生物化學(xué)生物信息的傳遞上從DNA到RNA第1頁(yè)/共242頁(yè)3.1RNA的轉(zhuǎn)錄3.2啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始3.3原核生物與真核生物mRNA的特征比較3.4終止與抗終止3.5內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾第2頁(yè)/共242頁(yè)DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過(guò)自主復(fù)制得到永存，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄生成信使RNA、翻譯生成蛋白質(zhì)的過(guò)程來(lái)控制生命現(xiàn)象。第3頁(yè)/共242頁(yè)轉(zhuǎn)錄(transcription)基因表達(dá)翻譯(translation)拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同(U替換T)的RNA單鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的核心步驟；以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子翻譯成氨基酸序列、合成多肽鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的最終目的。第4頁(yè)/共242頁(yè)DNARNAProtein轉(zhuǎn)錄翻譯第5頁(yè)/共242頁(yè)ATGC第6頁(yè)/共242頁(yè)RNA分子來(lái)自DNA。儲(chǔ)存于DNA雙鏈中的遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄酶促反應(yīng)按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則被轉(zhuǎn)化成為單鏈RNA分子。生物體內(nèi)共有3種信使RNA(messengerRNA，mRNA)轉(zhuǎn)移RNA(transferRNA，tRNA)核糖體RNA(ribosomalRNA，rRNA)第7頁(yè)/共242頁(yè)

轉(zhuǎn)錄(transcription):是指以DNA為模板，在依賴(lài)于DNA的

RNA聚和酶催化下，以4中rNTP（ATP、

CTP、GTP和UTP）為原料，合成RNA

的過(guò)程。第8頁(yè)/共242頁(yè)轉(zhuǎn)錄(

transcription

)——生物體以DNA為模板合成RNA的過(guò)程轉(zhuǎn)錄RNADNA

第9頁(yè)/共242頁(yè)在有些病毒中，RNA也可以指導(dǎo)合成RNA。

是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。

以DoubleStrandDNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄模板

(雜交實(shí)驗(yàn)所證實(shí))第10頁(yè)/共242頁(yè)TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶有意義鏈反意義鏈RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成3’3’5’第11頁(yè)/共242頁(yè)第12頁(yè)/共242頁(yè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程第13頁(yè)/共242頁(yè)

有義鏈(sensestrand)[又稱(chēng)編碼鏈codingstrand]:

指不作模板的DNA單鏈

反義鏈(antisensestrand)[又稱(chēng)模板鏈templatesrand]:指作為模板進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄的鏈(60年代以前的表示方法與此相反)

沒(méi)有A＝UG＝C的規(guī)律第14頁(yè)/共242頁(yè)

在依賴(lài)DNA的RNA聚合酶作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄

A＝U、C≡G合成RNA分子轉(zhuǎn)錄合成RNA鏈的方向?yàn)?′→3′，模板單鏈DNA的極性方向?yàn)?′→5′，而非模板單鏈的極性方向與RNA鏈相同，均為5′→3′。（書(shū)寫(xiě)）基因轉(zhuǎn)錄方式為不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄(一條單鏈DNA為模板,RNA

聚合酶的結(jié)合)第15頁(yè)/共242頁(yè)參

與

轉(zhuǎn)

錄

的

物

質(zhì)：原料

:4種NTP

(ATP,UTP,GTP,CTP)

模板

:DNA酶

:RNA聚合酶其他蛋白質(zhì)因子第16頁(yè)/共242頁(yè)不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄兩層含義：（1）在DNA雙鏈分子上，僅一股鏈可轉(zhuǎn)錄（2）模板鏈非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上模板為結(jié)構(gòu)基因（有義鏈、編碼連）為反義鏈（模板鏈）不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄3′3′5′5′（箭頭表示轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物生成方向）第17頁(yè)/共242頁(yè)第18頁(yè)/共242頁(yè)3.1RNA的轉(zhuǎn)錄3.1.1轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程

無(wú)論是原核還是真核細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程都包括:模板識(shí)別、轉(zhuǎn)錄起始、通過(guò)啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄的延伸和終止。第19頁(yè)/共242頁(yè)RNA的轉(zhuǎn)錄包括promotion.elongation.terminaton

三過(guò)程從啟動(dòng)子(promoter)到終止子(terminator)稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄單位(transcriptionunit)(轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn))

原核生物的轉(zhuǎn)錄單位多為polycistroninoperon,真核生物中的

轉(zhuǎn)錄單位多為monocistron,Nooperon

轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)即轉(zhuǎn)錄原點(diǎn)記為＋1，其上游記為負(fù)值，下游記為正值upstreamstartpointdownstream－10＋1＋10第20頁(yè)/共242頁(yè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)第21頁(yè)/共242頁(yè)第22頁(yè)/共242頁(yè)第23頁(yè)/共242頁(yè)第24頁(yè)/共242頁(yè)兩個(gè)相關(guān)概念:＊操縱元(operon):

是原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)完整單元，其中包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、操縱子和啟動(dòng)子ipozyaNolacmRNAAbsenceoflactoseActiveipozya-GalactosidasePermeaseTransacetylasePresenceoflactose

Inactive第25頁(yè)/共242頁(yè)第26頁(yè)/共242頁(yè)第27頁(yè)/共242頁(yè)酶與模板的辯認(rèn)結(jié)合

1、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)——開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)，常標(biāo)以+12、結(jié)合部位——約為7個(gè)堿基長(zhǎng)度，其中心位于上游-10bp處被稱(chēng)為–10區(qū)或Pribnow盒(TATA盒）。該區(qū)具高度保守性，并易解鏈。

3、識(shí)別部位——RNA聚合酶亞基識(shí)別的部位，約含6個(gè)堿基長(zhǎng)度，其中心位于上游-35bp處被稱(chēng)為–35區(qū)。啟動(dòng)序列(原核）啟動(dòng)子（真核）——順式作用元件第28頁(yè)/共242頁(yè)TGTTGACATATAAT3'5'5‘3'DNA編碼鏈模板鏈-35區(qū)-10區(qū)+15‘McGPPP轉(zhuǎn)錄起始部位啟動(dòng)子基因轉(zhuǎn)錄區(qū)RNA產(chǎn)物NH2翻譯開(kāi)始轉(zhuǎn)錄開(kāi)始第29頁(yè)/共242頁(yè)基本過(guò)程

1、轉(zhuǎn)錄起始

原核生物需要依賴(lài)因子辨認(rèn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，被辨認(rèn)的DNA區(qū)段處-35區(qū)特定序列。

