乳酸菌生料固態(tài)發(fā)酵豆粕工藝的優(yōu)化何勇錦;羅振達(dá);戴紫燕;謝君銓;楊藝敏【摘要】Inthispapertheauthorscreenedthebacteria]strainssuitableforsolidstatefermentationofsoybeanmealandoptimizedthefermentationconditionstoprepareforfermentationexpansionoffeedingactivesmallpeptides.TheresultsshowedthatLactobacillusKLDS-1hadthebestdegradationeffectonsoybeanmeal.Theoptimumconditionswereexactlyasfollows:watercontentoffermentationmaterials50%,concentrateofmolasses3%,inoculumsizeofLactobacillusKLDS-135%.anaerobicfermentationtime48h,thesmallpeptidescontentofsoybeanmealproteincouldreach26.12%,whichwas22.81%morethanthatundertheconditionsbeforefermented.%為給飼用活性小肽的發(fā)酵生成擴(kuò)大化做準(zhǔn)備，對適用于固體發(fā)酵降解豆粕粉的菌種進(jìn)行了篩選,并對其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化.結(jié)果表明:乳酸短桿菌KLDS-1降解豆粕粉能力效果最好.其最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵坯含水量50%、糖蜜3%、接種量35%,經(jīng)生料厭氧發(fā)酵48h,發(fā)酵樣品中的小肽含量達(dá)26.12%,比發(fā)酵前提高了22.81%.【期刊名稱】《貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)》【年(卷)，期】2012(040)010【總頁數(shù)】4頁(P151-153,156)【關(guān)鍵詞】乳酸菌;豆粕;固態(tài)發(fā)酵技術(shù);小分子肽【作者】何勇錦;羅振達(dá);戴紫燕;謝君銓;楊藝敏【作者單位】福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院福建南安362332;福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院福建南安362332;福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院福建南安362332;福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院福建南安362332;福建龍海市角美中學(xué)福建龍海363107【正文語種】中文【中圖分類】S816.34豆粕作為優(yōu)質(zhì)的植物飼料蛋白源，在畜牧行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。但豆粕中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量較大，存在蛋白質(zhì)消化率和生物學(xué)效價(jià)低等問題［1］，限制了其在飼料中的推廣。在飼用肽飼料開發(fā)研究中，利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)新型綠色蛋白肽已受到人們的關(guān)注°JankowskiJ［2］等在仔火雞日糧中添加發(fā)酵豆粕發(fā)現(xiàn)，添加發(fā)酵豆粕組試仔火雞的增重效果提高，且改善了胃腸道功能。FengJ［3］等報(bào)道，在肉雞日糧中添加發(fā)酵豆粕后，提高了肉雞腸道的消化酶活性，優(yōu)化了腸壁結(jié)構(gòu)。此外，發(fā)酵豆粕還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力［4-6］、促進(jìn)微量元素吸收［7］、調(diào)整機(jī)體環(huán)境微生態(tài)平衡等多種生物學(xué)功能。微生物生料固態(tài)發(fā)酵技術(shù)是指發(fā)酵基質(zhì)不經(jīng)過高溫滅菌，而直接通過優(yōu)良的微生物生長時(shí)分泌豐富的酶系降解大分子植物蛋白，使其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，并生成了具有生物活性的寡肽和小肽物質(zhì)。與其他制備方法［8-10］相比，微生物生料發(fā)酵技術(shù)具有操作簡便、條件溫和、降低成本等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。筆者利用一株經(jīng)篩選得到適宜生料發(fā)酵降解豆粕蛋白的菌株，對其生料發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為飼用活性小肽的發(fā)酵生成擴(kuò)大化做準(zhǔn)備。