生物合成13的課件資料第1頁(yè)/共46頁(yè)

復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板DNA雙鏈DNA的一條鏈原料dNTP(N=A、G、C、T)NTP(N=A、G、C、U)引物需要不需要酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物DNARNA配對(duì)A-T、G-CA-U、T-A、G-C轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的區(qū)別第2頁(yè)/共46頁(yè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（startpoint）。將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)標(biāo)記為+1轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（terminationsite）也叫終止子（terminator）。5′-端上游（upstream）序列，

3′-端下游（downstream）序列，啟動(dòng)子（promoter）：能夠被RNA聚合酶識(shí)別并與之結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與否及轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的一段DNA序列稱為啟動(dòng)子。

全部原核生物基因及絕大部分真核生物基因的啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游序列中，只有真核生物RNA聚合酶III的啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游序列中。轉(zhuǎn)錄單位(transcriptionunit)：從啟動(dòng)子到終止子之間的DNA片段，稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位?；蛘吒_切地說(shuō)，被轉(zhuǎn)錄成單個(gè)RNA分子的一段DNA序列，稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。第3頁(yè)/共46頁(yè)第4頁(yè)/共46頁(yè)

基因是指負(fù)責(zé)編碼一條多肽鏈的DNA片段。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，有的基因只轉(zhuǎn)錄成RNA（如tRNA或rRNA）而不編碼多肽鏈，所以，基因的確切定義應(yīng)是：被轉(zhuǎn)錄成RNA的DNA片段。將負(fù)責(zé)編碼蛋白質(zhì)多肽鏈的DNA片段稱為結(jié)構(gòu)基因（structuralgene）。一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位可以是單個(gè)基因——單順?lè)醋樱╩onocistron），也可以是多個(gè)基因——多順?lè)醋樱╬olycistron）。

第5頁(yè)/共46頁(yè)第一節(jié)轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)①以DNA為模板合成RNA

細(xì)胞內(nèi)RNA的生物合成過(guò)程是一個(gè)酶促反應(yīng)過(guò)程，參與該過(guò)程的酶是RNA聚合酶（RNApolymerase）。

該酶以雙鏈DNA中的一條鏈（或單鏈DNA）為模板，按照A與U（或T與A）、G與C配對(duì)的原則，將4種核糖核苷酸（NTP）以3′,5′-磷酸二酯鍵的方式聚合起來(lái)，催化合成與模板互補(bǔ)的RNA。第6頁(yè)/共46頁(yè)

②DNA雙鏈中只有一條鏈被轉(zhuǎn)錄成RNA

在DNA雙鏈中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄合成RNA的DNA鏈叫模板鏈（templatestrand），另一條鏈叫編碼鏈（codingstrand）。模板鏈與編碼鏈互補(bǔ)，模板鏈轉(zhuǎn)錄合成的RNA的堿基順序與編碼鏈的堿基順序完全一致，只是其中的T被U取代而已。③轉(zhuǎn)錄的方向?yàn)?′→3′第7頁(yè)/共46頁(yè)DNA模板:5’5’mRNADNA模板鏈、有意義鏈編碼鏈、反意義鏈3’3’模板鏈、有意義鏈編碼鏈、反意義鏈啟動(dòng)子mRNA終止子轉(zhuǎn)錄單位5’5’轉(zhuǎn)錄單位單順?lè)醋樱ㄒ粋€(gè)轉(zhuǎn)錄單位含一個(gè)基因，如真核生物）多順?lè)醋樱ㄒ粋€(gè)轉(zhuǎn)錄單位含多個(gè)基因，如原核生物）第8頁(yè)/共46頁(yè)第二節(jié)原核生物基因的轉(zhuǎn)錄

一、原核生物RNA聚合酶

大腸桿菌RNA聚合酶

（α2ββ′σ）是由4種5個(gè)亞基組成的全酶，分子量大約為500000。σ的結(jié)合不牢固，它可以隨時(shí)從全酶上脫落下來(lái)，剩余的部分稱為核心酶（α2ββ′）