真核生物轉(zhuǎn)錄起始也需要RNApol對(duì)起始區(qū)上游DNA序列做辨認(rèn)和結(jié)合，并生成起始復(fù)合物，但其上游DNA序列（統(tǒng)稱(chēng)為順式作用元件）不象原核生物那樣典型。

第30頁(yè)/共242頁(yè)2、延長(zhǎng)

在RNA聚合酶催化下，按53

方向合成5，3-磷酸二酯鍵。酶-DNA-RNA形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。3、終止

原核生物有兩種機(jī)制：（1）依賴(lài)因子（Rhofactor）的轉(zhuǎn)錄終止——可識(shí)別來(lái)自RNA產(chǎn)物的終止信號(hào)，而不是來(lái)自DNA摸板。（2）非依賴(lài)因子的轉(zhuǎn)錄終止——終止子特點(diǎn)是RNA產(chǎn)物具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)（莖-環(huán)結(jié)構(gòu)）和一段富含polyU片段。

真核生物的轉(zhuǎn)錄終止是與轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)的：

第31頁(yè)/共242頁(yè)啟動(dòng)子(promoter)指DNA分子上被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的區(qū)域，它還包括一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結(jié)合位點(diǎn)(頻率、效率)第32頁(yè)/共242頁(yè)

模板識(shí)別階段主要指RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄起始前，啟動(dòng)子附近的DNA雙鍵分開(kāi)形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對(duì)。轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個(gè)核苷酸鍵的產(chǎn)生。

在原核生物中第33頁(yè)/共242頁(yè)通過(guò)啟動(dòng)子階段轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個(gè)核苷酸短鏈此時(shí)RNA聚合酶一直處于啟動(dòng)子區(qū)，新生的RNA鏈與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來(lái)并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開(kāi)始。一旦RNA聚合酶成功地合成9個(gè)以上核苷酸并離開(kāi)啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄就進(jìn)人正常的延伸階段。所以，通過(guò)啟動(dòng)子的時(shí)間代表一個(gè)啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。一般說(shuō)來(lái)，通過(guò)啟動(dòng)子的時(shí)間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高。第34頁(yè)/共242頁(yè)轉(zhuǎn)錄的延伸RNA聚合酶離開(kāi)啟動(dòng)子，沿DNA鏈移動(dòng)并使新生RNA鏈不斷伸長(zhǎng)的過(guò)程在37℃時(shí)，大腸桿菌RNA聚合酶完成該反應(yīng)的速度為每秒40個(gè)核苷酸。RNA聚合酶的移動(dòng)新的單鏈DNA模板新生RNA鏈的3′末端不斷延伸解鏈區(qū)形成RNA-DNA雜合物雙螺旋重新合成第35頁(yè)/共242頁(yè)RNA鏈的延伸圖解3′5′RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動(dòng)方向新生RNA復(fù)鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長(zhǎng)部位第36頁(yè)/共242頁(yè)轉(zhuǎn)錄的終止當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時(shí)，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來(lái)第37頁(yè)/共242頁(yè)

復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板兩股鏈模板鏈（反義鏈）原料dNTPNTP配對(duì)A-T,G-CA-U,G-C聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物半保留DNA三種RNA轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的區(qū)別第38頁(yè)/共242頁(yè)第39頁(yè)/共242頁(yè)

真核生物RNA聚合酶不能直接識(shí)別基因的啟動(dòng)子區(qū)，需要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(輔助蛋白質(zhì))按特定順序結(jié)合于啟動(dòng)子上，RNA聚合酶才能與之相結(jié)合并形成復(fù)雜的前起始復(fù)合物。

轉(zhuǎn)錄和翻譯的速度基本相等，37℃時(shí)，轉(zhuǎn)錄生成mRNA的速度每秒鐘合成14個(gè)密碼子，而蛋白質(zhì)合成的速度大約是每秒鐘15個(gè)氨基酸。第40頁(yè)/共242頁(yè)3.1.2轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分3.1.2.1RNA聚合酶原核和真核生物的RNA在分子組成、種類(lèi)和生化特性上各有特色。不需要任何引物RNA或RNA-DNA雙鏈雜合體不能作為模板雙鏈DNA為模板4種核苷三磷酸作為活性前體Mg2＋/Mn2＋為輔助因子第41頁(yè)/共242頁(yè)一、原核生物的RNApolymerase(E.coli)1、全酶(HoloEnzyme)和核心酶(CoreEnzyme)＋σββ′ααCoreEnzyme

βααβ′σHoloEnzyme第42頁(yè)/共242頁(yè)

原核生物的RNA聚合酶(DDRP)

E.coli的RNA聚合酶是由四種亞基組成的五聚體（2）

起始因子第43頁(yè)/共242頁(yè)

RNA聚合酶全酶及核心酶電泳圖譜第44頁(yè)/共242頁(yè)

(1)全酶（HoloEnzyme）

?用于轉(zhuǎn)錄的起始

?依靠空間結(jié)構(gòu)與DNA模板結(jié)合(σ與核心酶結(jié)合后引起的構(gòu)象變化)

?專(zhuān)一性地與DNA序列(啟動(dòng)子)結(jié)合

?結(jié)合常數(shù)：1014／mol

?半衰期：數(shù)小時(shí)（107／mol1秒以下）

?轉(zhuǎn)錄效率低，速度緩慢（σ的結(jié)合

）第45頁(yè)/共242頁(yè)

（2）核心酶（CoreEnzyme）

?作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過(guò)程（終止）

?依靠靜電引力與DNA模板結(jié)合（蛋白質(zhì)中堿性基團(tuán)與DNA的磷酸根之間）

?非專(zhuān)一性的結(jié)合（與DNA的序列無(wú)關(guān)）

?結(jié)合常數(shù)：1011／mol?半衰期：60秒第46頁(yè)/共242頁(yè)

此外，新發(fā)現(xiàn)的一種ω亞基的功能尚不清楚。2、各亞基的特點(diǎn)和功能

（1）σ

因子

?σ因子可重復(fù)使用

?

修飾RNApol構(gòu)型

?