1.1.1菌株乳酸短桿菌KLDS-1、乳酸長桿菌KLDS-2、乳酸鏈球菌KLDS-3和乳酸鏈球菌KLDS-4，由閩南科技學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)系微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、篩選并保存。1.1.2培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基。1.2.1發(fā)酵菌株的確定取粉碎后的豆粕，將培養(yǎng)的4株菌種發(fā)酵劑和一定量的廢糖蜜混勻，發(fā)酵坯含水率調(diào)節(jié)至50%，裝入?yún)捬醮?，置?7°C恒溫培養(yǎng)48h，測定發(fā)酵樣品的小肽含量，以未發(fā)酵的豆粕粉測定小肽含量為對照組。1.2.2菌株生長曲線的繪制將10mL種子液接入新鮮的MRS培養(yǎng)基中，在37C的條件下培養(yǎng)乳酸菌，每隔1h取樣。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)作圖，繪制乳酸菌的生長曲線。1.2.3生料厭氧發(fā)酵豆粕粉工藝的優(yōu)化將確定的乳酸菌菌株作為出發(fā)菌株，培養(yǎng)茁壯的菌種發(fā)酵劑，與0.5%的硫酸銨和發(fā)酵基質(zhì)充分混勻制備發(fā)酵坯。探討豆粕粉預(yù)處理、發(fā)酵周期、碳源種類、碳源濃度、發(fā)酵坯含水量、夕卜加水量對乳酸菌降解能力的影響，通過對單因素的優(yōu)化確定最佳降解工藝。1.2.4發(fā)酵產(chǎn)物含量的測定1)粗蛋白。采用微量凱氏定氮法測定得樣品的總氮量。粗蛋白質(zhì)含量(%)=6.25x總氮量2)小分子肽。將發(fā)酵樣品與蒸餾水按1:3(m/v)的比例稀釋，充分溶解，4C離心10min(5000r/min)，取上清液，加等量的80%(pH8.0)的乙醇沉淀2h，再離心10min(5000r/min)，取一定量上清液采用雙縮脲法測定小分子肽含量。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)，采用SPSS16.0和SAS軟件進(jìn)行單因素方差分析。從圖1可知，乳酸短桿菌KLDS-1厭氧發(fā)酵48h后，發(fā)酵產(chǎn)物中的小肽含量比對照組提高了16.28%，降解能力最強(qiáng)，乳酸長桿菌KLDS-2次之，乳酸鏈球菌KLDS-4最低。因此，筆者選擇乳酸短桿菌KLDS-1為發(fā)酵菌株。從圖2可知，乳酸短桿菌KLDS-1在MRS培養(yǎng)基上生長，約12h進(jìn)入平衡期，18h進(jìn)入衰退期。由圖3可知，乳酸短桿菌KLDS-1經(jīng)生料厭氧發(fā)酵和熟料厭氧發(fā)酵后，產(chǎn)物中的小肽含量分別比對照組增加了18.21%和11.7%，說明，生料發(fā)酵降解效果比熟料發(fā)酵降解更明顯，可能豆粕粉經(jīng)滅菌后破壞了植物蛋白結(jié)構(gòu)，不利于乳酸短桿菌KLDS-1的發(fā)酵。此外，對產(chǎn)物中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，基本上都是乳酸短桿菌KLDS-1菌株的細(xì)胞形態(tài)。說明，生料發(fā)酵的整個(gè)過程無其他雜菌參與降解。微生物發(fā)酵利用碳源物質(zhì)具有選擇性。從圖4可得出，不同碳源對乳酸短桿菌KLDS-1降解豆粕粉的能力有較大差異，其中，糖蜜作為碳源效果最好，小肽含量達(dá)21.81%，麩皮次之，達(dá)21.6%，淀粉作為碳源降解效果最差。這可能是因?yàn)樘敲壑泻胸S富的糖類、氨基酸、維生素等成分，可以促進(jìn)乳酸短桿菌KLDS-1的降解。方差分析表明，碳源種類對乳酸短桿菌KLDS-1發(fā)酵降解的影響極顯著(P=0<0.01)o由圖5可知，乳酸短桿菌KLDS-1隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。48h后，小肽含量基本處于平穩(wěn)，可能是因?yàn)槿樗岫虠U菌KLDS-1經(jīng)發(fā)酵后進(jìn)入衰退期以及產(chǎn)酶代謝受阻，導(dǎo)致降解效果受到影響。方差分析表明，發(fā)酵周期對乳酸短桿菌KLDS-1發(fā)酵降解的影響顯著(P=0.018<0.05)。由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)中分別添加濃度超過3%的糖蜜時(shí)，乳酸短桿菌KLDS-1的降解能力都較強(qiáng)，發(fā)酵坯產(chǎn)物的小肽含量都能達(dá)20%以上；糖蜜濃度在3%時(shí)，降解能力最強(qiáng)。發(fā)酵坯中糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)高低影響了發(fā)酵坯中的C/N不合理或其他營養(yǎng)成分不均衡，致使乳酸短桿菌KLDS-1對豆粕粉中植物蛋白的降解率降低。方差分析表明，碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳酸短桿菌KLDS-1發(fā)酵性能的影響顯著(P=0.037<0.05)。