。β亞基的功能主要是結(jié)合底物三磷酸核苷NTP；β′亞基的功能是與DNA模板結(jié)合；σ亞基的功能是識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子；α亞基與啟動(dòng)子上游元件和活化因子結(jié)合。另外，在全酶中還存在一個(gè)功能尚不清楚的ω因子。第9頁(yè)/共46頁(yè)RNA聚合酶（DDRP）:EcoliRNA聚合酶由5個(gè)亞基組成：α2β

β’δααββ’δδααββ’全酶核心酶第10頁(yè)/共46頁(yè)亞基基因分子量數(shù)目組分可能的功能αrpoA400002核心酶酶的連接，裝配βrpoB1550001核心酶與底物（核苷酸）結(jié)合β′rpoC1600001核心酶與模板結(jié)合ω100001核心酶不詳σrpoD700001σ因子與啟動(dòng)子結(jié)合，識(shí)別模板鏈大腸桿菌RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)與功能第11頁(yè)/共46頁(yè)

①在基因的5′端，直接與RNA聚合酶結(jié)合，控制轉(zhuǎn)錄的起始和方向；②都含有RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)和起始位點(diǎn)；③都含有保守序列，而且這些序列的位置是固定的，如-35序列，-10序列等。-35bp存在一段保守序列（共有序列）TTGACA，RNA聚合酶的σ亞基識(shí)別該序列并使核心酶與啟動(dòng)子結(jié)合，故又稱-35序列，為RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)；二、原核生物基因啟動(dòng)子第12頁(yè)/共46頁(yè)

-10序列又叫Pribnow盒（Pribnowbox），其共有序列為TATAAT，是RNA聚合酶與之牢固結(jié)合并將DNA雙鏈打開(kāi)的部位，即結(jié)合位點(diǎn)，形成所謂的開(kāi)放性啟動(dòng)子復(fù)合物。第13頁(yè)/共46頁(yè)

啟動(dòng)子的強(qiáng)弱與-35序列和-10序列密切相關(guān)，特別是-35序列。另外兩個(gè)序列之間的距離也可能是影響啟動(dòng)子強(qiáng)度的因素之一。17bp時(shí)，轉(zhuǎn)錄效率最高。天然啟動(dòng)子中，這一段距離大多為16~19bp。色氨酸阿拉伯糖乳糖蛋白第14頁(yè)/共46頁(yè)三、原核生物的轉(zhuǎn)錄過(guò)程

模板的識(shí)別：在σ亞基的幫助下，RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合到啟動(dòng)子上。

轉(zhuǎn)錄的起始：σ亞基識(shí)別-35序列并與核心酶一起結(jié)合在啟動(dòng)子上。當(dāng)形成第一個(gè)磷酸二酯鍵后，σ亞基即由全酶中解離出來(lái)，由核心酶繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

全酶的作用是選擇起始部位并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，核心酶的作用是延長(zhǎng)RNA鏈。解離出來(lái)的σ亞基可與另一個(gè)核心酶結(jié)合并啟動(dòng)另一次轉(zhuǎn)錄。絕大多數(shù)新合成的RNA鏈5′-末端是pppA或pppG，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄的起始核苷酸是三磷酸腺苷或三磷酸鳥(niǎo)苷。并且證明轉(zhuǎn)錄不需要引物，這一點(diǎn)與復(fù)制不同。

第15頁(yè)/共46頁(yè)以DNA為模板，催化2個(gè)游離的NTP形成3’，5’-磷酸二酯鍵。催化RNA鏈的延長(zhǎng)反應(yīng)。第16頁(yè)/共46頁(yè)RNA鏈的延伸：當(dāng)?shù)谝粋€(gè)磷酸二酯鍵生成并釋出σ亞基后，核心酶即沿DNA模板移動(dòng)，并按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，以與第一個(gè)磷酸二酯鍵生成的相同反應(yīng)方式，依次連接上核苷酸，使RNA鏈延伸。核心酶沿DNA模板移動(dòng)的方向則為3′→5′，因?yàn)槟０彐溑c新生成的RNA鏈?zhǔn)欠雌叫械摹?/p>

轉(zhuǎn)錄泡（transcriptionbubble），在轉(zhuǎn)錄泡里，新合成的RNA與模板DNA形成雜交雙鏈，長(zhǎng)約12bp。在轉(zhuǎn)錄泡里，核心酶始終與DNA的編碼鏈結(jié)合，使雙鏈DNA約有17bp被解開(kāi)。第17頁(yè)/共46頁(yè)第18頁(yè)/共46頁(yè)