使HoloEnzyme識(shí)別啟動(dòng)子的SextamaBox(－35區(qū)),

并通過(guò)σ與模板鏈結(jié)合2α

＋βα2ββ′＋σ

α

2β

＋β′α2ββ′σ（3）全酶的組裝過(guò)程第47頁(yè)/共242頁(yè)

?不同的σ因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子

E.coli中有四種σ因子（σ70、σ32、σ54、σ28）枯草桿菌中有11種σ因子

（σ因子的更替對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控）（2）α因子?核心酶的組建因子

?促使RNApol與DNA模板鏈結(jié)合α＋α2α＋β

α2β＋β′

?前端α因子－－使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈

?尾端α因子－－使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈第48頁(yè)/共242頁(yè)

（3）β因子?促進(jìn)RNApol＋NTPRNAelongation?完成NMP之間的磷酸酯鍵的連接

?Editing功能（排斥與模板鏈不互補(bǔ)的堿基）

?與Rho（ρ）因子競(jìng)爭(zhēng)RNA3′－end第49頁(yè)/共242頁(yè)

Esite（elongationsiteRifR）:對(duì)NTP非專(zhuān)一性地結(jié)合（催化作用和Editing功能）

（4）β′因子

?參與RNA非模板鏈（sensestrand）的結(jié)合（充當(dāng)SSB）

?構(gòu)成Holoenzyme后，β因子含有兩個(gè)位點(diǎn)

Isite（initiationsite.Rifs）:

該位點(diǎn)專(zhuān)一性地結(jié)合

ATP或者GTP（需要高濃度的ATP或GTP）第50頁(yè)/共242頁(yè)由于各亞基的功能，使全酶本身含有五個(gè)功能位點(diǎn)

有義DNA鏈結(jié)合位點(diǎn)（

β′亞基提供）

DNA/RNA雜交鏈結(jié)合位點(diǎn)（β亞基提供）雙鏈DNA解鏈位點(diǎn)（前端α亞基提供）單鏈DNA重旋位點(diǎn)（后端α亞基提供）

σ因子作用位點(diǎn)第51頁(yè)/共242頁(yè)E.coliRNApolymerase用于起始和延伸只用于起始36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD第52頁(yè)/共242頁(yè)第53頁(yè)/共242頁(yè)每個(gè)細(xì)胞中約有7000個(gè)RNA聚合酶分子每一時(shí)刻有2000—5000個(gè)酶在執(zhí)行轉(zhuǎn)錄DNA模板的功能σ因子大大增加聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的親和力，并降低酶對(duì)非專(zhuān)一位點(diǎn)的親和力，使酶專(zhuān)一性識(shí)別模板上的啟動(dòng)子第54頁(yè)/共242頁(yè)轉(zhuǎn)錄的起始從化學(xué)過(guò)程來(lái)看是單個(gè)核苷酸與開(kāi)鏈啟動(dòng)子－酶復(fù)合物相結(jié)合構(gòu)成新生RNA的5′端，再以磷酸二酯鍵的形式與第二個(gè)核苷酸相結(jié)合起始的終止反映在σ因子的釋放當(dāng)新生RNA鏈達(dá)到6～9個(gè)核苷酸時(shí)，能形成穩(wěn)定的酶－DNA－RNA三元復(fù)合物，并釋放σ因子，轉(zhuǎn)錄進(jìn)人延伸期第55頁(yè)/共242頁(yè)當(dāng)聚合酶按5′→3′方向延伸RNA鏈時(shí)，解旋的DNA區(qū)域也隨之移動(dòng)。聚合酶可以橫跨約40個(gè)堿基對(duì)，而解旋的DNA區(qū)域大約是17個(gè)堿基對(duì)。自由核苷酸能被聚合酶加到新生的RNA鏈上，并形成DNA-RNA雜合體。隨著聚合酶在模板上的運(yùn)動(dòng)，靠近3′端的DNA不斷解旋，同時(shí)在5′端重新形成DNA雙鏈，將RNA鏈擠出DNA-RNA雜合體。RNA的3′端大約有20～30個(gè)核苷酸與DNA和聚合酶相結(jié)合。第56頁(yè)/共242頁(yè)RNA合成過(guò)程起始雙鏈DNA局部解開(kāi)磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)延長(zhǎng)階段53RNA

啟動(dòng)子（promotor)

終止子(terminator)5RNA聚合酶5353553離開(kāi)第57頁(yè)/共242頁(yè)

二、真核生物的RNApol

1、三種RNApol：

根據(jù)對(duì)

α-鵝膏蕈堿的敏感性不同而分類(lèi)

RNApolⅠ最不敏感（動(dòng)、植、昆）

RNApolⅡ最敏感

RNApolⅢ不同種類(lèi)的敏感性不同

2、位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

RNApolⅠ核仁活性所占比例最大

轉(zhuǎn)錄rRNA（5.8S、18S、28S）第58頁(yè)/共242頁(yè)RNApolⅡ核質(zhì)主要負(fù)責(zé)hnRNA、snRNA的轉(zhuǎn)錄

hnRNA（mRNA前體，核不均一RNAheterogeneousnuclearRNA）

snRNA（核內(nèi)小分子RNAsmallnulearRNA)RNApolⅢ核質(zhì)負(fù)責(zé)tRNA、5SrRNA、Alu序列和部分snRNA

?

目前在線粒體和葉綠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)少數(shù)RNApol（活性較低）第59頁(yè)/共242頁(yè)真核生物線粒體和葉綠體中還存在著不同的RNA聚合酶。線粒體RNA聚合酶只有一條多肽鏈，相對(duì)分子質(zhì)量小于7x104，是已知最小的RNA聚合酶之一，與T7噬菌體RNA聚合酶有同源性葉綠體RNA聚合酶比較大，結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌中的聚合酶相似，由多個(gè)亞基組成，部分亞基由葉綠體基因組編碼第60頁(yè)/共242頁(yè)3、亞基組成：分子量500KDa,含兩個(gè)大亞基和7~12個(gè)小亞基

RNApolⅡ：

?大亞基中有C末端結(jié)構(gòu)域

(carboxyterminaldomainCTD)?CTD中含一保守氨基酸序列的多個(gè)重復(fù)

Tyr－Ser－Pro－Thr－Ser－Pro－SerC端重復(fù)七肽

?不同生物中重復(fù)數(shù)目不一樣（酶活性）第61頁(yè)/共242頁(yè)?CTD中的Ser和Thr可被高度磷酸化

磷酸化的RNApolⅡ被稱(chēng)為ⅡA

非磷酸化的RNApolⅡ稱(chēng)為ⅡB?CTD參與轉(zhuǎn)錄

→

ⅡB→ⅡA

→

使RNApol易于離開(kāi)啟動(dòng)子進(jìn)入延伸過(guò)程（10倍）

第62頁(yè)/共242頁(yè)真核生物中共有3類(lèi)RNA聚合酶，它們?cè)诩?xì)胞核中的位置不同，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的基因不同。真核生物RNA聚合酶一般有8～14個(gè)亞基所組成，相對(duì)分子質(zhì)量超過(guò)5×105。聚合酶中有兩個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量超過(guò)l×105的大亞基；同種生物3類(lèi)聚合酶有"共享"小亞基的傾向，即有幾個(gè)小亞基是其中3類(lèi)或2類(lèi)聚合酶所共有的3類(lèi)聚合酶的亞基種類(lèi)和大小存在兩條普遍遵循的原則第63頁(yè)/共242頁(yè)3.1.2.2轉(zhuǎn)錄復(fù)合物啟動(dòng)子選擇階段RNA聚合酶全酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別聚合酶與啟動(dòng)子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物（closedcomplex）伴隨著DNA構(gòu)象上的重大變化，封閉復(fù)合物轉(zhuǎn)變成開(kāi)放復(fù)合物(opencomplex)第64頁(yè)/共242頁(yè)

