因的翻譯

第63頁/共76頁3.核酶核酶存在于生物細(xì)胞中，是一類具有催化活性的RNA分子，具有核酸酶的水解活性，可以特異性地剪切RNA分子4.三鏈形成寡核苷酸（TFO）三鏈形成寡聚核苷酸是指可與雙鏈或單鏈DNA形成三股鏈，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄的寡核苷酸5.肽核酸（PNAS）肽核酸是以肽為骨架的DNA類似物，是用手性不對稱的中性肽鏈骨架置換脫氧核糖磷酸而成第64頁/共76頁四、反義技術(shù)原理和方法

第65頁/共76頁一、反義脫氧核酸天然存在未經(jīng)修飾的磷酸二酯脫氧化核苷酸（PO－ODN）作為反義藥物雖然有和靶RNA發(fā)生特異序列結(jié)合，激活RnaseH的活性，但是在生理?xiàng)l件下，PO-ODN對核酸酶很敏感，易被快速降解，限制了它的實(shí)際使用

第66頁/共76頁1.第一代――硫代寡聚核苷酸（PS-ODN）

以一個硫原子取代了核酸中磷酸的非橋羥基上的氧原子

顯著地提高了化合物在各種環(huán)境中對核酸酶的穩(wěn)定性，而且保留了在交親和性以及對RnaseH的激活活性

第一個獲得美國FDA批準(zhǔn)的反義藥物弗米韋新

第67頁/共76頁1998年，第一個（也是至今為止唯一的一個）反義藥物Vitravene（Fomivirsen）被美國FDA批準(zhǔn)通過這種硫代磷酸酯DNA被注射入玻璃體內(nèi)，以治療由巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus）引起的愛滋病人的視網(wǎng)膜炎Vitravene獲得批準(zhǔn)是參與反義領(lǐng)域的公司的一個里程碑這種藥物滿足了感染者的需要，但是它的用處非常稀少，2001年為ISIS制藥公司（USA）和Novartis公司（Switzerland）帶來了15萬7千美元銷售收入第68頁/共