由于RNA聚合酶沒(méi)有核酸外切酶活性，它不能校對(duì)新合成的RNA鏈，所以轉(zhuǎn)錄的誤差比復(fù)制的大很多（約10萬(wàn)倍）。由于一個(gè)細(xì)胞中要合成一個(gè)基因的很多轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因而可以耐受較大的誤差。

RNA聚合酶第19頁(yè)/共46頁(yè)

轉(zhuǎn)錄的終止：主要過(guò)程包括：停止RNA鏈延長(zhǎng)；新生成RNA鏈釋放；RNA聚合酶從DNA上釋放。當(dāng)RNA聚合酶沿DNA模板移動(dòng)到終止子序列時(shí)，轉(zhuǎn)錄就停止了。原核生物基因轉(zhuǎn)錄終止的方式有兩種：不依賴于ρ因子的終止和依賴于ρ因子的終止。

ρ因子又叫終止因子（terminationfactor），是從大腸桿菌中分離出來(lái)的一種275000大小的六聚體蛋白質(zhì)，它具有兩種活性：促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止的活性和NTPase活性。后者是前者所必需的。第20頁(yè)/共46頁(yè)（1）在不依賴于ρ因子的終止方式中有一段富含GC的序列，此GC區(qū)呈雙折疊對(duì)稱，即回文結(jié)構(gòu)（palindromestructure）；在終點(diǎn)前有一系列U核苷酸，可能提供信號(hào)使RNA聚合酶脫離模板。第21頁(yè)/共46頁(yè)

（2）依賴ρ因子的終止方式，必需在ρ因子存在時(shí)才發(fā)生終止作用，依賴ρ因子的終止子序列富含堿基C，但缺乏堿基G，其回文結(jié)構(gòu)不含富有CG區(qū)，也沒(méi)有寡聚U。依賴ρ因子的終止子在細(xì)菌染色體中少見(jiàn)，而在噬菌體中廣泛存在（p465）。

ρ因子可能是先附著在新生成的RNA鏈上，然后沿著5′→3′方向朝RNA聚合酶移動(dòng)，移動(dòng)的能量由ATP水解供應(yīng)。當(dāng)ρ因子與RNA聚合酶接觸后，將新生成的RNA鏈釋放出來(lái)。第22頁(yè)/共46頁(yè)第23頁(yè)/共46頁(yè)δO15432OHOCH2A

HPOOOHOPHOOOHPOOOHO15432OHOHCH2C

HPOOHOOPHOOOHPOOOHHDNA模板TGARNA聚合酶5’第24頁(yè)/共46頁(yè)四、原核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工

在原核生物中，rRNA包括三種，即16S，23S和5SrRNA。在大腸桿菌中，這三種rRNA的基因形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，其中還包含一個(gè)或多個(gè)tRNA基因，它們之間由間隔區(qū)分開(kāi)。

rRNA的加工：是以核糖體顆粒的形式進(jìn)行的，即rRNA前體合成后先與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成新生核糖體顆粒，而后再經(jīng)過(guò)一系列的切割tRNA等加工過(guò)程，生成有功能的核糖體。第25頁(yè)/共46頁(yè)rRNA前體的加工第26頁(yè)/共46頁(yè)tRNA前體的加工：

tRNA的種類比rRNA多，在原核生物中有30~40種，在真核生物中有50~60種。關(guān)于tRNA3′-末端-CCA的來(lái)源問(wèn)題，在原核生物tRNA生物合成中有兩種情況，一種是初始轉(zhuǎn)錄物自身就有-CCA，它們位于成熟tRNA序列與3′端附加序列之間，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工切除掉附加序列，-CCA便暴露出來(lái)；第二種則是其自身并無(wú)-CCA序列，它是在切除3′端附加序列后，由tRNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶（nucleotidyltransferase）催化，并由CTP與ATP供給胞苷?；c腺苷酰基聚合而成的。此外，tRNA中含有大量修飾成分，還要通過(guò)各種不同的修飾酶進(jìn)行修飾，才能成為成熟的tRNA分子。第27頁(yè)/共46頁(yè)第28頁(yè)/共46頁(yè)mRNA前體的加工