開(kāi)放復(fù)合物與最初的兩個(gè)NTP相結(jié)合并在這兩個(gè)核苷酸之間形成磷酸二酯鍵后→(RNA聚合酶、DNA和新生RNA)三元復(fù)合物。強(qiáng)啟動(dòng)子封閉復(fù)合物開(kāi)放復(fù)合物（不可逆的快反應(yīng)）真核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的分子量很大：RNA聚合酶、7種輔助因子（包含多個(gè)亞基）。第65頁(yè)/共242頁(yè)第66頁(yè)/共242頁(yè)三元復(fù)合物可以進(jìn)入兩條不同的反應(yīng)途徑一是合成并釋放2～9個(gè)核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物－－流產(chǎn)式起始;二是盡快釋放σ亞基，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過(guò)上游啟動(dòng)子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物第67頁(yè)/共242頁(yè)轉(zhuǎn)錄的真實(shí)性取決于有特異的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始后按照堿基互補(bǔ)原則準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)錄模板DNA序列及具有特異的終止部位σ因子第68頁(yè)/共242頁(yè)只有帶σ因子的全酶才能專(zhuān)一地與DNA上的啟動(dòng)子結(jié)合，選擇其中一條鏈作為模板，合成均一的產(chǎn)物。σ因子的作用只是起始而已，一旦轉(zhuǎn)錄開(kāi)始，它就脫離了起始復(fù)合物，而由核心酶負(fù)責(zé)RNA鏈的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是啟動(dòng)子的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，而核心酶的作用是鏈的延伸。第69頁(yè)/共242頁(yè)終止信號(hào)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物RNA聚合酶較穩(wěn)定第70頁(yè)/共242頁(yè)3.2啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始大腸桿菌RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用主要包括啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別酶與啟動(dòng)子的結(jié)合σ因子的結(jié)合與解離第71頁(yè)/共242頁(yè)3.2.1啟動(dòng)子（promoter）的結(jié)構(gòu)與功能（Prok.E.coli）

1、啟動(dòng)子由兩個(gè)部分組成

（1）上游部分—CAP-cAMP結(jié)合位點(diǎn)

（基因表達(dá)調(diào)控的正控制位點(diǎn)）

CAP（catabolitegeneActivatorProtein）降解物基因活化蛋白，環(huán)腺苷酸（cAMP）的受體蛋白

（2）下游部分—RNApol的進(jìn)入（結(jié)合）位點(diǎn)

－35~－10

包括識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)（RB位點(diǎn)）第72頁(yè)/共242頁(yè)2、RNA聚合酶的進(jìn)入位點(diǎn)

（1）Sextama框（SextamaBox）

§-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）結(jié)合位點(diǎn)，

§RNA聚合酶依靠其σ亞基識(shí)別該位點(diǎn)

—識(shí)別位點(diǎn)（R位點(diǎn)）

§大多數(shù)啟動(dòng)子中共有序列為T(mén)82T84G78A65C54A45§重要性:很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度

（RNApol的σ因子）

§

位置在不同啟動(dòng)子中略有變動(dòng)第73頁(yè)/共242頁(yè)（2）Pribonow框（PribonowBox）

§-10序列，RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)

結(jié)合位點(diǎn)（B位點(diǎn)）

§一致序列：T80A95T45A60A50T96

（TATPUAT）

§位置范圍－4到－13因此又稱(chēng)TATABox保守T第74頁(yè)/共242頁(yè)啟動(dòng)子的研究：

(RNA聚合酶保護(hù)法)55RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因第75頁(yè)/共242頁(yè)

保守序列（一致性序列）開(kāi)始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35

區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10

區(qū)1-30-5010-10-40-205335第76頁(yè)/共242頁(yè)RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合第77頁(yè)/共242頁(yè)第78頁(yè)/共242頁(yè)（3）起始位點(diǎn)（initiationsite）：＋1位點(diǎn)

RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

起始NTP多為ATP或GTP(嘌呤)

第79頁(yè)/共242頁(yè)起始過(guò)程：

a.全酶與啟動(dòng)子結(jié)合的封閉型啟動(dòng)子復(fù)合物的形成（

R位點(diǎn)被σ因子發(fā)現(xiàn)并結(jié)合）第80頁(yè)/共242頁(yè)

b、開(kāi)放型啟動(dòng)子復(fù)合物的形成

§RNApol的一個(gè)適合位點(diǎn)到達(dá)－10序列區(qū)域，誘導(dǎo)富含A.T的Pribnow框的“熔解”，形成12－17bp的泡狀物，同時(shí)酶分子向－10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合

§開(kāi)放型啟動(dòng)子復(fù)合物使RNApol聚合酶定向

§兩種復(fù)合物均為二元復(fù)合物（全酶和DNA

）第81頁(yè)/共242頁(yè)12～17bp第82頁(yè)/共242頁(yè)

c.在開(kāi)放型的啟動(dòng)子復(fù)合物中，RNApol的I位點(diǎn)和E位點(diǎn)的核苷酸前體間形成第一個(gè)磷酸二酯鍵（

β

亞基）三元復(fù)合物形成

+1位多為CAT模式,位于離開(kāi)保守T6~9個(gè)核苷酸處---6-9bp---GCTATTGACATATAAT-----16-18bp-------+1-35sequence-10sequence（4）σ因子解離→核心酶與DNA的親和力下降起始過(guò)程結(jié)束→核心酶移動(dòng)進(jìn)入延伸過(guò)程第83頁(yè)/共242頁(yè)轉(zhuǎn)錄的起始過(guò)程σ核心酶12～17bp第84頁(yè)/共242頁(yè)（β亞基）第85頁(yè)/共242頁(yè)CAP-cAMP結(jié)合位點(diǎn)（也稱(chēng)CAP位點(diǎn)）

轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，I→阻遏蛋白→負(fù)調(diào)控

lac

操縱子模型第86頁(yè)/共242頁(yè)I第87頁(yè)/共242頁(yè)