由圖5可知，當(dāng)接種量為35%時(shí)，乳酸短桿菌KLDS-1對豆粕粉中蛋白質(zhì)的降解能力最強(qiáng)，小肽含量達(dá)23.75%。方差分析表明，接種量對乳酸短桿菌KLDS-1發(fā)酵降解的影響極顯著(P=0<0.01)。由圖5可知，含水量為50%的發(fā)酵坯的微生物降解能力最理想，小肽含量可達(dá)26.12%。發(fā)酵坯含水量的高低直接影響了發(fā)酵底物的性質(zhì)和水活度的分布，導(dǎo)致微生物生長受阻和發(fā)酵降解能力降低。方差分析表明，發(fā)酵坯含水量對乳酸短桿菌KLDS-1發(fā)酵性能的影響極顯著(P=0v0.01)。通過對4株乳酸菌的篩選，最終確定以乳酸短桿菌KLDS-1為發(fā)酵出發(fā)菌株。將培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵劑與豆粕粉充分混勻，保證每個(gè)顆粒都接上菌種。豆粕粉經(jīng)乳酸短桿菌KLDS-1生料厭氧發(fā)酵過程中，乳酸短桿菌KLDS-1大量繁殖生長并分泌豐富的酶系，將分子量大的植物蛋白降解為具有活性小分子肽物質(zhì)。此外，豆粕通過發(fā)酵還含有大量的益生菌、乳酸等生物活性物質(zhì)。筆者對乳酸短桿菌KLDS-1發(fā)酵豆粕降解工藝研究，得出最佳的生料厭氧發(fā)酵條件為發(fā)酵坯含水量50%、糖蜜3%、接種量35%、發(fā)酵周期48h，發(fā)酵樣品中的小肽含量達(dá)26.12%，比發(fā)酵前提高了22.81%?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】[1]KjonesC,DeroucheyJM,NelssenJN,etal.Effectsoffermentedsoybeanmealandspecialtyanimalproteinsourcesonnurserypigperformance[J].J.Anim.Sci.,2010,88:1725-1732.[2]JankowskiJ,JuskiewiczJ,GulewiczK,etal.Theeffectofdietscontainingsoybeanmeal,soybenproteinconcentrate,andsoybeanproteinisolateofdifferentoligosaccharidecontentongrowthperformanceandgutfunctionofyoungturkeys[J].Poult.Sci.,2009,88:2132-2140.[3]FengJ,LiuX,XuRZ,etal.EffectsofFermentedSoybeanMealonDigestiveEnzymeActivitiesandIntestinalMorphologyinBriolers[J].Poult,Sci.,2007,86:1149-1154.[4]SubnamoyP,RaymondJ.StLegerLousiaP.Wa.FungalpeptideDestruxnAplaysaspecificroleinsuppressingtheinnateimmuneresponeinDrosophilaMelanogaster[J].TheJournalbiologicalchemistry,2007,282(12):8969-8977.[5]BaurhooN,BaurhooB,ZhaoX.Effectsofexogenousenzymesincorn-basedandCanadianpeaRlmilletbaseddietswithreducedsoybeanmealongrowthperformance,intesinalnutrientdigestibility,villusdevelopment,andselectedmicrobialpopulationsinbroilerchickens[J].J.Anim.Sci.,2011.89:4100-4108.[6]BakerKM,SreinHH.Aminoaciddigestibilityandconcentrationofdigestibleandmetabolizableenergyinsoybeanmealproducedfromconbentional,highprotein,orlow-oligossharidevarietiesofsoybeansandfedtogrowingpigs[J].J.Anim.Sci.,2009,87:2282-2290.[7]HeartProtectstudycollaborativegroup.N-TerminalPro-B-typenatriureticpeptide,vasculardiseaserisk,andcholesterolreductionamong20536patientsintheMRC/BHFHeartprotectionstudy[J].L.Am.Coll.Cardiol,2007,49:311-319.[8]DeisyYC,DonghaiW,ScottB.Pretreatmentandenzymatichydrolysisoflignocellulosicbiomass[M].ProQuest,2008.[9]GoebelKP,SteinHH.Phosphorusdigestibilityandenergyconcentrationofenzyme-treatedandconv