細(xì)菌中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的mRNA大多不需要加工，一經(jīng)轉(zhuǎn)錄即可直接進(jìn)行翻譯。但也有少數(shù)多順?lè)醋觤RNA需通過(guò)核酸內(nèi)切酶切成較小的單位，然后再進(jìn)行翻譯。第29頁(yè)/共46頁(yè)第三節(jié)真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程

一、真核生物RNA聚合酶

真核細(xì)胞RNA聚合酶依據(jù)對(duì)α-鵝膏蕈堿（α-amanitine）的敏感性不同分為3種：即RNA聚合酶I，Ⅱ和Ⅲ。RNA聚合酶I（核仁），合成5.8SrRNA，18SrRNA

和28SrRNA。RNA聚合酶Ⅱ（核質(zhì)），合成mRNA和核小分子RNA。RNA聚合酶Ⅲ（核質(zhì)），合成tRNA和5SrRNA等。第30頁(yè)/共46頁(yè)二、真核啟動(dòng)子真核生物的3種RNA聚合酶各有其自己的啟動(dòng)子，這里主要介紹RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：其堿基大多為A（指編碼鏈）。

TATA框（TATAbox），其共有序列為：TATAAAA，一般位于-10附近，基本上由AT堿基對(duì)所組成，只有很少啟動(dòng)子中有GC堿基對(duì)的存在。

CAAT框（CAATbox），其共有序列為GCCAATCT，一般位于-75附近。雖然此序列名為CAAT框，但其中G的重要性并不亞于CAAT部分。第31頁(yè)/共46頁(yè)

增強(qiáng)子（enhancer），又稱遠(yuǎn)上游序列（farupstreamsequence），一般都在-100以上。增強(qiáng)子的作用主要包括，對(duì)依賴和不依賴于TATA框的轉(zhuǎn)錄都有增強(qiáng)效應(yīng)，但對(duì)依賴TATA框增強(qiáng)效應(yīng)高；距離效應(yīng)，離72bp重復(fù)序列近的容易起始轉(zhuǎn)錄；極性效應(yīng)，轉(zhuǎn)錄方向背向72bp重復(fù)序列的起始序列優(yōu)先轉(zhuǎn)錄，而朝向72bp重復(fù)序列的則效率差；不嚴(yán)格的細(xì)胞特異性，即不同細(xì)胞類型增強(qiáng)作用不一樣。第32頁(yè)/共46頁(yè)三、真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程

起始:

不清楚，RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始涉及眾多的蛋白因子，稱為通用轉(zhuǎn)錄因子（generaltranscriptionalfactor，GTF）參與轉(zhuǎn)錄的起始。它們?cè)谵D(zhuǎn)錄起始過(guò)程中，相繼結(jié)合到啟動(dòng)子上，形成開(kāi)放的起始復(fù)合物。目前知道的不少于6種。例如，首先是TFIID，［它包含了TATA結(jié)合蛋白（TATAboxbindingprotein，TBP）和多種TBP相關(guān)因子（TATAboxassociatedfactor,TAF）。含有不同TAF的TFIID可以識(shí)別和結(jié)合不同的啟動(dòng)子],然后TFIIF可以與RNA聚合酶結(jié)合。TFIIB既可以結(jié)合TBP，又能引進(jìn)TFIIF-RNA聚合酶II復(fù)合物。TFIID也可以與聚合酶的C端結(jié)構(gòu)域作用，使其定位于轉(zhuǎn)錄的起始位置，最后在RNA聚合酶II幫助下，TFIIE又將TFIIH引進(jìn)到結(jié)合位點(diǎn)，TFIIH具有ATP酶、解螺旋酶和激酶的活性，可以催化RNA聚合酶II最大亞基的羧基端磷酸化，使轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物發(fā)生變構(gòu)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。第33頁(yè)/共46頁(yè)第34頁(yè)/共46頁(yè)