許多基因的表達(dá)還存在正調(diào)控機(jī)制

例如:E.coli培養(yǎng)基中乳糖和葡萄糖共存時(shí)→只有葡萄糖被利用原因：CAP位點(diǎn)的正調(diào)控

?葡萄糖缺少時(shí)，腺苷酸環(huán)化酶將ATP→cAMP，

cAMP與CAP位點(diǎn)結(jié)合,此時(shí)啟動(dòng)子的進(jìn)入位點(diǎn)才能與RNApol結(jié)合

?葡萄糖存在時(shí)，cAMP不能形成，沒(méi)有CAP－cAMP

與CAP位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)子的RNApol進(jìn)入位點(diǎn)不能結(jié)合RNApol

第88頁(yè)/共242頁(yè)

因此,一個(gè)操縱元中有兩道控制開(kāi)關(guān),只有同時(shí)打開(kāi),結(jié)構(gòu)基因才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。（對(duì)lac操縱元而言，只有沒(méi)有葡萄糖，有乳糖時(shí)才能進(jìn)行錄）（1）CAP位點(diǎn)的組成（－70～－40）

位點(diǎn)Ⅰ：－70～－50

包括一個(gè)IR序列

強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)

位點(diǎn)Ⅱ：－50～－40

弱結(jié)合位點(diǎn)位點(diǎn)Ⅰ對(duì)位點(diǎn)Ⅱ具有協(xié)同效應(yīng)（cooperativity）第89頁(yè)/共242頁(yè)第90頁(yè)/共242頁(yè)（2）位點(diǎn)Ⅱ結(jié)合CAP－cAMP復(fù)合物后，促使RNApol進(jìn)入

SextamaBox,最終與－10序列結(jié)合起始轉(zhuǎn)錄

原因：CAP－cAMP復(fù)合物與位點(diǎn)Ⅱ結(jié)合→SextamaBox富含G.C區(qū)域（G.C島區(qū)）穩(wěn)定性降低→

PribnowBox的溶解溫度降低→促進(jìn)開(kāi)放型啟動(dòng)子復(fù)合物的形成→促進(jìn)轉(zhuǎn)錄第91頁(yè)/共242頁(yè)第92頁(yè)/共242頁(yè)4、RNApol在DNA上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定

DNase法----------40bp

而足跡法（footprinting）結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確

足跡法原理：

?限制酶切割結(jié)合有RNApol的DNA→大分子DNA?末端標(biāo)記該DNA（Klenow片段標(biāo)記3′,堿性磷酸酯酶標(biāo)記5′）

?用內(nèi)切酶降解DNA（控制反應(yīng)條件）

?凝膠電泳分離，放射自顯影觀察第93頁(yè)/共242頁(yè)第94頁(yè)/共242頁(yè)第95頁(yè)/共242頁(yè)第96頁(yè)/共242頁(yè)限制酶切分離大片段DNA第97頁(yè)/共242頁(yè)末端標(biāo)記大分子DNA重新結(jié)合RNApol

作對(duì)照直接用DNase進(jìn)行降解電泳用微量DNase降解電泳第98頁(yè)/共242頁(yè)第99頁(yè)/共242頁(yè)

?用足跡法鑒定出來(lái)的RNApol與DNA的結(jié)合區(qū)域?yàn)?/p>

+20~－50（－40），大約60~70bp?實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)……………..實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)DNA的兩條鏈?zhǔn)躌NApol的保護(hù)程度不同，說(shuō)明RNApol與兩條鏈的結(jié)合是不對(duì)稱(chēng)的，表明轉(zhuǎn)錄只需要一條模板，即單鏈轉(zhuǎn)錄第100頁(yè)/共242頁(yè)

RNA聚合酶保護(hù)法第101頁(yè)/共242頁(yè)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205335原核生物啟動(dòng)子保守序列55RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因33第102頁(yè)/共242頁(yè)

第103頁(yè)/共242頁(yè)

原核生物啟動(dòng)子

－35區(qū)：一致性序列為T(mén)TGACA

是RNA-pol的辨認(rèn)位點(diǎn)

－10區(qū)：一致性序列為T(mén)ATAAT

又叫Pribnow盒 是RNA-pol的結(jié)合位點(diǎn)第104頁(yè)/共242頁(yè)

真核生物啟動(dòng)子第105頁(yè)/共242頁(yè)5、啟動(dòng)子各位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系

（1）－35序列與－10序列與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系

標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子－35TTGACA

－10TATAAT

不同的啟動(dòng)子

a.與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子序列同源性越高→啟動(dòng)強(qiáng)度越大b.與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子同源性越低→啟動(dòng)強(qiáng)度越小

c.與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子差異很大時(shí)→由另一種σ因子啟動(dòng)第106頁(yè)/共242頁(yè)原因:?－35序列通過(guò)被σ因子識(shí)別的容易→決定啟動(dòng)子強(qiáng)度

?－10序列影響開(kāi)放型啟動(dòng)子復(fù)合物形成的速度→決定啟動(dòng)子強(qiáng)度?啟動(dòng)子上升突變、啟動(dòng)子下降突變第107頁(yè)/共242頁(yè)

（2）－35序列與－10序列的間隔區(qū)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系◆堿基序列并不重要◆間距非常重要，17bp的間距轉(zhuǎn)錄效率最高◆間距上的突變種類(lèi)：間距趨向于17bp→

上升突變間距遠(yuǎn)離17bp→下降突變第108頁(yè)/共242頁(yè)E.Coli各σ識(shí)別的啟動(dòng)子的序列第109頁(yè)/共242頁(yè)由含70RNA多聚酶全酶識(shí)別的典型大腸桿菌啟動(dòng)子第110頁(yè)/共242頁(yè)3.2.2啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別在啟動(dòng)子區(qū)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶上的某些基團(tuán)是氫鍵供體，而4種堿基中的某些基團(tuán)是氫鍵受體。由于它們分別處于DNA雙螺旋的大溝或小溝內(nèi)，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有處于特定空間構(gòu)象的氫鍵受體與供體，當(dāng)它們與啟動(dòng)子中對(duì)應(yīng)的分子在一定距離內(nèi)互補(bǔ)時(shí)，就形成氫鍵，相互結(jié)合。RNA聚合酶不直接識(shí)別堿基對(duì)本身，是通過(guò)氫鍵互補(bǔ)的方式識(shí)別啟動(dòng)子的第111頁(yè)/共242頁(yè)3.2.3酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合在RNA聚合酶與啟動(dòng)子相互作用的過(guò)程中，聚合酶首先與啟動(dòng)子區(qū)閉合雙鏈DNA相結(jié)合，形成二元閉合復(fù)合物，然后經(jīng)過(guò)解鏈得到二元開(kāi)鏈復(fù)合物。解鏈區(qū)一般在-9～+13之間，而酶與啟動(dòng)子結(jié)合的主要區(qū)域在其上游。第112頁(yè)/共242頁(yè)一旦開(kāi)鏈區(qū)解鏈，酶分子能以正確的取向與解鏈后的有關(guān)單鏈相互作用，形成開(kāi)鏈復(fù)合物。因此，RNA聚合酶既是雙鏈DNA結(jié)合蛋白，又是單鏈DNA結(jié)合蛋白。DNA開(kāi)鏈?zhǔn)前凑誅NA模板序列正確引入核苷酸底物的必要條件。第113頁(yè)/共242頁(yè)第114頁(yè)/共242頁(yè)3.2.4-10區(qū)和-35區(qū)的最佳間距在原核生物中，-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離大約是16～19bp保持啟動(dòng)子這二段序列以及它們之間的距離都是重要的，否則就會(huì)改變它所控制基因的表達(dá)水平。小于15bp或大于20bp都會(huì)降低啟動(dòng)子的活性第115頁(yè)/共242頁(yè)因?yàn)樵鰷pbp，-35區(qū)相對(duì)于-10區(qū)旋轉(zhuǎn)（增減一個(gè)bp會(huì)使兩者之間的夾角發(fā)生36°的變化）所產(chǎn)生的超螺旋會(huì)發(fā)生改變。若要使酶與DNA在這個(gè)區(qū)域內(nèi)保持正確的取向，就必須使二者之一發(fā)生扭曲，需要增加結(jié)合自由能。

第116頁(yè)/共242頁(yè)細(xì)菌中常見(jiàn)兩種啟動(dòng)子突變下降突變(downmutation)上升突變(upmutation)如果把Pribnow區(qū)從TATAAT變成AATAAT就會(huì)大大降低其結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平;增加Pribnow區(qū)共同序列的同一性。例如，在乳糖操縱子的啟動(dòng)子中，將其Pribnow區(qū)從TATGTT變成TATATT，就會(huì)提高啟動(dòng)子的效率，提高乳糖操縱子基因的轉(zhuǎn)錄水平。

第117頁(yè)/共242頁(yè)3.2.5增強(qiáng)子及其功能增強(qiáng)子的發(fā)現(xiàn)從SV40開(kāi)始，在SV40的轉(zhuǎn)錄單元上發(fā)現(xiàn)它的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約200bp處有兩段72bp長(zhǎng)的重復(fù)序列，它們不是啟動(dòng)子的一部分，但能增強(qiáng)或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始，除去這兩段序列會(huì)………….若保留其中一段或?qū)⒅〕霾逯罝NA分子的任何部位，就能……第118頁(yè)/共242頁(yè)這種能強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄起始的序列為增強(qiáng)子或強(qiáng)化子(enhancer)。后來(lái)在許多基因的啟動(dòng)區(qū)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子的存在。第119頁(yè)/共242頁(yè)把β-珠蛋白基因置于帶有上述72bp序列的DNA分子上，發(fā)現(xiàn)它在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平提高了200倍。而且，無(wú)論把這段72bp序列放在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游1400bp或下游3300bp處，它都有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)作用。增強(qiáng)子通過(guò)影響染色質(zhì)DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并改變超螺旋而改變模板的整體結(jié)構(gòu)，使得RNA聚合酶更容易與模板DNA相結(jié)合，起動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。

第120頁(yè)/共242頁(yè)3.2.6真核生物啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響啟動(dòng)子是確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列。1979年，美國(guó)科學(xué)家Goldberg首先注意到真核生物中，由RNA聚合酶II催化轉(zhuǎn)錄的DNA序列5′上游區(qū)有一段與原核生物Pribnow區(qū)相似的富含TA的保守序列。由于該序列前4個(gè)堿基為T(mén)ATA，所以又稱(chēng)為T(mén)ATA區(qū)(TATAbox)。

第121頁(yè)/共242頁(yè)此后10多年間，科學(xué)家通過(guò)對(duì)許多基因啟動(dòng)子區(qū)的分析，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)功能蛋白基因的啟動(dòng)子都具有共同的結(jié)構(gòu)模式。簡(jiǎn)單地說(shuō)，真核基因的啟動(dòng)子在-25～-35區(qū)含有TATA序列，在-70～-80區(qū)含有CCAAT序列(CAATbox)，在-80～-110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列(GCbox)。TATA區(qū)上游的保守序列稱(chēng)為上游啟動(dòng)子元件(upstreampromoterelement，UPE)或稱(chēng)上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)。第122頁(yè)/共242頁(yè)第123頁(yè)/共242頁(yè)原核和真核基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游區(qū)的結(jié)構(gòu)存在很大的差別。原核基因啟動(dòng)區(qū)范圍較小，TATAAT(Pribnow區(qū))的中心位于-10，上游只有TTGACA區(qū)(-35區(qū))作為RNA聚合酶的主要結(jié)合位點(diǎn)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控;真核基因的調(diào)控區(qū)較大，TATAA/TA區(qū)位于-20～-30，而-40～-110區(qū)為上游激活區(qū)。真核基因除了含有可與原核基因啟動(dòng)子相對(duì)應(yīng)的CAAT區(qū)（－70～78區(qū)）之外，大多數(shù)基因還擁有GC區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)。第124頁(yè)/共242頁(yè)TATA區(qū)和其他兩個(gè)UPE區(qū)的作用有所不同。主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始，如果除去TATA區(qū)或進(jìn)行堿基突變，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物下降的相對(duì)值不如CAAT區(qū)或GC區(qū)突變后明顯，但發(fā)現(xiàn)所獲得的RNA產(chǎn)物起始點(diǎn)不固定CAAT區(qū)或GC區(qū)是決定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)率高低的第125頁(yè)/共242頁(yè)CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點(diǎn)的確定。CAAT區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)錄起始頻率的影響最大，該區(qū)任一堿基的改變都將極大地影響靶基因的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，而啟動(dòng)區(qū)其他序列中一兩個(gè)堿基的置換則沒(méi)有太大的影響。在TATA區(qū)和相鄰的UPE區(qū)之間插入核苷酸也會(huì)使轉(zhuǎn)錄減弱。第126頁(yè)/共242頁(yè)盡管這3種啟動(dòng)子區(qū)序列都有著重要功能，但并不是每個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)都包含這3種序列。有些基因，如SV40的早期基因，缺少TATA和CAAT區(qū)，只有6個(gè)串聯(lián)在上游-40～-110位點(diǎn)的GC區(qū);有些基因，如組蛋白H2B，不含GC區(qū)，但有兩個(gè)CAAT區(qū)，一個(gè)TATA區(qū)。第127頁(yè)/共242頁(yè)真核細(xì)胞中存在著大量特異性或組成型表達(dá)的、能夠與不同基因啟動(dòng)子區(qū)UPE相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子?；蜣D(zhuǎn)錄實(shí)際上是RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動(dòng)子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結(jié)果。第128頁(yè)/共242頁(yè)