延伸：RNA合成的速度大約為每秒30~50個(gè)核苷酸，但鏈的延伸并非以恒定速度進(jìn)行，有時(shí)會(huì)降低速度或延遲，這是延伸階段的重要特點(diǎn)，其原因尚不清楚。（人們發(fā)現(xiàn)在通過(guò)一個(gè)富含G?C對(duì)的模板以后約8~10個(gè)堿基，則會(huì)出現(xiàn)一次延遲。如果在突變體中G?C→A?T則減少延遲。如果在連續(xù)的G?C對(duì)之間只有一個(gè)A?T對(duì)，把這個(gè)A?T變?yōu)镚?C則會(huì)再現(xiàn)強(qiáng)烈的延遲作用。這種延遲作用可能對(duì)RNA鏈的終止和釋放有關(guān)）。終止:

對(duì)于真核生物轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)和機(jī)制了解很少，其主要困難在于很難確定初始轉(zhuǎn)錄物的3′-末端，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，轉(zhuǎn)錄后就很快進(jìn)行加工，無(wú)論是mRNA、tRNA，還是rRNA都是如此。研究發(fā)現(xiàn)病毒SV40（猿猴空泡病毒40）的終止點(diǎn)很像大腸桿菌不依賴ρ因子的終止子，有一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，末端有一長(zhǎng)序列U。第35頁(yè)/共46頁(yè)

四、真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工

真核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，稱為斷裂基因，編碼序列中間隔著插入序列，因此必須對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的初級(jí)產(chǎn)物進(jìn)行加工和修飾才能使之成為有功能的成熟的mRNA。真核基因中編碼的序列，稱為外顯子（exon）；而不表達(dá)的序列，稱為內(nèi)含子（intron）。初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中包括了內(nèi)含子和外顯子，稱為核內(nèi)不均一RNA，hnRNA（heterogeneousnuclearRNA）。它比加工后成熟的mRNA大好幾倍。第36頁(yè)/共46頁(yè)hnRNA加工過(guò)程：

首先對(duì)其首、尾進(jìn)行修飾，即在其5′-末端加上“帽”（m7G5′pppNmpNp-）結(jié)構(gòu)，在其3′-末端加上一個(gè)50~200個(gè)A的多聚腺苷酸(polyA)的“尾巴”，然后由相應(yīng)的酶剪去內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分，再將其余的外顯子轉(zhuǎn)錄的部分連接起來(lái)；其次還要經(jīng)過(guò)甲基化等修飾過(guò)程，才能變?yōu)橛泄δ艿膍RNA分子。第37頁(yè)/共46頁(yè)

（1）mRNA“首、尾”的修飾真核細(xì)胞mRNA的5′-末端“帽”的結(jié)構(gòu)有三種：帽O(jiān)型:N7–甲基鳥(niǎo)苷三磷酸，符號(hào)為m7GpppX，單細(xì)胞真核生物如酵母，只具有帽O(jiān)；帽1型:X核苷酸2′-OH上也被甲基化，符號(hào)為

m7GpppXm，真核生物的主要帽形式；帽2型:Y核苷酸2′-OH位上再甲基化，符號(hào)為

m7GpppXmpYm，一般只占有帽mRNA的

10%~15%以下。

“帽”的功能還不十分清楚，可能與核蛋白體的識(shí)別、起始翻譯和穩(wěn)定mRNA有關(guān)。第38頁(yè)/共46頁(yè)第39頁(yè)/共46頁(yè)

3′-末端多聚（A）尾（poly（A））：真核mRNA含有Poly(A）。RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（RNAterminalriboadenylatetransferase）催化加尾過(guò)程。

poly（A）的功能：可能增加mRNA的穩(wěn)定性。

第40頁(yè)/共46頁(yè)（2）真核mRNA的剪接在真核細(xì)胞中，絕大部分基因被不同大小的內(nèi)含子相互間隔開(kāi)，內(nèi)含子在RNA的轉(zhuǎn)錄后加工中要除去，然后把外顯子連接起來(lái)，才能形成成熟的RNA分子。這是所有真核RNA在轉(zhuǎn)錄后加工中必須進(jìn)行的一個(gè)重要步驟。這一過(guò)程稱為RNA的剪接（splicing）。剪接是在核中進(jìn)行的，由剪接復(fù)合體（spliceosome）催化，復(fù)合體含有核酸內(nèi)切酶與連接酶活性。內(nèi)含子上游與下游各有一個(gè)剪接位點(diǎn)，分別稱為5′剪接點(diǎn)（GT）