一、真核生物的RNApol

1、三種RNApol：

根據(jù)對(duì)

α-鵝膏蕈堿的敏感性不同而分類(lèi)

RNApolⅠ最不敏感（動(dòng)、植、昆）

RNApolⅡ最敏感

RNApolⅢ不同種類(lèi)的敏感性不同

2、位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

RNApolⅠ核仁活性所占比例最大

轉(zhuǎn)錄rRNA（5.8S、18S、28S）第129頁(yè)/共242頁(yè)RNApolⅡ核質(zhì)主要負(fù)責(zé)hnRNA、snRNA的轉(zhuǎn)錄

hnRNA（mRNA前體，核不均一RNAheterogeneousnuclearRNA）

snRNA（核內(nèi)小分子RNAsmallnulearRNA)RNApolⅢ核質(zhì)負(fù)責(zé)tRNA、5SrRNA、Alu序列和部分snRNA

?

目前在線粒體和葉綠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)少數(shù)RNApol（活性較低）第130頁(yè)/共242頁(yè)3、亞基組成：分子量500KDa,含兩個(gè)大亞基和7~12個(gè)小亞基

RNApolⅡ：

?大亞基中有C末端結(jié)構(gòu)域

(carboxyterminaldomainCTD)?CTD中含一保守氨基酸序列的多個(gè)重復(fù)

Tyr－Ser－Pro－Thr－Ser－Pro－SerC端重復(fù)七肽

?不同生物中重復(fù)數(shù)目不一樣（酶活性）第131頁(yè)/共242頁(yè)?CTD中的Ser和Thr可被高度磷酸化

磷酸化的RNApolⅡ被稱(chēng)為ⅡA

非磷酸化的RNApolⅡ稱(chēng)為ⅡB?CTD參與轉(zhuǎn)錄

→

ⅡB→ⅡA

→

使RNApol易于離開(kāi)啟動(dòng)子進(jìn)入延伸過(guò)程（10倍）

二、真核生物的啟動(dòng)子

三種RNApol→三種轉(zhuǎn)錄方式三種啟動(dòng)子→三類(lèi)基因，Ⅰ類(lèi)Ⅱ類(lèi)Ⅲ類(lèi)第132頁(yè)/共242頁(yè)

1、RNApolⅡ的啟動(dòng)子

?結(jié)構(gòu)最復(fù)雜

?位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游,有多個(gè)短序列元件組成

?通用型啟動(dòng)子（無(wú)組織特異性）（1）帽子位點(diǎn)（capsite）：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

與Prok.的“CAT模式”相似

（2）TATA框（Hogness框或Goldberg-Hogness框）

?

位于－30處

?一致序列為T(mén)82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）第133頁(yè)/共242頁(yè)?定位轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的功能（類(lèi)似原核的Pribnow框）

?TATA是絕大多數(shù)真核基因的正確表達(dá)所必需的（3）CAAT框（CAATbox）

?位于－75bp處?一致序列為GGC/TCAATCT?前兩個(gè)G

的作用十分重要(轉(zhuǎn)錄效率)?增強(qiáng)啟動(dòng)子的效率、頻率，不影響啟動(dòng)子的特異性（距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離，正反方向）

?以上三個(gè)保守序列在絕大多數(shù)啟動(dòng)子中都存在第134頁(yè)/共242頁(yè)

（4）增強(qiáng)子（enhancer）（又稱(chēng)遠(yuǎn)上游序列farupstreamsequence）

?在－100以上

?SV40的兩個(gè)正向重復(fù)研究得最清楚（DR）

-107~178、－179~－250各72bp?該增強(qiáng)子的特點(diǎn)如下：

?對(duì)依賴(lài)于TATA框的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)效應(yīng)高于不依賴(lài)的情況第135頁(yè)/共242頁(yè)

?距離效應(yīng):離72bp越近的容易起始轉(zhuǎn)錄?轉(zhuǎn)錄方向離開(kāi)72bp的起始序列優(yōu)先轉(zhuǎn)錄?細(xì)胞類(lèi)型的選擇：不同類(lèi)型中作用有差異

表明其作用具有細(xì)胞或組織特異性（調(diào)節(jié)蛋白）（5）GC框（GCbox）

?位于－90附近，較常見(jiàn)的成分

?核心序列為GGGCGG?可有多個(gè)拷貝，也可以正反兩方向排列第136頁(yè)/共242頁(yè)（6）其他元件

?八聚核苷酸元件（octamerelementOCT元件）一致序列為ATTTGCAT?KB元件一致序列為GGGACTTTCC?ATF元件一致序列為GTGACGT?還有一些位于起始點(diǎn)下游的相關(guān)元件（7）不同元件的組合情況不同元件的數(shù)目、位置、和排列方向均有差異

例如：SV40的早期啟動(dòng)子中有6個(gè)GC框第137頁(yè)/共242頁(yè)小結(jié)：★不同啟動(dòng)子中每種元件與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離不同★不同啟動(dòng)子中的相應(yīng)元件互相交換,形成的雜交啟動(dòng)子功能沒(méi)有變化★各種元件將相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合到啟動(dòng)子上，組成起始復(fù)合物，蛋白因子間的相互作用決定了轉(zhuǎn)錄的起始第138頁(yè)/共242頁(yè)

2、RNApolⅢ啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)

（1）分為三類(lèi)，每種識(shí)別方式不同

a、下游啟動(dòng)子（內(nèi)部啟動(dòng)子）位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游

5SRNA和tRNA基因可分為兩類(lèi)

b、上游啟動(dòng)子

snRNA第139頁(yè)/共242頁(yè)（2）內(nèi)部啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)

最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾的5SrRNA基因

試驗(yàn)設(shè)置：

★非洲爪蟾的卵母細(xì)胞提取液作為體外轉(zhuǎn)錄體系，進(jìn)行缺失試驗(yàn)★以不同長(zhǎng)度的5SrRNA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行轉(zhuǎn)錄

結(jié)果：

★缺失＋55以前和缺失＋80以后的序列都能正常轉(zhuǎn)錄★缺失＋55到＋80序列不能轉(zhuǎn)錄第140頁(yè)/共242頁(yè)

結(jié)論：

★5SrRNA基因的啟動(dòng)子位于基因內(nèi)部★該啟動(dòng)子可使RNApolⅢ在其上游的55bp處起始轉(zhuǎn)錄（3）內(nèi)部啟動(dòng)子分為兩類(lèi)均含兩個(gè)短序列元件，中間由其他序列隔開(kāi)

第一類(lèi)：含A框和C框（5SrRNA基因）第二類(lèi)：含A框和B框（tRNA基因、VARNA基因）間隔序列長(zhǎng)短差異很大

?其中內(nèi)部啟動(dòng)子起被RNApolⅢ識(shí)別的作用第141頁(yè)/共242頁(yè)第142頁(yè)/共242頁(yè)第143頁(yè)/共242頁(yè)三、真核生物的轉(zhuǎn)錄過(guò)程

（一）轉(zhuǎn)錄起始真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，RNA-pol不直接結(jié)合模板，其起始過(guò)程比原核生物復(fù)雜。第144頁(yè)/共242頁(yè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)TATA盒CAAT盒GC盒

增強(qiáng)子順式作用元件(cis-actingelement)1.

轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段AATAAA切離加尾轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)修飾點(diǎn)外顯子翻譯起始點(diǎn)內(nèi)含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體第145頁(yè)/共242頁(yè)2.

轉(zhuǎn)錄因子能直接或間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱(chēng)為反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄因子(trans-criptionalfactors,TF)。第146頁(yè)/共242頁(yè)參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ

轉(zhuǎn)錄因子亞基和(或)分子量（kDa）功能TFⅡDTBP，38結(jié)合TATA盒TAF輔助TBP-DNA結(jié)合TFⅡA12，19，35穩(wěn)定ⅡD-DNA復(fù)合物TFⅡB33促進(jìn)RNA-polⅡ結(jié)合TFⅡF30，74解螺旋酶TFⅡE57()，34(β)ATPaseTFⅡH蛋白激酶，使CTD磷酸化第147頁(yè)/共242頁(yè)3.轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiationcomplex,PIC)真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。第148頁(yè)/共242頁(yè)TBPTAF

TFIIH第149頁(yè)/共242頁(yè)4.拼板理論(piecingtheory)一個(gè)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成有活性和專(zhuān)一性的復(fù)合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對(duì)性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。第150頁(yè)/共242頁(yè)（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。RNA-pol前移處處都遇上核小體。轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。第151頁(yè)/共242頁(yè)RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小體轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)中的核小體移位轉(zhuǎn)錄方向第152頁(yè)/共242頁(yè)——和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)5’------AAUAAA-5’------AAUAAA--Poly(A)mRNA核酸酶-GUGUGUGAATAAAGTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)5’5’3’3’RNA-pol（三）轉(zhuǎn)錄終止第153頁(yè)/共242頁(yè)3.3原核生物與真核生物mRNA的特征比較mRNA在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)占總RNA的2%左右(tRNA占16%，而rRNA則占80%以上)。直到20世紀(jì)70年代初才首次將這一重要物質(zhì)從細(xì)胞中分離出來(lái)。第154頁(yè)/共242頁(yè)現(xiàn)已清楚，許多基因的mRNA在體內(nèi)還是相當(dāng)穩(wěn)定的，半衰期從幾個(gè)小時(shí)到幾天不等。目前，人們己能從幾乎所有生物體內(nèi)分離純化編碼任何蛋白質(zhì)的mRNA。第155頁(yè)/共242頁(yè)mRNA在所有細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行著相同的功能，即通過(guò)密碼三聯(lián)子翻譯生成蛋白質(zhì)，但其生物合成的具體過(guò)程和成熟mRNA的結(jié)構(gòu)在原核和真核細(xì)胞內(nèi)是不同的。真核細(xì)胞mRNA最大特點(diǎn)在于它往往以一個(gè)較大相對(duì)分子質(zhì)量的前體RNA出現(xiàn)在核內(nèi)，只有成熟的、相對(duì)分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)化學(xué)修飾的mRNA才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)參與蛋白質(zhì)的合成。真核細(xì)胞mRNA的合成和功能表達(dá)發(fā)生在不同的空間和時(shí)間范疇內(nèi)第156頁(yè)/共242頁(yè)原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個(gè)細(xì)胞空間里，而且這兩個(gè)過(guò)程幾乎是同步進(jìn)行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開(kāi)始轉(zhuǎn)錄時(shí)就被引發(fā)一個(gè)原核細(xì)胞的mRNA(包括病毒)有時(shí)可以編碼幾個(gè)多肽，而一個(gè)真核細(xì)胞的mRNA最多只能編碼一個(gè)多肽原核生物常以AUG作為起始密碼子，有時(shí)GUG或UUG也作為起始密碼子；真核生物幾乎永遠(yuǎn)以AUG作為起始密碼子第157頁(yè)/共242頁(yè)3.3.1原核生物mRNA的特征

細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯是緊密相聯(lián)的，基因轉(zhuǎn)錄一旦開(kāi)始，核糖體就結(jié)合到新生mRNA鏈的5′端，啟動(dòng)蛋白質(zhì)合成，而此時(shí)該mRNA的3′端還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有轉(zhuǎn)錄完全。在電子顯微鏡下，我們可以看到一連串核糖體緊緊跟在RNA聚合酶后面。1.原核生物mRNA的半衰期短第158頁(yè)/共242頁(yè)絕大多數(shù)細(xì)菌mRNA的半衰期很短，mRNA的降解緊隨著蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程發(fā)生。轉(zhuǎn)錄開(kāi)始1min后，降解就開(kāi)始了，當(dāng)一個(gè)mRNA的5′端開(kāi)始降解時(shí)，其3′端部分仍在合成或被翻譯。mRNA降解的速度大概是轉(zhuǎn)錄或翻譯速度的一半。第159頁(yè)/共242頁(yè)因?yàn)榛蜣D(zhuǎn)錄和多鏈肽延伸的速度基本相同，所以細(xì)胞內(nèi)某一基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的多少?zèng)Q定于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始效率，以大腸桿菌色氨酸合成酶基因?yàn)槔骄糠昼娂s有15次轉(zhuǎn)錄起始，這些mRNA鏈從生成到降解平均被翻譯10次，所以，穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞中每分鐘生成150個(gè)多肽。我們所討論的mRNA的半衰期只是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的平均值。

第160頁(yè)/共242頁(yè)

細(xì)菌mRNA可以同時(shí)編碼不同的蛋白質(zhì)。編碼多個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA為多順?lè)醋觤RNA。多順?lè)醋觤RNA是一組相鄰基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這一組基因被稱(chēng)為一個(gè)操縱子。單順?lè)醋觤RNA為只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA。2、許多原核生物mRNA以多順?lè)醋拥男问酱嬖诘?61頁(yè)/共242頁(yè)所有mRNA都被分成3部分:編碼區(qū)、位于AUG之前的5′端上游非編碼區(qū)以